豬源沙門氏桿菌分離與鑒定

尉玉杰

摘要：從豬的糞便中分離出引起仔豬副傷寒的病原菌，對該病原菌的菌落特征和生化特點進行了鑒定分析，并對該病原菌進行了體外抑菌試驗，結果顯示該種致病菌對頭孢塞芬、頭孢唑啉敏感性最強，抑菌圈分別是18、25mm，在豬源沙門氏菌防治中，應該選擇上述2種抗生素進行對癥治療，這樣才能提高治療效果。

關鍵詞：豬源沙門氏菌;分離鑒定;體外抑菌試驗

中圖分類號：S852.61

文獻標識碼：B

doi：10.3969/j.issn.2096-3637.2019.24.005

0引言

沙門氏菌在自然界中廣泛分布，是牲畜體內的一種常在菌群，廣泛存在于豬牛羊的腸道中，通常沙門氏菌不會表現出明顯的致病能力，只有當動物身體抵抗能力下降、胃腸道中的有益菌群失衡時，沙門氏菌才會表現出致病能力，導致豬出現典型的臨床癥狀。

1材料與方法

1.1材料選取

本次研究所采集到的病例主要來源于某中小規模養殖場養殖的患病豬。在無菌條件下，直腸深部采集患病豬的新鮮糞便裝人到無菌保存袋后，帶回試驗室保存，在4C環境下等待使用。本次研究中所使用的培養基主要包括黃綠磺胺培養基、普通營養培養基、三糖鐵培養基、明膠液化培養基和檸檬酸鹽培養劑。上述幾種培養基按照相應的配置方法嚴格制作。試驗中使用的試劑主要包括結晶紫、盧格氏碘液、番紅染色液、甲基紅指示劑。

1.2方法

1.2.1細菌分離培養

將采集到的糞便制作成涂片后，選擇使用革蘭氏染色劑對涂片進行充分染色，結合染色結果判定是否為沙門氏菌，再決定是否需要進行細菌分離培養。在細菌分離培養中，先進行增菌培養，培養一段時間后，將增菌液劃線接種到分離培養基上，然后挑取可疑菌落進行革蘭氏染色鏡檢，如果是紅色短棒桿菌[1]，需要進行進一步純化培養，重復上述步驟，直到顯微鏡檢查的致病菌形態一致為止。

1.2.2細菌形態鑒定

首先，革蘭氏染色。將采集到的病料，涂抹在載玻片上，使用結晶紫對涂片進行充分染色，染色時間控制在1min。染色結束后用水小心沖洗，然后進行媒染，向涂片滴加革蘭氏碘液，作用1min后，用清水將碘液去除，再將載玻片傾斜，向其中連續滴加95%的乙醇，脫色20～25s，直到流出的液體無色為止，然后使用清水立即清洗干凈[2]。選擇使用番紅復染，將染好的涂片放置在空氣中晾干或者使用吸水紙吸干;顯微鏡檢查。從培養基上選擇典型形態的單個致病菌菌落，小心挑取致病菌，制成涂片后進行革蘭氏染色，然后放置在顯微鏡下觀察，致病菌被革蘭氏染.成紫色表示革蘭氏陽性染色，若染成紅色表示為革蘭氏陰性染色。

1.2.3致病菌生化鑒定

將革蘭氏陰性染色的桿菌進行各種發酵糖發酵試驗，再進行進一步的生化鑒定。生化試驗主要選擇過氧化氫試驗、檸檬酸鹽試驗、產硫化氫試驗、明膠液化試驗、乙酰甲基醇試驗、苯丙氨酸試驗。結合最終試驗結果確定相應的細菌種類。

1.2.4藥敏試驗

選擇使用紙片擴散法，將培養好的致病菌涂布在培養皿上，將各種藥名紙片做好標記后，放置在培養皿中，持續培養24h后，觀察抑菌圈大小，用抑菌圈的大小表示該種抗生素對致病菌的敏感程度。

2結果

2.1致病菌形態

致病菌能在黃綠磺胺培養基上生長，生長出圓形、表面濕潤光滑、邊緣整齊、淡黃色透明的致病菌菌落，菌落中央突起。同時，在細菌培養中發現培養基顏色由紅色逐漸變成淡黃色。進一步鏡檢可以發現致病菌呈桿狀，兩端呈橢圓形，革蘭氏陰性染色。進一步分離培養，發現分離出的沙門氏菌菌落直徑為0.5～1.5mm，中央凸起，圓形，邊緣整齊，呈淡黃色，濕潤光滑，細菌有鞭毛能運動，沒有芽孢，沒有夾膜[3]。

