BZL方對非酒精性脂肪性肝炎模型小鼠腸黏膜損傷的保護作用

冷靜　田華捷　黃甫　馮琴　趙瑜　胡義揚　彭景華

摘要?目的：觀察中藥組分復方BZL方（白術多糖、梔子苷、綠原酸）對高脂飲食誘導的小鼠脂肪性肝炎（NASH）及其腸黏膜損傷的作用。方法：C57BL/6J雄性小鼠27只，隨機分為正常、模型和BZL方組，每組9只。除正常組外，其余各組均采用高脂飲食誘導NASH，第14周開始，BZL方組灌胃BZL方，其余各組灌胃等量飲用水，至17周末處死取材。觀察各組小鼠體質量、進食量、肝體比，肝組織病理（HE和天狼猩紅染色，SAF評分），檢測血漿ALT、GGT活性、LPS水平，肝組織TG含量;肝組織膠原I型和IV型、內毒素受體CD14、TLR1、TLR2、TLR4、TLR9及炎性反應因子IL-1β、TNF-α mRNA表達（real-time PCR法）;腸組織病理（HE染色）;大腸組織緊密連接zo-1、occludin、claudin mRNA表達（real-time PCR法）及蛋白表達（免疫熒光染色）。結果：高脂飲食誘導NASH模型中，模型組血漿ALT、GGT、LPS及肝組織TG含量較正常組顯著升高（P<0.01）;肝組織可見脂肪沉積、炎性反應、氣球樣變及纖維化，SAF評分顯著高于正常組，肝組織膠原ColI、ColIV mRNA顯著升高，CD14、TLR1、TLR2、TLR4、TLR9及IL-1β、TNF-α mRNA表達升高（P<0.05，P<0.01）;腸組織病理變化光鏡下不明顯，大腸組織緊密連接zo-1、occludin、claudin mRNA表達降低（P<0.01），zo-1、occludin免疫熒光陽性染色減少。BZL方可降低血漿ALT、GGT、LPS、肝組織TG含量（P<0.05，P<0.01），改善SAF評分，降低肝組織膠原ColI、ColIV mRNA表達（P<0.01），降低CD14、TLR2、TLR4、TLR9及IL-1β、TNF-α mRNA表達（P<0.05，P<0.01），恢復大腸組織緊密連接zo-1、occludin mRNA表達（P<0.01），恢復zo-1、occludin免疫熒光陽性染色。結論：BZL方有效減輕高脂飲食誘導的小鼠NASH，該作用與其保護腸黏膜、抑制LPS腸滲漏及肝組織中TLRs及炎性反應因子密切相關。

關鍵詞?非酒精性脂肪性肝炎;中藥組分復方;天然產物;白術多糖;梔子苷;綠原酸;腸黏膜屏障;緊密連接

Protective Effects of BZL Recipe on Intestinal Mucosal Injury in Non-alcoholic Steatohepatitis in Mice

Leng Jing1，Tian Huajie1，Huang Fu1，Feng Qin1，Zhao Yu1，Hu Yiyang2，3，Peng Jinghua1，2，3

（1 Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 201203，China; 2 Institute of Liver Diseases，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 201203，China; 3 Shanghai Key Laboratory of Traditional Chinese Clinical Medicine，Shanghai 201203，China; 4 Institute of Clinical Pharmacology，Shanghai 201203，China）

