棗幼胚體細胞胚發生發育的組織學觀察

任海燕　弓桂花　王永康　趙愛玲　薛曉芳

摘要：為深入研究棗體細胞胚胎發生的形態建成過程，以‘小梨棗’幼胚為材料，采用蘇木精-伊紅法染色和石蠟切片技術對體細胞胚發生、發育進行了組織學觀察。結果表明：胚型愈傷組織細胞體積小，細胞核大，細胞質濃，細胞排列緊密;而非胚性愈傷組織細胞體積大，細胞核小，細胞質稀薄。體細胞胚產生于幼胚愈傷組織的表層細胞或內部細胞，且發生不同步，其發育過程與合子胚發育過程相似，即經歷球形期、心形期和魚雷期，最終形成子葉形胚。

關鍵詞：棗;幼胚;體細胞胚;組織學觀察

中圖分類號：Q ???文獻標志碼：A ???論文編號：cjas18050007

Somatic Embryogenesis and Development in Ziziphus jujuba Mill.： Histological Observation

Ren Haiyan1，2， Gong Guihua1， Wang Yongkang1， Zhao Ailing1， Xue Xiaofang1

（1Institute of Pomology， Shanxi Academy of Agricultural Science/The Key Research Team of Genetic Improvement and Utilization of Jujube Resource/Shanxi Provincial Key Laboratory of Genetic Improvement and Use of Pomology， Taigu 030815， Shanxi， China; 2School of Horticulture， Shanxi Agricultural University， Taigu 030801， Shanxi， China）

Abstract： The paper aims to study the morphogenesis process of somatic embryogenesis. We used young embryos of Ziziphus jujuba ‘Xiaolizao’ as explants， and carried out the histological observation of somatic embryo formation and development by using the method of hematoxylin-eosin staining and paraffin section.?The results indicated that： the embryogenic callus cells had the characteristics of small size， large nucleus， thick cytoplasm and the cells were closely arranged; however， the non- embryogenic callus cells were?characterized with large size， small nucleus and thin cytoplasm. The somatic embryos were originated from?surface calluscells and inner calluscells of immature embryos and their development were not synchronized?which was similar to the embryonic development process of zygotes， the somatic embryos also experienced the spherical stage， the heart-shaped stage， the torpedo stage and ultimately formed cotyledon embryos.

Keywords： Chinese Jujube; Young Embryo; Somatic Embryogenesis; Histological Observation

0 引言

體細胞胚或胚狀體的發生，最初在1958年Steward利用胡蘿卜韌皮部組織，誘導愈傷組織，通過液體培養產生具有胚胎結構的組織。體細胞胚胎發生多具有單細胞起源的特點，且高效穩定的體細胞胚發生系統對于基因工程、遺傳轉化、品種改良等方面的研究都具有十分重要的意義。

目前，雖有一些關于棗胚經體細胞胚發生獲得植株的研究報道，如陳維倫等[1]對酸棗胚進行無性胚狀體發生并獲得植株;李登科等[2]對六月鮮棗幼胚進行離體培養，成功獲得了胚狀體及再生苗;張存智[3]以胚齡50～60天隴東馬牙棗為試材成功誘導出胚狀體及再生苗植株。從已有報道來看，幼胚較適宜作為體胚發生的外植體，但關于棗體細胞胚發生發育的組織學觀察研究較少，特別是以幼胚為外植體方面的研究。目前僅見郝建平等[4]對‘晉矮1號’等棗合子胚和體細胞胚發育過程進行了觀察與比較;程佑發等[5]對‘臨澤小棗’子葉體細胞胚發生和組織學研究。本研究以‘小梨棗’幼胚為材料，運用石蠟切片，從組織學方面對棗體細胞胚胎發生過程中的細胞形態、組織結構方面的差異進行了研究，以揭示棗幼胚體細胞胚胎的發育過程，以期為棗幼胚體細胞胚胎發生提供細胞水平證據。

1 ?材料與方法

1.1 試驗時間、地點

本試驗于2013—2015年在山西省農業科學院果樹研究所國家棗資源圃進行。

1.2 試驗材料

供試材料‘小梨棗’為可育率較高的棗品種，其盛花期為6月上旬，期間選取黃蕾期開放的棗花掛牌標記為定花，由定花所結得果為定果，根據定花和定果確定胚齡。選取胚齡30～40天的幼果。

將采集的幼果帶回實驗室，流水沖洗1h，75%酒精浸泡30s，無菌水洗2次，再用0.1%HgCl2振蕩3min，無菌水洗5次，用手術刀將棗果剖開，取出胚珠，剝去外表皮后以合點端插入培養基的豎放方式接種在培養基中，所有操作均在超凈臺上進行。培養溫度為24℃±2℃，光照時間14h/d，光照強度3000 lx。

1.3 試驗方法

1.3.1 胚乳看護培養 將‘小梨棗’胚珠置于胚乳看護培養基MS+IBA0.2mg/L+BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+LH0.5g/L+蔗糖7%+瓊脂5.5g/L，pH調至5.8，培養30天，獲得可見幼胚。

1.3.2 愈傷組織誘導 將獲得的幼胚接種于MS+TDZ0.6mg/L+IBA1.5mg/L+NAA0.1mg/L，培養40天，誘導胚性愈傷組織。

1.3.3 體細胞胚的發生與成熟 將挑取的胚性愈傷組織接種于MS+6-BA0.3mg/L+NAA0.02mg/L，培養20天，誘導產生原胚，轉接于MS+ABA0.5mg/L的培養基中，培養20天。

