殼聚糖改性對玻璃離子水門汀細胞毒性的影響

周佳 徐爍 任皓 楊凱 邱曉慧 吉秋霞

[摘要]目的觀察殼聚糖（CS）改性玻璃離子水門汀（GIC）對人牙齦成纖維細胞（HGFs）的毒性。方法制備含質量分數0.01、0.02、0.04 CS和不含CS的GIC樣本，應用傅里葉紅外線光譜分析不同質量分數CS添加成功后，對樣本浸提液pH值和HGFs毒性進行檢測。結果CS改性GIC在1 716 cm-1處出現新的特征峰;在體積分數1.00和0.50浸提液濃度下，含質量分數0.02 CS-GIC的pH值較GIC更接近中性（F=465.76、35.96，P<0.01）;且在體積分數0.50和0.25的浸提液濃度下，含質量分數0.02的CS-GIC表現出了較GIC更低的HGFs毒性（F=380.20、54.62，P<0.01）。結論應用質量分數0.02 CS改性能有效降低GIC的酸度和HGFs毒性。

[關鍵詞]殼聚糖;牙科材料;毒性試驗

[中圖分類號]R343.9;R783.1[文獻標志碼]A[文章編號]2096-5532（2019）03-0266-06

[ABSTRACT]ObjectiveTo observe the cytotoxicity of chitosan （CS）-modified glass ionomer cement （GIC） on human gingival fibroblasts （HGFs）. MethodsGIC samples were prepared containing different mass fractions of CS （i.e.， 0， 0.01， 0.02， and 0.04）. Fourier transform infrared （FTIR） spectroscopy analysis was carried out to determine the pH of the sample extracts and cytotoxicity to HGFs after GIC sample preparation. ResultsFTIR showed that a new characteristic peak appeared at 1 716 cm-1 for CS-modified GIC， and GIC containing a mass fraction of CS of 0.02 had a pH value closer to 7 compared with GIC at volume fractions of 1.00 and 0.50 （F=465.76 and 35.96，P<0.01）. Besides， GIC containing a mass fraction of CS of 0.02 showed lower HGFs cytotoxicity than GIC at volume fractions of 0.50 and 0.25 （F=380.20 and 54.62，P<0.01）. ConclusionGIC containing a mass fraction of CS of 0.02 can effectively reduce the acidity and HGFs cytotoxicity of original GIC.

[KEY WORDS]chitosan; dental materials; toxicity tests

牙齦退縮是臨床常見問題，手術進行根面覆蓋是治療牙齦退縮的有效方法[1-2]。牙齦退縮后根面暴露伴發齲性或非齲性疾病是根面覆蓋手術的治療難點[3-4]，尋找一種生物相容性良好的材料充填根面后再行根面覆蓋術，降低材料對牙齦組織的細胞毒性，提高根面覆蓋效果成為研究熱點。本實驗使用生物相容性良好的殼聚糖（CS）對玻璃離子水門汀（GIC）進行改性，進一步提高GIC的細胞相容性，從細胞水平評價CS改性GIC（CS-GIC）作為根面充填材料的可能性，為后續的體內實驗奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料與試劑

CS（分子量30 000，脫乙酰率90%）購自恒臺縣金湖甲殼制品有限公司;GIC（Fuji-Ⅸ）購自而至齒科（蘇州）有限公司;α-MEM培養基、2.5 g/L胰蛋白酶、胎牛血清、PBS、CCK-8等試劑購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1實驗樣本的制備在GIC液中分別添加質量分數0.01、0.02、0.04的CS粉末，磁力攪拌均勻后，放置在37 ℃、100%相對濕度的恒溫箱內孵育至少24 h，然后按照說明書建議的粉液比進行調和。在材料未凝固之前，迅速將其灌入中空的聚乙烯模具中，模具兩端蓋上玻璃片并擠壓，去除氣泡及多余的材料。將材料連同模具、玻璃片等一起放置到37 ℃、100%相對濕度的恒溫箱中，1 h后，從模具中取出材料，挑選無氣泡、無毛邊者繼續放置在37 ℃、100%相對濕度的恒溫箱中孵育至少24 h，以確保材料完全凝固。

1.2.2傅里葉紅外線光譜（FTIR）儀檢測CS-GIC的光譜特征按照1.2.1的方法制備直徑6 mm、厚度2 mm 的CS-GIC樣本，將其在石英研缽中研磨成粉狀，取少量于FTIR儀器上進行掃描，光譜范圍為4 000～500 cm-1。

