降逆清熱化濁方對非糜爛性胃食管反流病大鼠模型食管組織降鈣素基因相關肽的影響

邱新萍　陳瑞琳　周滔　李長新　?？旅簟钪冁谩∫笮泠●R萬千

摘要?目的：觀察降逆清熱化濁方對非糜爛性胃食管反流病（NERD）大鼠模型食管組織降鈣素基因相關肽（CGRP）的影響。方法：選取SD雄性大鼠60只并將其分為正常組、模型組、西藥組和中藥組。以雞卵清蛋白/氫氧化鋁基礎致敏聯合食管酸灌注的方法制備NERD大鼠模型，藥物干預14 d后，觀察各組大鼠食管組織的病理改變及高敏感性相關信號分子CGRP的表達情況。結果：與正常組比較，模型組大鼠食管組織上皮細胞間隙增寬，有少量炎性細胞;與模型組比較，中藥組、西藥組大鼠食管組織CGRP表達明顯降低，且中藥組降低更為顯著。結論：降逆清熱化濁方通過抑制CGRP的表達，下調食管高敏感性，從而對NERD起到治療作用。

關鍵詞?胃食管反流;降逆清熱化濁方;食管高敏感性;大鼠;降鈣素基因相關肽;上皮細胞

Study of Effects on Jiangni Qingre Huazhuo Prescription on Calcitonin Gene Related Peptide in Rats with Non-erosive Gastroesophageal Reflux Disease

Qiu Xinping1，Chen Ruilin2，3，Zhou Tao2，Li Changxin1，Niu Kemin1，Yang Zhongting2，3，Yin Xiuwen2，3，Ma Wanqian1

（1 Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine Shunyi Branch，Beijing 101300，China; 2 Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine，Capital Medical University，Beijing 100010，China; 3 Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China）

Abstract?Objective：To observe the effects of Jiangni Qingre Huazhuo Prescription on the esophageal tissue CGRP in rats with non-erosive gastroesophageal reflux disease（NERD）. Methods：Sixty male SD rats were divided into the normal group，model group，western medicine group and Chinese medicine group. The NERD rat model was prepared by chicken ovalbumin/aluminum hydroxide sensitization combined with esophageal acid perfusion. After 14 days of drug intervention，the pathological changes of esophageal tissue and the calcitonin gene related peptide（CGRP）of high-sensitivity-related signaling molecule was observed. Results：Compared with the normal group，the esophageal tissue epithelial cells in the model group were widened and a small amount of inflammatory cells were present. Compared with the model group，the expression of CGRP in the esophageal tissue of the rats in the Chinese medicine group and the western medicine group was significantly reduced. The decreased range of Chinese medicine group was more significant than that of the western medicine group. Conclusion：Jiangni Qingre Huazhuo Prescription can get therapeutic effects of non-erosive gastroesophageal reflux disease by inhibiting expression of CGRP and down-regulate the high sensitivity of esophagus.

Key Words?Gastroesophageal reflux; Jiangni Qingre Huazhuo Prescription; Esophageal hypersensitivity; Rats; Calcitonin gene related peptide; Epithelial cells

中圖分類號：R289.5;R573.9文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.03.019

胃食管反流病（Gastroesophageal Reflux Disease，GERD）是胃內容物反流入食管、口腔所引起的，以反酸、燒心、吞咽疼痛為主要不適癥狀的一種疾病[1]。其中，具有胃食管反流引起的不適癥狀，且近期未予以抑酸治療，內鏡下未發現食管黏膜損傷的一種GERD亞型為非糜爛性胃食管反流病（Non-erosive Gastroesophageal Reflux Disease，NERD），又稱內鏡陰性胃食管反流病，占GERD的50%～70%[2-3]。NERD的發病機制較為復雜，目前多認為與酸反流、非酸相關性刺激、內臟高敏感等相關[4-5]。NERD根據其臨床特征可歸入中醫學“反酸”“嘈雜”等范疇。中醫認為其主要病機為“胃氣上逆、胃火熾盛、濁邪上泛”，故治療當以降逆清熱化濁為主[6]。本研究主要通過建立食管高敏感性NERD大鼠模型，觀察降逆清熱化濁方干預下NERD大鼠食管高敏感性相關信號分子的表達情況，以探討降逆清熱化濁方對NERD食管高敏感性的影響及其治療NERD的作用機制。