1.3.4 體細胞胚發育過程的組織形態學觀察 將上述胚性細胞誘導和體細胞胚發育過程中獲得的材料用FAA固定液固定，石蠟切片法制片。切片厚度9μm，采用蘇木精-伊紅法染色。于Olympus CXA1型系統顯微鏡下觀察。

2 ?結果與分析

2.1 體細胞胚發育過程的觀察

胚齡30天的胚珠外表皮呈白色，易剝離，胚不可見，胚乳呈透明液體狀。胚齡40天的胚珠表皮呈黃白色，有韌性，胚乳呈乳白色，半透明半固體狀，經胚乳看護培養，形成可見的球狀體幼胚（見圖1A）。

將球狀體的幼胚（見圖1B）轉接進行愈傷組織誘導，10天后幼胚膨大、表面變為粗糙，25天后表面可見許多凸起的細胞團，呈不規則形態，并開始出現愈傷組織，顏色為黃白色。幼胚培養34天后一些幼胚表面產生的愈傷組織整體為乳黃或淡黃色，質地緊密，呈團塊裝，為非胚性愈傷組織（見圖1C）。多數愈傷組織中形成淡黃色、半透明顆粒狀、質地疏松，易分離的胚性愈傷組織（見圖1D）。體細胞胚經圓胚團階段、隨著極性結構的形成，體細胞胚不斷發育，球體不斷膨大，胚性頭部擴展伸長，形成棒狀體（見圖1E）。棒狀體進一步發育，頭部形成子葉原基凸起，隨后子葉原基發育成幼小子葉（見圖1F）。隨著體細胞不斷的成熟，子葉不斷發育和生長變綠，頂端胚芽開始生長，胚根伸長，體胚萌發成再生植株（見圖1G）。

2.2 體細胞胚的發生發育的組織學觀察

棗幼胚體細胞胚以間接方式發生，即先由幼胚脫分化產生愈傷組織，再從愈傷組織上分化形成體細胞胚。

組織學觀察表明，愈傷組織細胞主要有兩類，一類細胞排列松散而核小，細胞壁薄，細胞質稀薄，液泡化，含水量大，細胞體積較大，形狀不規則，多為長形、長橢圓形，從石蠟切片觀察看染色較淺，這類排列松散的細胞稱為非胚性細胞（見圖1H）。非胚性愈傷邊緣的細胞通過活躍的分裂活動、快速的分裂和增殖，可以轉化為胚性愈傷組織細胞。另一類細胞多位于從表面或表層細胞的分生中心，與非胚性細胞相比，這類細胞細排列緊密，胞壁較厚，細胞核大而明顯且多位于細胞中央，細胞質濃，細胞內通常積累大量的營養物質，體積相對小，形狀較為整齊，這類細胞為體細胞胚胎的發生做準備，稱為胚性細胞（見圖1I）。

這些胚性細胞早期分裂形成顏色較深的多細胞原胚，多細胞原胚繼續呈縱向、橫向分裂。隨著體胚不斷發育，胚性頭部的球體不斷膨大，表面變光滑，細胞質密有規則，進而形成明顯的孤立化狀態的球形胚（見圖1J），有的球形胚從愈傷組織中脫落下來。球形胚進一步發育時可見到明顯的形成層分布，隨著內部組織分化的推進，胚體兩端加速生長呈心形的，此時的體胚為心形胚階段（見圖1K～L）。心形胚繼續伸長生長發育成魚雷形胚（見圖1M），魚雷形胚進一步發育成子葉形胚，有些子葉原基在發育過程中，細胞分裂生長不平衡，造成子葉的長短不一（見圖1N），但最終形成完整植株。

3 討論

生理隔離是體細胞胚胎發育的前提條件，如不能形成生理隔離就不能實現體細胞胚細胞的分化和細胞全能性的表達，從而導致體胚中途死亡或畸形。呂秀立等[6]觀察表明，七葉樹體細胞胚有發育良好的表皮層，特別是成熟胚具備良好的V字型維管束，與愈傷組織間沒有微管組織聯系，具有生理隔離性。本研究觀察到‘小梨棗’體細胞胚發生過程中出現生理隔離現象，胚性愈傷組織中的胚性細胞和非胚性細胞在形態上有較大的差別，隨著胚性愈傷組織的不斷生長發育，形態與生理上的隔離也逐漸明顯，尤在球形胚和心形胚期，在球形胚時期，有的球體己與母體完全脫離。

關于體細胞胚的發生，多數研究認為體細胞胚多發生于胚性愈傷組織表層，如龍眼[7]、鵝掌揪[8]、欒樹[9]、香蕉[10]、花生[11-12]、百合[13]、黃榆[14]等，而少數發生于胚性愈傷組織內部的體細胞胚容易中途停止發育形成畸形胚，甚至死亡。王娜[15]認為，生理隔離和營養供應不足可能是造成胚性愈傷組織內部體細胞胚中途死亡或畸形的原因之一。

體細胞胚發生是對合子胚形態發生全過程的重演[16]。不同植物體細胞胚發育經歷的階段不同。香榧體細胞胚的發育經歷了原胚、球形胚、棒狀胚、心形胚、魚雷形胚和子葉形胚6個階段[17]。攸縣油茶胚性細胞團經球形胚、心形胚、子葉形胚發育成了完整植株[18]。云杉體細胞胚發育經過早期原胚、球形胚、早期體胚及子葉胚4個階段[19]。山杏體細胞胚胎發生過程中可明顯看出球形胚、心形胚、魚雷形胚、子葉胚階段[20]。本試驗觀察表明，‘小梨棗’體細胞胚發生不同步，經歷了原胚、球形期、心形期、魚雷形胚、子葉形胚5個階段，與合子胚的發生途徑相同。這與郝建平等[4]、程佑發[4]等研究結果一致。

參考文獻

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