1.2.3人牙齦成纖維細胞（HGFs）的培養自我院口腔科門診獲取青少年因行開窗助萌術而切除的新鮮牙齦，在超凈工作臺內，用PBS流動沖洗組織塊數次。分離并剪碎結締組織，轉移到培養瓶底，翻轉培養瓶，加入含體積分數0.15胎牛血清和體積分數0.01雙抗的α-MEM培養基3 mL，置于37 ℃、含體積分數0.05 CO2的培養箱中，4 h后翻轉培養瓶，正常培養。當原代細胞從組織塊爬出并鋪滿培養瓶底的80%時，使用2.5 g/L胰蛋白酶進行消化，以1∶2或1∶3傳代。傳代后的細胞使用含有體積分數0.10胎牛血清和體積分數0.01雙抗的α-MEM完全培養基進行培養，并每隔3 d換液1次。

1.2.4HGFs來源鑒定細胞傳至第3代時，采用2.5 g/L胰蛋白酶進行消化，制備細胞爬片。使用40 g/L甲醛溶液固定后，常規免疫熒光法進行抗波形絲蛋白和抗角蛋白的熒光染色，并于倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5材料浸提液制備及pH值檢測按照1.2.1的方法制備GIC（A組）、含質量分數0.01、0.02、0.04 CS的CS-GIC樣本（B組、C組、D組），紫外線照射消毒后，放入無菌的完全培養基（含體積分數0.10胎牛血清、體積分數0.01雙抗的α-MEM培養基）中，按照ISO推薦的濃度 [5]在37 ℃下浸提24 h，得到浸提原液，并用完全培養基對浸提原液進行等體積比稀釋，最終得到體積分數分別為1.00、0.50、0.25、0.13的浸提液。使用pH值檢測儀對無菌的浸提液進行pH值檢測。以完全培養基為空白對照（對照組）。

1.2.6HGFs毒性檢測取第5代生長狀態良好的HGFs，制備密度7×107/L的細胞懸液。向96孔細胞培養板每孔加入100 μL的細胞懸液，以完全培養基為空白對照組，每板設空白對照組、A組、B組、C組和D組，其中A組為GIC組，B組、C組和D組分別為含體積分數0.01、0.02、0.04的CS-GIC組，每組設6個復孔。細胞培養24 h后，棄上清液，各組每孔加入100 μL相應浸提液（空白對照組每孔加入100 μL新鮮的完全培養基）。再次培養24 h后，棄上清液，加入100 μL完全培養基和10 μL CCK-8試劑，37 ℃避光孵育1.5 h，上全自動酶標儀檢測450 nm波長處每孔的吸光度（A）值，計算細胞相對增殖率（RGR，RGR=實驗組A值/對照組A值），并按5級毒性分級法評價材料的毒性[6]：RGR≥100%時，細胞的毒性評級為0級;RGR為75%～99%時，細胞毒性評級為1級;RGR為50%～74%時，細胞毒性評級為2級;RGR為25%～49%時，細胞毒性評級為3級;RGR為0～24%時，細胞毒性評級為4級。

1.3統計學方法

應用SPSS 24.0軟件進行統計學處理，計量資料結果以±s表示，多組之間比較采用析因設計的方差分析，兩組之間比較采用LSD比較。P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1FTIR檢測

CS-GIC在1 716 cm-1處出現了一個新的特征峰，這一特征峰的出現與N-C=O化學鍵的特征峰一致，即CS中的氨基與GIC液主要成分聚丙烯酸中的羧基反應生成的新化學鍵的特征峰相一致。另外，CS-GIC在2 920 cm-1和2 880 cm-1處出現了與C-H化學鍵一致的特征峰，這一特征峰較GIC和CS中的特征峰更加明顯。見圖1。

2.2細胞形態

大約在培養第7天時，原代細胞開始從組織塊爬出，細胞呈長梭形，細胞質豐富，核圓形或者橢圓形，呈現出成纖維細胞形態（圖2a）。原代細胞生長較快，約4 d后，開始傳代，傳代后的細胞呈現出更加典型的成纖維細胞樣（圖2b）。