1?材料

1.1.1?動物

選取雄性SD大鼠60只，SPF級，體質量150～160 g，動物批號為11401500034143，購自斯貝福（北京）生物技術有限公司，自由攝食與飲水。自由攝食與飲水，飼養3 d，待大鼠適應環境后開始試驗。

1.1.2?藥物

降逆清熱化濁方由柴胡12 g、白芍10 g、枳實15 g、厚樸15 g、陳皮10 g、吳茱萸3 g、黃連10 g等藥物組成，中藥顆粒劑購自廣東一方制藥有限公司。奧美拉唑腸溶片購自山東新時代藥業有限公司，國藥準字H20044871。

1.1.3?試劑與儀器

試劑：OVA雞蛋清白蛋白，購自Bioruler百奧百樂生物科技有限公司;抗大鼠CGRP多克隆抗體，購自Proteintech公司;抗大鼠P物質多克隆抗體，購自艾博抗（上海）貿易有限公司;氫氧化鋁、烏拉坦，購自美國Sigma公司。

儀器：臺式高速離心機，購自美國Thermo Fisher Scientific公司。奧林巴斯BX41顯微鏡，購自日本Olympus公司。

1.2?方法

1.2.1?分組與模型制備

分組：將60只大鼠隨機分為4組，即正常組、模型組、中藥組、西藥組，每組15只。其中模型組、中藥組及西藥組大鼠均在實驗第1天予以卵清蛋白/氫氧化鋁混合液行腹腔注射，正常組大鼠予等量生理鹽水行腹腔注射。從實驗第2天開始，中藥組、西藥組大鼠分別予以疏肝和胃方（0.625 g/mL，相當于成人用藥量5倍）及奧美拉唑溶液（0.167 mg/100 g體質量，相當于成人用藥量5倍）10 mL/kg體質量灌胃，正常組和模型組大鼠均予以等量生理鹽水（10 mL/kg體質量）灌胃。連續給藥2周，至第14天結束給藥，并進行食管酸灌注，采集大鼠食管標本進行相關實驗檢測。

食管高敏感性的GERD大鼠模型的制備[7]：選擇雞卵清蛋白/氫氧化鋁基礎致敏聯合食管酸灌注的方法制備內臟高敏感性NERD大鼠模型。在實驗第1天即用卵清蛋白和氫氧化鋁佐劑的混合液1.5 mL（卵清蛋白100 mg/氫氧化鋁200 mg）行腹腔注射，進行基礎致敏;在實驗第14天進行食管酸灌注。

食管酸灌注方法如下：酸灌注前禁食24 h，予以10%烏拉坦（8 mL/kg）麻醉，大鼠麻醉后將頭部抬高20°～30°平臥固定;切開腹壁暴露胃壁，并在近賁門處切一小圓孔，通過小圓孔放置引流管，用以收集從灌注的液體;將一單腔灌流管一端經口置食管內，并固定在食管和胃交界處上2～3 cm處，另一端與持續灌注泵相連，使用0.1 mol/L鹽酸以10 mL/h的速度滴注50 min。

1.2.2?干預方法

中藥組：疏肝和胃方（0.625 g/mL，相當于成人用藥量5倍），10 mL/kg體質量灌胃;西藥組：奧美拉唑溶液（0.167 mg/100 g體質量，相當于成人用藥量5倍）10 mL/kg體質量灌胃;正常組和模型組：生理鹽水10 mL/kg體質量灌胃。

1.2.3?檢測指標與方法

大鼠食管組織病理學檢測：自賁門向口腔方向剪取1 cm左右長度的食管組織，用10%中性甲醛固定，依次進行乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。切片厚度為4 μm，常規蘇木精-伊紅（HE）染色。鏡下觀察食管組織病理學改變。