Abstract?Objective：To observe the effects of Chinese Medicine BZL recipe（composed of Atractylodes macrocephala polysaccharide，chlorogenic acid，and geniposide）on non-alcoholic steatohepatitis（NASH）and intestinal mucosal injury induced by high-fat diet in mice. Methods：Twenty seven male C57BL/6J mice were randomly divided into the normal group，the model group，and BZL group，with 9 rats in each group. Except the normal group，the other groups were induced by NASH. From the 14th week，mice in BZL group were administrated with BZL recipe by gavage daily，and the other mice were administrated with same dose distilled water. Till the end of 17th week，the mice were killed for collection materials. The body weight，food intake，liver-to-body ratio，liver histopathology（HE and Sirius red staining，SAF score）were observed in each group. Plasma ALT，GGT activity，LPS level，liver tissue TG content，liver tissue collagen type I and type IV，endotoxin receptor CD14，TLR1，TLR2，TLR4，TLR9 and inflammatory factors IL-1β，TNF-α mRNA expression（real-time PCR），intestinal histopathology（HE staining），large intestine tissue tight junction zo-1，occludin，claudin mRNA expression（real-time PCR）and protein expression（immunofluorescence staining）were detected.Results：In the high-fat diet induced NASH model，plasma ALT，GGT，LPS and liver tissue TG levels in the model group were significantly higher than those in the normal group（P<0.01）; liver tissue showed fat deposition，inflammation，balloon-like changes and fibrosis. SAF score was significantly higher than the normal group. Liver tissue collagen ColI，ColIV mRNA increased significantly，and CD14，TLR1，TLR2，TLR4，TLR9 and IL-1β，TNF-α mRNA expression increased（P<0.05，P<0.01）; The pathological changes of intestinal tissue were not obvious under light microscope. The expression of zo-1，occludin and claudin mRNA in the large intestine was decreased（P<0.01），and the immunofluorescence staining of zo-1 and occludin was decreased. BZL recipe can reduce plasma ALT，GGT，LPS，liver tissue TG content（P<0.05，P<0.01），improve SAF score，reduce liver tissue collagen ColI，ColIV mRNA expression（P<0.01），reduce CD14，TLR2，TLR4，TLR9，IL-1β and TNF-α mRNA expression（P<0.05，P<0.01），restored the expression of zo-1 and occludin mRNA in the large intestine，and restored the immunofluorescence staining of zo-1 and occludin. Conclusion：BZL recipe can effectively alleviate NASH induced by high-fat diet，which is closely related to the protection of intestinal mucosa，inhibition of LPS intestinal leakage and TLRs and inflammatory factors in liver tissue.

Key Words?Non-alcoholic steatohepatitis; Chinese medicine components combination; Natural products; Atractylodes macrocephala polysaccharide; Geniposide; Chlorogenic acid; Intestinal mucosa barrier; Tight junction

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.03.014

非酒精性脂肪性肝病（Non-alcoholic Fatty Liver Disease，NAFLD）是一種與胰島素抵抗和遺傳易感密切相關的代謝應激性肝損傷，疾病譜包括非酒精性肝脂肪變（Non-alcoholic Fatty Liver，NAFL）、非酒精性脂肪性肝炎（Non-alcoholic Steatohepatitis，NASH）、肝硬化和肝細胞癌[1]。NAFLD是全球最常見的慢性肝病之一，普通成人NAFLD患病率在6.3%～45%，其中10%～30%為NASH[2]。與NAFL比較，NASH患者不良結局風險高，若不積極防治，易進展為肝硬化、肝功能衰竭和肝細胞癌，心血管疾病和惡性腫瘤的發生率也隨之增加[3-5]。新進的研究發現“腸道因素”在NAFLD發病過程中起到了重要作用，如腸黏膜屏障損傷可使肝臟直接暴露于腸道內的抗原物質（如腸道細菌、腸源性內毒素），導致肝臟一系列的免疫反應[6]，引發或加重NASH。