2.2生化鑒定

對從患病豬糞便中分離出來的致病菌進行生化鑒定，發現該種致病菌過氧化氫酶試驗為陽性，檸檬酸鹽試驗、產硫化氫試驗、明膠液化試驗、乙酰甲基醇試驗、苯丙氨酸試驗全部為陰性。結合上述致病菌培養的形態特征和生化鑒定，結果可以判定分離出來的細菌屬于沙門氏菌屬。將分離出來的致病菌進行進一步的糖發酵試驗，結果顯示分離得到的致病菌能發酵葡萄糖、甘露醇、山梨醇、阿拉伯糖、麥芽糖，不能發酵乳糖和蔗糖，結合常見細菌系統鑒定手冊，對該細菌種類進行鑒定，可知分離得到的沙門氏菌屬于甲型副傷寒沙門氏菌。

2.3藥敏試驗

將分離得到的致病菌分別與頭孢唑林、頭孢塞酚、萬古霉素、紅霉素、氯霉素、青霉素、四環素、苯唑西林、甲氧氟啶、諾氟沙星進行紙片擴散法藥敏試驗。在藥敏試驗判定中，如果抑菌圈的大小超過15mm，則判定該種抗生素對沙門氏菌高度敏感，具有強抑菌作用。如果抑菌圈的直徑大于10mm、小于15mm，則表示該種抗生素對致病菌具有中度抑菌作用。如果抑菌圈的直徑小于10mm，表示該種抗生素對沙門氏菌的抑菌作用較低。如果抑菌圈直徑小于5mm，表示該種致病菌對該種抗生素具有耐藥性。通過藥敏試驗發現頭孢唑林、頭孢塞酚、萬古霉素、紅霉素、氯霉素、青霉素、四環素、苯唑西林、甲氧氟啶、諾氟沙星的抑菌圈直徑分別為18、25、7、7、8、7、9、13、10、3mm，結合，上述判定要求，發現分離得到的致病菌對頭孢唑林、頭孢塞酚高敏，對苯唑西林、甲氧氟啶中敏，對四環素、紅霉素、氯霉素、青霉素、萬古霉素低敏，對諾氟沙星耐藥。

3討論與結論

3.1合理選擇分離培養基

沙門氏菌在不同生長環境下所需要的培養基種類存在很大差異性，因此應該根據沙門氏菌所處的生長環境與不同培養基的生長情況進行綜合選擇。在進行沙門氏菌分離培養中，常規的方法是選擇麥康凱瓊脂培養基、sS瓊脂培養基、伊紅美藍瓊脂營養培養基。其中在SS瓊脂培養基上生長的致病菌無色透明，中間帶有黑色的金屬光澤感;在麥康凱瓊脂培養基上能生長出無色透明的致病菌菌落，能與大腸桿菌作出區分。本次所選擇的培養基中，致病菌在黃綠磺胺培養基中生長，會使培養基的顏色由紅色變成淡黃色，顏色變化較為明顯，同時分離出的致病菌形態更為明顯，能更加明顯地鑒定沙門氏菌屬性。

3.2細菌分離鑒定

沙門氏菌在分離鑒定中常規的方法是根據致病菌的形態以及生化試驗確定致病菌類型，同時也可以借助分子生物學，如血清鑒定、PCR技術等，但由于基層地區的試驗室缺乏相應的檢測設備，同時這些技術操作要求相對較高，基層地區不具備該條件，因此通常采用傳統分離鑒定方法。本次分離鑒定主要包括選擇性增菌、分離培養、純化培養、生化鑒定、糖發酵等幾個步驟，準確性相對較高，采用上述步驟，能得到比較純凈的沙門氏菌菌種。

3.3致病菌耐藥性鑒定

甲型副傷寒沙門氏菌是獸醫臨床上比較常見的沙門氏菌菌屬，該種沙門氏菌具有很強的致病性，在豬群中一旦爆發流行，將會造成極大的危害，導致大量豬死亡。近年，隨著生豬養殖產業不斷向前發展，很多養殖戶存在盲目用藥的行為，抗生素的使用種類不斷增多，使用量不斷增大，導致致病菌的耐藥性日趨嚴重。因此，在進行具體診治中，在明確致病原的基礎上一定要進行嚴格的藥敏試驗。本次藥敏試驗發現，分離得到的致病菌對頭孢唑林、頭孢塞酚高敏，對苯唑西林、甲氧氟啶中敏，對四環素、紅霉素、氯霉素、青霉素、萬古霉素低敏，對諾氟沙星耐藥。因此，獸醫在進行臨床治療中，一定要結合本地區藥敏試驗結果，選擇相應的抗菌藥物，這樣能極大縮短發病周期，提高治療效果。

參考文獻

[1]李三星.沙門氏菌藥敏試驗及質粒的保有狀況[J].畜牧獸醫科技信息，1998（6）：7.

[2]馮文喆，金菊，王盎，等.鵝沙門氏菌的分離鑒定及藥敏試驗[J].畜牧獸醫科技信息，2018（6）：27-28.

[3]宋岱松，陳煥昌，劉媛媛，等.1例育肥豬沙門氏菌性腸炎的診治[J].養殖與飼料，2019（5）：70-74.