大鼠食管組織CGRP水平檢測：大鼠食管組織石蠟切片，常規脫蠟，檸檬酸高壓熱修復2.5 min，過氧化氫作用10 min阻斷內源性過氧化物酶，加入大鼠CGRP抗體（抗體濃度1∶50），在37 ℃條件下孵育1 h，加入酶標羊血清抗小鼠/兔二抗，在室溫下孵育20 min，最后用二氨基聯苯胺（DAB）顯色。鏡下讀片，棕褐色團塊即為CGRP陽性表現。

2?結果

2.1?一般情況

正常組大鼠的行為活躍，體質量正常增加;與正常組比較，模型組大鼠的體質量增加較少、精神萎靡、行為不活躍，而中藥組和西藥組大鼠體質量稍增加，精神稍差，活動尚可。

2.2?大鼠食管組織病理學

模型組、中藥組、西藥組大鼠食管黏膜除上皮細胞層內有少量淋巴細胞外，均未見鱗狀上皮增生和黏膜糜爛等明顯病理變化;正常組大鼠黏膜上皮細胞層內未見炎性細胞浸潤及明顯病理變化。見圖1。

2.3?大鼠食管組織CGRP表達

與正常組比較，模型組大鼠食管組織CGRP陽性表達明顯增多;與模型組比較，中藥組與西藥組大鼠食管組織CGRP陽性表達均有明顯減少，且中藥組減少更為顯著。見圖2。

3?討論

NERD根據其燒心、反酸、噯氣、胸骨后灼痛、咽部如有梗死感等癥狀臨床特征可歸入中醫學“吞酸”“嘈雜”等范疇。《素問·至真要大論》曰：“諸嘔吐酸，皆屬于熱”?！鹅`樞·四時氣論》云：“善嘔，嘔有苦……邪在膽，逆在胃，膽液泄則口苦，胃氣逆則嘔苦”?！端貑栃C原病式·吐酸》云：“酸者，肝木之味也。由火盛制金，不能平木，則肝木自甚，故為酸也”。諸多醫家認為NERD病機屬熱，與肝、膽、胃有關。關于病因，中醫認為該病多由情志失調、飲食不節、素體脾胃虛弱等所致。《血證論》載：“木之性主疏泄，食氣入胃，全賴肝木之氣以疏泄之，而水谷乃化”。肝屬木，脾胃屬土，五行生克制化，肝木克土，當情志失調，肝氣郁滯，或氣郁化火，肝火亢盛，則傷脾胃，脾胃失和，胃氣上逆而發病。肝膽同處膈下，互為表里，在生理上相互依賴，在病理上相互影響，膽經受邪亦會影響肝經疏泄;或飲食不節，嗜食肥甘厚膩，致痰濕內生，阻滯氣機，脾胃升降失常;或素體脾胃虛弱，或久病傷及脾胃，土虛木乘，運化失常，故該病位在食管，屬脾胃所主，但與肝、膽關系密切。

馬萬千主任醫師認為，NERD的主要病機為肝失疏泄，氣滯化熱犯胃，胃氣上逆，脾胃升降失常，運化失司，濁邪內生并隨氣逆上泛，其中“胃氣上逆、胃火熾盛、濁邪上泛”為病機關鍵[6]。以此為依據，并結合多年臨床經驗，馬萬千主任醫師提出治療NERD當以“降逆”為切入點，以“降逆疏肝、清熱化濁”為主要大法，自擬降逆清熱化濁方，藥用柴胡、白芍、枳實、厚樸、陳皮、吳茱萸、黃連、甘草、蒼術等，臨床療效顯著。《素問·六元正紀大論》曰：“木郁達之”。與反流性食管炎比較，NERD患者有更明顯的焦慮傾向，生命質量和心理健康程度也偏低。當今社會環境下，人們承受著越來越大的生活和工作壓力，出現焦慮與抑郁等情志不暢者日益增加，NERD的患者也逐漸增多。焦慮和抑郁等情緒都與肝失疏泄明顯相關，故擬方首選柴胡利肝膽、疏肝解郁，白芍斂陰柔肝，厚樸以溫中下氣，枳實破氣消積，同為降逆之品，降逆疏肝，肝脾同治;“見肝之病，知肝傳脾，當先實脾”。故同時配伍陳皮健脾順氣，蒼術燥濕健脾;肝郁日久，容易化火生熱，亦配伍黃連清脾胃之火，吳茱萸以防寒涼之品遏傷脾胃之陽，諸藥合用共奏降逆疏肝，清熱和胃之效。