BZL方來源于本課題組總結的臨床治療NAFLD經驗方——祛濕化瘀方。前期研究發現，高脂飲食誘導的NASH小鼠腸黏膜損傷，祛濕化瘀方改善NASH同時對腸黏膜屏障具有保護作用[7]。進而對祛濕化瘀方各味中藥的代表性有效成分（綠原酸、虎杖苷、白術多糖、梔子苷和姜黃素）以不同劑量、肝組織三酰甘油（Triglyceride，TG）為參數，進行均勻設計篩選，得到的回歸方程提示，白術多糖266.67 mg/kg、綠原酸3.33 mg/kg、梔子苷45 mg/kg所構成的組分復方降低肝組織TG的作用最明顯，并命名為“BZL”方[8-9]。已證實BZL方能夠有效減輕高脂飲食誘導的小鼠NAFLD[10]，本研究擬通過觀察BZL方對高脂飲食誘導的小鼠NASH腸黏膜損傷的作用，進一步揭示其防治NASH的作用機制。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?動物?SPF級C57BL/6J健康雄性小鼠27只，8周齡，體質量23～28 g，購自北京聯合利華實驗動物有限公司，合格證號：SCXK（京）2016-0006。飼養于上海中醫藥大學實驗動物中心，溫度20～25 ℃，濕度60%～70%，燈照周期12 h（7：00-19：00燈照，19：00-7：00黑暗）。獲得上海中醫藥大學動物實驗倫理委員會的批準，批準號：SZY201610010。

1.1.2?藥物?BZL方由白術多糖（純度85%，批號ZL20170129，南京澤朗醫藥有限公司），梔子苷（純度98%，批號170106，上海融禾醫藥科技發展有限公司）與綠原酸（純度98%，批號161227，上海融禾醫藥科技發展有限公司）組成。

1.1.3?主要儀器?M5多功能酶標儀（美國Molecular Devices）;Aperio AT Turbo數字化病理掃片機（德國Lecia）;T100 PCR儀（美國Bio-Rad）;Applied Biosystems ViiA7 PCR儀（美國Thermo Fisher）;FV10I激光共聚焦顯微鏡（日本OLYMPUS）。

1.2?方法

1.2.1?分組與模型制備?C57BL/6J小鼠隨機分為正常（n=9）、模型（n=9）和BZL方組（n=9）。正常組予10%脂肪熱能對照飼料（貨號D12450B，美國Research Diet公司），模型組與BZL方組予60%脂肪熱能高脂飼料（貨號D12492，美國Research Diet公司），自由進食17周。

1.2.2?給藥方法?造模第14周開始進行藥物干預。BZL方組小鼠予配制好的BZL方（白術多糖266.67 mg/（kg·d）、綠原酸3.33 mg/（kg·d）、梔子苷45 mg/（kg·d））灌胃，正常組和模型組予等體積滅菌飲用水灌胃，至17周末。取腹腔靜脈血液于EDTA抗凝管中，4 ℃，500 g/min，離心15 min，分離血漿;各取兩份約1 cm×1 cm肝組織、約1 cm長度大小腸組織分別放入中性福爾馬林及OCT包埋膠中固定，余下組織放入2 mL離心管液氮保存后，轉移到-80 ℃冰箱凍存，待測。

1.2.3?檢測指標與方法

1）血漿丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、γ-谷氨酰轉移酶（GGT）檢測?生化試劑盒檢測（賴氏法），試劑盒購自南京建成生物研究所，按說明書操作。

2）肝組織三酰甘油TG檢測?稱取肝組織100 mg，放入無水乙醇和丙酮各750 μL液體中，65 Hz勻漿，90 s/次，3次。4 ℃靜置過夜。4 ℃，3 000 r/min離心15 min，取上清液用于TG測定。TG試劑盒購于浙江東甌診斷產品有限公司，按說明書操作。

3）組織病理?肝臟與腸組織（小腸和大腸）采用HE染色觀察，肝組織膠原纖維采用天狼猩紅染色觀察。根據中華醫學會肝病學分會脂肪肝和酒精性肝病學組的推薦意見[1]，肝組織病理采用SAF積分[11]評定，評判標準。見表1。其中，NASH的定義為5%以上的肝細胞脂肪變合并小葉內炎性反應和肝細胞氣球樣變性，不合并肝纖維化或僅有輕度纖維化（F0-1）為早期NASH;合并顯著肝纖維化或間隔纖維化（F2-3）為纖維化性NASH;合并肝硬化（F4）為NASH肝硬化[1]。