2.3細胞免疫熒光鑒定

細胞抗波形絲蛋白染色呈陽性，細胞抗角蛋白染色呈陰性，說明細胞來源于中胚層組織，而不是上皮組織。

2.4不同材料浸提液的pH值比較

材料與濃度之間存在交互作用（F=89.97，P<0.001）。在浸提液體積分數1.00的濃度下，GIC組和CS-GIC各組的pH值顯著低于空白對照組（F=465.76，P<0.01）。在體積分數1.00和0.50的浸提液濃度下，含質量分數0.02的CS-GIC組的pH值較GIC組更接近中性，差異有統計學意義（F=465.76、35.96，P<0.01）。在體積分數0.25和0.13的浸提液濃度下，各組間pH值比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。

2.5HGFs在材料浸提液中的生長情況比較

在體積分數1.00的浸提液濃度下，GIC和CS-GIC各組中的大部分細胞皺縮、變圓。在體積分數0.50、0.25和0.13的浸提液濃度下，所有組的細胞生長狀態良好，細胞呈長梭形，細胞質豐富，核圓形或者橢圓形，呈放射狀排列。另外，所有組細胞形態未見明顯差異（圖3）。

2.6各組細胞毒性比較

材料與濃度之間存在交互的作用（F=310.76，P<0.001）。在體積分數為1.00的浸提液濃度下，GIC組和CS-GIC各組的A值顯著低于空白對照組（F=1 606.24，P<0.01），細胞毒性評級為4級。在體積分數0.50和0.25的浸提液濃度下，雖然GIC組和CS-GIC各濃度組的A值仍顯著低于空白對照組（F=380.20、54.62，P<0.01），但含質量分數0.02 CS的 CS-GIC組的A值明顯高于GIC組，細胞毒性評級也較低。當浸提液濃度稀釋到體積分數0.13時，GIC和CS-GIC各組的A值與空白對照組比較差異無顯著性（P>0.05）。見表2、3。

3討論

GIC是臨床上常用的牙體充填材料，曾被應用于齦下充填，包括根折、牙根外吸收和根管側穿的修復[7]。近幾年，許多學者將GIC及其改性產品用于根面充填并在其表面行根面覆蓋術，用以治療牙齦退縮伴根面齲性或非齲性疾病。ALKAN等[8]及SANTAMARIA等[9-10]通過個案報道、隨機對照研究等發現，在樹脂加強型GIC表面行根面覆蓋術，術后牙齦探診深度在正常范圍，附著喪失明顯改善，且齦溝液內炎癥因子水平和齦下菌斑微生物的量與對照組比較無明顯差異。然而，學者們關于GIC的細胞毒性仍存在爭議。一些學者經過體外研究發現，GIC和樹脂加強型GIC對體外細胞具有明顯的細胞毒性[11-13]。隨著材料科學的發展，具有更好生物相容性的生物陶瓷材料——礦物三氧化物凝聚體（MTA）和iRoot等相繼問世，已經應用于齦下缺損的修補[14-17]。但臨床應用和實驗研究發現，上述材料臨床應用時由于性能不佳、固化時間較長、與牙體組織的粘結強度不高以及價格昂貴等[18]，并不適用于牙頸部大面積牙體組織缺損的充填修復。

CS是自然界中唯一帶正電荷的堿性多糖，它可以通過局部中和反應產生抗炎作用，形成的氨基葡萄糖酸鹽或其他鹽，可被發炎的結締組織或軟骨組織吸收，促進其修復和再生[19]。CS還能通過調節細胞增殖來促進細胞再生和傷口愈合[20]。另外，CS具有黏膜黏附性、抗菌性和降解性等許多優良的性能，使其成為研究的熱點，被廣泛應用于各個領域。CS在牙科領域的研究，也早有報道。2007年，PETRI等[21]學者使用質量分數0.004 4的CS對GIC進行改性，結果顯示改性后的CS-GIC具有更高的彎曲強度以及更強的氟離子釋放能力。2017年，DEBNATH等[22]學者將體積分數0.10的CS溶液與GIC液相結合，發現其可顯著改善GIC的抗菌性能及對釉質的粘結性能。然而，這些研究主要集中在對材料的機械性能、與牙體組織的粘結性能和抗菌性能的改進上，有關CS-GIC細胞毒性方面的研究甚少。本文實驗設計了質量分數0.01、0.02和0.04共3種濃度的CS，應用其對GIC進行改性，觀察其細胞毒性的大小，以期為其用于齦下大面積充填提供依據。FTIR檢測結果顯示，CS改性后的GIC在1 716 cm-1處出現新的特征峰，這是因為CS分子鏈中的氨基（NH2）與GIC液主要成分聚丙烯酸中的羧基發生反應生成新的化學鍵（N-C=O）引起的，這也證實了CS成功整合到GIC中。