西醫治療NERD的主要藥物包括質子泵抑制劑（PPI）、胃腸動力藥等，但臨床上存在很大一部分患者在服用PPI后，反酸、燒心等癥狀并不能得到有效緩解。且西藥目前尚存在用藥較為單一，不良反應較為明顯，而患者的生命質量及焦慮抑郁等情況改善并不十分理想等不足之處，且長期維持用藥給患者及家庭造成了巨大的經濟負擔。中醫藥治療NERD具有一定的優勢和特色。在上述馬萬千主任醫師對NERD病機認識和組方用藥的相關思想指導下，我們前期臨床觀察降逆清熱化濁方（柴胡12 g、白芍10 g、枳實15 g、厚樸15 g、陳皮10 g、吳茱萸3 g、黃連10 g、甘草10 g、蒼術10 g等）治療肝胃不和型NERD患者60例，總有效率98%，且在RDQ評分、中醫證候積分、主要單項癥狀計分、生命質量量表積分等方面的改善明顯優于口服雷貝拉唑腸溶膠囊治療的對照組（P<0.05），證明了降逆清熱化濁方的臨床療效[8]。本研究探討及驗證降逆清熱化濁方治療NERD的作用機制，明確中醫藥治療該病的療效及優勢，以期在臨床上更廣泛應用及推廣。

NERD的發病機制尚未十分明確，現代醫學多認為其與食管清除能力下降、食管及胃排空功能障礙、內臟高敏感及情志等因素相關。但臨床應用PPI治療NERD患者的療效反饋通常不佳，對NERD患者食管24 h反流監測結果顯示，大部分患者的酸反流屬于生理范圍。由此推測，胃酸并非NERD的主要致病因素，可能與食管高敏感性相關，故即使是生理量的反流物也可導致食管高敏感性的NERD患者產生反酸、燒心等癥狀。

目前已有較多研究證實食管內臟高敏感性可能是NERD重要的病理生理基礎。內臟高敏感性（Visceral Hypersensitivity，VH）是指內臟對疼痛或刺激的感知閾值降低，對生理性刺激產生不適感或對傷害性刺激反應強烈。NERD患者對食管酸刺激、機械性刺激、膽堿能藥物的敏感性增強，即為食管高敏感性。注：降鈣素基因相關肽（Calcitonin Gene Related Peptide，CGRP）是重要的感覺神經遞質，降低疼痛閾值，增加內臟敏感性[8]。CGRP即是食管高敏感性相關的重要信號分子之一，CGRP是重要的感覺神經遞質，降低疼痛閾值，增加內臟敏感性。CGRP含量的增加可引起食管黏膜的神經末梢處于興奮狀態，并導致“神經源性炎癥”，從而使局部微環境發生改變，引起患者痛覺過敏[9]。有研究顯示，CGRP在NERD患者的食管黏膜中高表達[10]。CGRP是外周神經系統中，參與痛覺信息傳遞的重要神經遞質。食管的支配神經發出大量纖維末梢分布于食管壁全層，這些末梢中含有大量的CGRP。食管受到刺激后，信號傳入引起CGRP等神經活性物質釋放，作用于相應神經支配區使肥大細胞脫顆粒而釋放各種細胞因子及炎性反應遞質，引起血管擴張，通透性增加，血漿蛋白外滲等神經源性炎性反應，導致內臟感知閾值下降，即食管內臟高敏感性[11-13]。張秀蓮[14]分別測定CERD患者及正常人食管黏膜中CGRP的含量，結果顯示CERD患者食管組織中CGRP的表達較正常人明顯增多，從而推測NERD的食管高敏感性與CGRP高表達相關。牛小平等[15]分別檢測CERD患者及正常人血清中CGRP的含量，檢測結果顯示NERD患者血清CGRP表達水平明顯高于正常對照組（P<0.05）;且CGRP表達水平與GerdQ評分呈正相關，由此可知NERD患者血清CGRP表達明顯增加，與反流癥狀嚴重程度呈正相關，CGRP參與了NERD的病理過程，是其內臟高敏性的重要機制。