4）血漿內毒素（Lipopolysaccharide，LPS）檢測?LPS試劑盒購于Associates of CAPE COD Incorporated，鱟試劑法，按說明書操作。

5）肝臟與大腸組織mRNA表達real-time PCR檢測?總RNA提取、cDNA合成及real-time PCR均采用試劑盒（總RNA提取試劑盒，貨號B511321，生工生物工程上海有限公司;cDNA合成試劑盒，貨號1708891，Bio-Rad公司;real-time PCR試劑盒，貨號RR420A，TaKaRa公司）按照說明書操作。所用引物由生工生物工程上海有限公司合成，引物序列。見表2。

6）大腸組織蛋白表達?采用免疫熒光染色觀察OCT膠包埋組織切片，厚度8 μm，浸入4 ℃丙酮15 min后PBS清洗，浸入0.2% TritonTMX-100透膜后4 ℃雙蒸水清洗，10%山羊血清室溫封閉40 min，4 ℃孵育一抗過夜，隔日取出后4 ℃ PBS清洗，37 ℃避光孵育二抗30 min，4 ℃ PBS清洗后DAPI染核，抗熒光淬滅劑封片鏡檢。所用抗體見表3。

1.3?統計學方法

采用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析，方差齊性用最小顯著差法（Least Significant Difference，LSD）作兩兩比較，方差齊，符合正態分布的用單因素方差分析，數據用均數±標準差（±s）表示，以P<0.05為差異有統計學意義。方差不齊或者不符合正態分布的用非參數檢驗，非參數檢驗用中位數（四分位間距）表示，即median（Q3-Q1），以P<0.05為差異有統計學意義。

2?結果

2.1?實驗小鼠一般情況

實驗過程中小鼠狀態良好。造模小鼠體質量較對照小鼠增長迅速，17周末實驗結束時，模型組小鼠體質量顯著高于正常組（P<0.01），BZL方干預后小鼠體質量較模型組降低（P<0.05）。每只小鼠平均每周進食量無統計學意義。模型組小鼠肝體比較正常組升高（P<0.05），BZL方組較模型組顯著降低（P<0.01）。見表4。

2.2?BZL方對NASH小鼠肝損傷的作用

2.2.1?肝組織病理?肝組織HE染色可見正常組小鼠肝小葉結構清晰，肝索排列整齊。模型組小鼠肝細胞出現明顯的細胞腫脹，胞質內出現脂肪空泡，伴有肝細胞氣球樣變，部分匯管區、小葉內可見炎細胞浸潤。BZL方組小鼠肝細胞脂肪變性及氣球樣變改變明顯減輕，偶見炎細胞。天狼猩紅染色可見正常組小鼠肝組織內僅在血管壁、匯管區有少量膠原纖維存在;模型組小鼠肝小葉匯管區可見膠原纖維增粗擴張，竇周可見少量膠原纖維增生;BZL方組肝小葉膠原增生較模型組不明顯。SAF積分提示模型組小鼠肝組織脂肪變、活動度積分均較正常組明顯升高（P<0.01），證實存在肝細胞脂肪變，合并氣球樣變和小葉內炎性反應，符合NASH的診斷。同時纖維化積分較正常組顯著增高（P<0.01），根據指南關于NASH的定義提示為纖維化性NASH（F2）。BZL方組小鼠肝組織脂肪變與活動度積分均較模型組明顯減輕（P<0.01），纖維化程度較模型組減輕（P<0.05），符合早期NASH（F1）的診斷。見圖1、表5。

2.2.2?血漿ALT、GGT活性及肝組織TG含量?與正常組比較，模型組小鼠血漿ALT、GGT活性均明顯升高（P<0.01）;BZL方組小鼠的血漿ALT、GGT活性較模型組降低（P<0.05）。模型組肝組織TG含量顯著高于正常組（P<0.01），BZL方組肝組織TG含量較模型組顯著降低（P<0.01）。見表6。