本實驗按照ISO的標準制備了不同濃度的浸提液，并使用CCK-8試劑進行檢測。結果顯示，在浸提液體積分數1.00的濃度下，GIC組和CS-GIC各組的A值顯著低于空白對照組，大部分細胞形態出現皺縮變圓，表現出了明顯的細胞毒性。該結果與以往文獻結果相似[12，23-24]。STANISLAWSKI等[25]研究顯示，GIC造成周圍環境pH值的降低是引起細胞毒性的原因之一;SMITH等[23]研究也認為，GIC的低pH值會造成牙髓細胞的敏感甚至壞死。本文研究結果顯示，GIC組和CS-GIC各組的體積分數1.0浸提液pH值均顯著低于空白對照組，表現出明顯的酸性，其對應的細胞毒性也高;隨著浸提液濃度被稀釋，其pH值逐漸接近中性，細胞毒性也逐漸降低。

本文結果還顯示，在體積分數1.00和0.50的浸提液濃度下，含質量分數0.02 CS的CS-GIC組較GIC組和其他CS-GIC組pH值更接近中性，說明含質量分數0.02 CS的CS-GIC引起周圍環境pH值降低的程度更低。PETRI等[21]研究發現，質量分數0.004 4的CS添加到GIC中，可以增加氟離子（F-）的釋放量，這些F-會消耗周圍環境的H+生成HF等非游離性酸根離子，從而降低周圍環境的酸度。因此，推測含質量分數0.02 CS的CS-GIC組較其他組所消耗的游離H+更多，從而使周圍環境的pH值更接近中性，但具體機制尚待進一步研究。另外，本文結果還顯示，含質量分數0.02 CS的CS-GIC組較GIC和其他CS-GIC組的pH值更接近中性，細胞毒性也更低。這也說明GIC的細胞毒性與其引起周圍環境pH值降低有關。

在臨床實踐中，牙頸部周圍的根面缺損充填后，材料將長期處于齦溝液的浸泡中，材料中的酸根離子或其他有毒成分將滲透到齦溝液中，影響牙齦組織的健康。正常情況下，單個牙位短時間內的齦溝液量很少，用濾紙條采集30 s的齦溝液樣本量<1 μL[26]。因此，齦溝液中短時間內的材料浸提液濃度很高，對牙齦組織的影響也較大;但隨著時間的延長和齦溝液、唾液不斷的沖刷，局部浸提液濃度逐漸降低。然而，由于體內環境的復雜性，單純依靠體外實驗難以更好地模擬體內環境，因此還需要進行體內試驗。

綜上所述，含質量分數0.02 CS的CS-GIC能降低周圍環境的酸度，從而降低材料的細胞毒性，但仍需要進行體內研究，以進一步評價CS-GIC能否降低材料對牙齦組織的毒性，促進根面覆蓋術后的牙齦組織與材料之間的粘結，為治療牙齦退縮伴牙頸部疾病提供一種新的方法。

[參考文獻]

[1]郭云，曹正國. 上皮下結締組織移植聯合冠向復位瓣改善下前牙牙齦退縮一例[J]. 中華口腔醫學雜志， 2018，53（3）：169-172.

[2]戴安娜，丁佩惠，唐琪，等. 牙周根面覆蓋術治療牙齦退縮的長期療效觀察[J]. ?中華口腔醫學雜志， 2019，54（2）：124-129.

[3]DELIBERADOR T M， MARTINS T M， FURLANETO F A， et al. Use of the connective tissue graft for the coverage of composite resin-restored root surfaces in maxillary central incisors[J]. ?Quintessence International， 2012，43（7）：597-602.

[4]皇甫若奇，徐曉. 牙齒非齲性頸部缺損疾病的研究回顧[J]. ?口腔材料器械雜志， 2010，19（1）：26-29.

[5]MULLER B P， ELSENTRAGER A， JAHNEN-DECHENT W， et al. Effect of sample preparation on the in vitro genoto-xicity of a light curable glass ionomer cement[J]. ?Biomate-rials， 2003，24（4）：611-617.

[6]張彩霞. 應用細胞培養法對復合樹脂充填材料的毒性研究[J]. 口腔醫學， 1982，2（1）：40-58.