綜上所述，模型組大鼠的食管組織上皮細胞層內存在炎性細胞，與NERD的病理學變化相符。中藥組及西藥組大鼠食管組織病理改變減輕，表明降逆清熱化濁方對NERD具有明確的治療效果。且降逆清熱化濁方能夠顯著降低NERD模型大鼠食管組織中CGRP的表達，對其食管高敏感性具有明顯的抑制作用。由此可以得出結論，降逆清熱化濁方可能是通過下調食管CGRP的表達，降低食管高敏感性從而對NERD起到治療作用。但本實驗關于食管高敏感性的研究較為單一，有待更深入的研究，以明確中醫藥的作用機制及優勢環節，充分發揮中醫藥的價值。

參考文獻

[1]Katz PO，Gerson LB，Vela MF.Guidelines for the diagnosis and management of gastroesophageal reflux disease[J].Am J Gastroenterol，2013，108（3）：308-328; quiz 329.

[2]Zentilin P，Marabotto E，Pellegatta G，et al.Complexity and diversity of gastroesophageal reflux disease phenotypes[J].Minerva Gastroenterol Dietol，2017，63（3）：198-204.

[3]Zou D，He J，Ma X，et al.Epidemiology of symptom-defined gastroesophageal reflux disease and reflux esophagitis：the systematic investigation of gastrointestinal diseases in China（SILC）[J].Scand J Gastroenterol，2011，46（2）：133-141.

[4]崔榮麗，周麗雅，林三仁，等.光學顯微鏡測量胃食管反流病患者食管下段細胞間隙的臨床價值[J].中華消化內鏡雜志，2011，28（1）：1-4.

[5]陳文科，鄒兵，鄭愛萍，等.光學顯微鏡下非糜爛性反流病食管遠端上皮細胞間隙的變化[J].中國實用醫藥，2016，11（7）：19-20.

[6]邱新萍，周滔，馬萬千.馬萬千降逆清熱化濁法治療非糜爛性胃食管反流病經驗[J].北京中醫藥，2016，35（1）：55-56.

[7]楊敏，陳東風，房殿春.食管內臟高敏感性動物模型的建立和評價[J].局解手術學雜志，2008，17（2）：77-79.

[8]?？旅?，周滔，邱新萍，等.降逆清熱化濁方治療肝胃不和型非糜爛性反流病的療效評價[J].中華中醫藥雜志，2018，33（7）：3180-3182.

[9]劉芳薇，洪炎國.降鈣素基因相關肽家族在疼痛和阿片耐受中的作用[J].生理學報，2013，65（3）：347-354.

[10]Xu X，Li Z，Zou D，et al.High expression of calcitonin gene-related peptide and substance P in esophageal mucosa of patients with non-erosive reflux disease[J].Dig Dis Sci，2013，58（1）：53-60.

[11]孟慶偉，許樹長.食管內臟高敏感及其相關研究進展[J].世界華人消化雜志，2012，20（7）：568-573.

[12]Yoshida N，Kuroda M，Suzuki T，et al.Role of nociceptors/neuropeptides in the pathogenesis of visceral hypersensitivity of nonerosive reflux disease[J].Dig Dis Sci，2013，58（8）：2237-2243.

[13]孔炫，許樹長.食管內臟高敏感與神經遞質、離子通道及受體[J].國際消化病雜志，2009，29（2）：111-113.

[14]張秀蓮.食管黏膜SP、CGRP參與非糜爛性胃食管反流病發生的敏感化機制研究[C].貴陽：中華中醫藥學會脾胃病分會第二十五屆全國脾胃病學術交流會，2013：3.

[15]牛小平，劉少鋒，汪潤芝.非糜爛性反流病患者血清P物質、降鈣素基因相關肽的表達及意義[J].皖南醫學院學報，2014，33（3）：205-206，211.