2.2.3?肝組織I型和IV型膠原mRNA表達?與正常組比較，模型組小鼠肝組織ColI及ColIV mRNA表達明顯升高（P<0.01），BZL方組較模型組顯著下降（P<0.01）。見表7。

2.3?BZL方對NASH小鼠肝組織內毒素受體及炎性反應因子mRNA表達的作用

與正常組比較，模型組小鼠肝組織內毒素受體CD14、TLR9 mRNA表達明顯升高（P<0.01），TLR1、TLR2、TLR4 mRNA升高（P<0.05）。BZL方組肝組織CD14、TLR4、TLR9 mRNA表達較模型組顯著降低（P<0.01），同時TLR2 mRNA表達較模型組也降低（P<0.05）。與正常組比較，模型組肝組織炎性反應因子IL-1β、TNF-α mRNA表達較正常組升高（P<0.05），BZL方組較模型組降低（P<0.01，P<0.05）。見表8。

2.4?BZL方對血漿內毒素LPS的影響

模型組小鼠血漿LPS含量高于正常組（P<0.05）。BZL方組小鼠血漿LPS含量較模型組降低（P<0.05）。見表9。

2.5?BZL方對NASH小鼠腸黏膜損傷的作用

2.5.1?腸組織HE染色?各組小鼠小腸和大腸組織HE染色未見明顯病理改變。見圖2。

2.5.2?大腸組織緊密連接mRNA表達?與正常組比較，模型組小鼠大腸組織zo-1、occludin、claudin mRNA表達明顯降低（P<0.01），BZL方組小鼠大腸組織zo-1、occludin mRNA表達較模型組顯著升高（P<0.01），claudin mRNA表達無明顯統計學意義。見表10。

2.5.3?大腸組織緊密連接蛋白表達?免疫熒光染色觀察發現，模型組小鼠大腸組織緊密連接蛋白zo-1、occludin陽性染色較正常組弱、不連續，BZL方組小鼠大腸組織緊密連接蛋白zo-1、occludin陽性染色較模型組更強。緊密連接蛋白claudin陽性染色各組間未見明顯統計學意義。見圖3。

3?討論

NASH引起的肝硬化已經越來越多的成為肝移植的一種常見適應證，這與NASH伴隨的肝纖維化密切相關。肝纖維化可以獨立于其他因素預測NAFLD的預后[12]，一項NAFLD患者的縱向研究中也證實，NASH中患者中，與長期總體死亡率及肝移植相關的是纖維化，而不是其他組織學特征[13]。此外，如果一個NASH患者不伴有纖維化，未來10～20年內發生死亡或肝相關并發癥（如腹水，靜脈曲張，肝性腦病）的可能性較低[4]，故NASH防治中需重視組織學中纖維化的評估。SAF積分系統引入了“纖維化”這一組分，被新近更新的諸多指南推薦用于NASH肝組織病理學的評判，且更優于NAS評分系統[1]。該積分一方面將肝纖維化程度單獨評估可以更加精確評估預后;另一方面，將NAS評分中的小葉炎性反應與氣球樣合并，為疾病活動度評價提供了更大空間[14]。

本研究再次驗證了BZL方對于高脂飲食誘導的NASH的藥效。同時發現，高脂飲食17周，小鼠肝小葉已能觀察到匯管區膠原纖維的擴張及竇周纖維組織沉積較正常組小鼠增加，膠原組織mRNA檢測結果也與之相符，SAF積分提示處于NASH合病纖維化（F2）。BZL方干預后，肝組織NASH病變明顯減輕，膠原沉積也有所減輕。