[7]南曉紅，寇繼寅，李茹. 玻璃離子水門汀的應用及發展[J]. 口腔醫學， 2007，27（6）：323-325.

[8]ALKAN A， KESKINER I， YUZBASIOGLU E. Connective tissue grafting on resin ionomer in localized gingival recession[J]. ?Journal of Periodontology， 2006，77（8）：1446-1451.

[9]SANTAMARIA M P， SUAID F F， CASATI M Z， et al. Coronally positioned flap plus resin-modified glass ionomer restoration for the treatment of gingival recession associated with non-carious cervical lesions： a randomized controlled clinical trial[J]. ?J Periodontol， 2008，79（4）：621-628.

[10]SANTAMARIA M P， CASATI M Z， NOCITI J， et al. Connective tissue graft plus resin-modified glass ionomer restoration for the treatment of gingival recession associated with non-carious cervical lesions： microbiological and immunological results[J]. ?Clinical Oral Investigations， 2013，17（1）：67-77.

[11]DE SOUZA COSTA C A， HEBLING J， GARCIA-GODOY F， et al. In vitro cytotoxicity of five glass-ionomer cements[J]. ?Biomaterials， 2003，24（21）：3853-3858.

[12]RODRIGUEZ I A， ROZAS FERRARA C A， CAMPOS-SANCHEZ F， et al. An in vitro biocompatibility study of conventional and resin-modified glass ionomer cements[J]. ?Journal of Adhesive Dentistry， 2013，15（6）：541-546.

[13]MARCZUK K G， LUCZAJ C E， PAWINSKA M， et al. Eva-luation of the cytotoxicity of selected conventional glass ionomer cements on human gingival fibroblasts[J]. ?Advances in Clinical and Experimental Medicine， 2017，26（7）：1041-1045.

[14]張竹，李茗慧. iRoot BP Plus在老年根尖手術中的應用研究[J]. ?中華老年口腔醫學雜志， 2016，14（6）：326-329.

[15]王密，尹世海，王奇，等. iRoot BP修復磨牙髓室底穿孔的研究[J]. ?華西口腔醫學雜志， 2013，31（3）：257-266.

[16]鄧金勇，李艷莉. 三氧化礦物凝聚體修補根管側穿、髓底穿孔的臨床效果[J]. ?中國醫學前沿雜志（電子版）， ?2015，7（7）：115-118.

[17]侯文賢. 用三氧化礦物凝聚體對86例髓底穿通和根管側穿修補治療的臨床觀察[J]. ?口腔醫學， 2014，34 （10）：797-798.

[18]王芬，武金明，薛明. 根管封閉劑iRoot SP根尖封閉性能評價[J]. 上海口腔醫學， 2013，22（2）：156-159.

[19]XIA Wenshui， LIU Ping， ZHANG Jiali，et al. Biological activities of chitosan and chitooligosaccharides[J]. ?Food Hydrocolloids， 2011，25（2）：170-179.

[20]李若慧，張雪，單丹彤，等. 殼聚糖的生物相容性[J]. 中國組織工程研究， 2012，16（12）：2237-2240.

[21]PETRI D F， DONEGA J， BENASSI A M. Preliminary study on chitosan modified glass ionomer restoratives[J]. ?Dental Materials， 2007，23（8）：1004-1010.

[22]DEBNATH A， KESAVAPPA S B， SINGH G P， et al. Comparative evaluation of antibacterial and adhesive properties of chitosan modified glass ionomer cement and conventional glass ionomer cement： an in vitro study[J]. ?J Clin Diagn Res， 2017，11（3）： ZC75-ZC78.

[23]SMITH D C， RUSE N D. Acidity of glass ionomer cements during setting and its relation to pulp sensitivity[J]. ?J Am Dent Assoc， 1986，112（5）：654-657.

[24]LEWIS J， NIX L， SCHUSTER G， et al. Response of oral mucosal cells to glass ionomer cements[J]. ?Biomaterials， 1996，17（11）：1115-1120.

[25]STANISLAWSKI L， DANIAU X， LAUTIE A， et al. Factors responsible for pulp cell cytotoxicity induced by resin-modified glass ionomer cements[J]. ?Journal of Biomedical Materials Research， 1999，48（3）：277-288.

[26]陳智濱，孫曉軍，寇傳哲，等. 齦溝液微量樣本中多種成分的檢測[J]. 北京大學學報（醫學版）， 2008，40（1）：57-59.

（本文編輯 黃建鄉）