腸道與肝臟在解剖上通過門靜脈相連。完整的腸黏膜屏障可以阻止腸源性抗原物質（如細菌及其產物）進入血循環。緊密連接位于腸上皮的頂端，由相鄰腸細胞的連接蛋白zo-1，occludin，claudin等組成，是腸黏膜屏障的最重要組成部分。完整的緊密連接既可以有選擇性的允許營養物質的運輸，又可以防止腸腔內有害物質進入循環[15]。研究[16-19]顯示，NAFLD患者和動物模型中均存在腸黏膜損傷，在NAFLD小鼠中加重腸黏膜損傷，則其肝組織損傷（NASH、肝纖維化）可進一步加重。在前期研究中我們發現，高脂飲食16周即可誘導NASH小鼠合病腸黏膜損傷[7]，在本研究中雖然在NASH小鼠腸組織HE染色中未觀察到明顯的病理變化，但血漿LPS水平上升。LPS來源于腸道中的革蘭氏陰性菌，腸源性LPS可透過損傷的腸黏膜屏障進入血循環。進一步觀察到NASH小鼠腸組織緊密連接蛋白表達較正常組明顯下調，上述改變均提示了腸黏膜損傷。BZL方作用后，血漿LPS水平下降，大腸組織緊密連接zo-1，occludin表達均較模型組有所恢復，提示BZL方對NASH小鼠腸黏膜屏障具有保護作用。

Toll樣受體家族是NASH中最主要的識別腸源性細菌產物的受體家族[20-21]，其中，TLR4/CD14受體特異性識別革蘭氏陰性菌產物LPS，TLR1與TLR2則介導宿主對革蘭氏陽性菌的應答，TLR9可識別雙鏈細菌DNA[22]。特異性TLRs激活后，細胞內級聯反應發生[23-24]，分泌參與炎性反應和細胞死亡的生物活性細胞因子如IL-1β和TNF-α等進一步加重肝損傷，并可能激活肝星狀細胞，進而引發肝纖維化。本研究中，模型組小鼠肝組織TLRs受體及炎性反應因子mRNA表達升高，部分提示了肝組織中腸源性細菌產物的暴露，BZL方對肝組織TLR2、TLR4、CD14、TLR9及IL-1β、TNF-αmRNA表達均有下調作用，提示BZL方可抑制腸源性細菌產物誘導的TLRs激活而產生炎性反應因子，該作用與其抗NASH的藥理效應密切相關。

目前針對NASH缺乏理想藥物。胰島素增敏劑吡格列酮雖對NASH患者生化學指標和肝組織病變均有改善作用，但考慮長期應用的安全性，目前僅推薦用于NASH合并2型糖尿病患者的治療[25-26]。有研究發現維生素E 800 U/d口服2年可以使無糖尿病的NASH成人血清氨基酸轉移酶恢復正常，肝脂肪變和炎性反應損傷得到改善[27]。然而長期大劑量使用維生素E的安全性尚不明確[1]。奧貝膽酸顯著減輕NASH患者肝纖維化程度，但是該藥對脂代謝有不良影響，可導致皮膚瘙癢，且其有效性還需更多的臨床試驗驗證[1]。中醫藥治療NAFLD有其特色，中藥復方多途徑、多靶點的藥理作用特性也與多臟器、多通路參與其中的NAFLD復雜的發病機制相契合，中醫藥治療NAFLD的藥效和藥理機制值得深入的研究和挖掘。

BZL方為臨床治療NAFLD有效經驗方——祛濕化瘀方基礎上篩選得到的有效成分復方，組方相對簡單，成分明確，藥理效應得到驗證。本研究證實BZL方對高脂飲食誘導的小鼠NASH模型具有良好的治療作用，該藥理效應與其保護腸黏膜、抑制LPS腸滲漏及肝組織中腸源性細菌產物相應受體和炎性反應因子密切相關。

然而BZL方是通過何種機理保護腸上皮細胞間緊密連接進而保護腸黏膜屏障仍需深入研究。此外，白術多糖、梔子苷和綠原酸分別在其中起到何種作用及其相互之間的影響是今后深入研究的關鍵問題，以期進一步解析BZL方作用機制和配伍特點。

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