茯苓甘草湯對功能性消化不良模型大鼠的改善作用機制研究

曹峰 劉楊 秦源 鄭子安 葛玉紅 唐阿梅

中圖分類號 R289.3；R965 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）04-0473-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.04.09

摘 要 目的：研究茯苓甘草湯對功能性消化不良（FD）模型大鼠的改善作用機制。方法：取SD大鼠60只，隨機分為正常組、模型組、茯苓甘草湯高劑量組（20 g/kg）、茯苓甘草湯低劑量組（10 g/kg）、聯用組（茯苓甘草湯10 g/kg+多潘立酮0.004 g/kg）、多潘立酮組（0.004 g/kg），每組10只。除正常組外，其余組大鼠均灌胃冰稀鹽酸建立FD模型。造模結束后，正常組和模型組大鼠灌胃等體積常溫蒸餾水，其余組大鼠灌胃相應常溫藥物溶液（1 mL/100 g），每天1次，連續7 d。測定大鼠胃內殘渣量以評價胃排空功能。采用免疫組化SP法檢測胃黏膜組織中水通道蛋白3（AQP3）、胃促生長素（Ghrelin）、P物質（Substance P）的蛋白表達水平；采用蛋白印跡法檢測胃黏膜組織中緊密連接蛋白1（Claudin-1）、閉鎖蛋白（Occludin）、血管活性腸肽（VIP）的蛋白表達水平。結果：與正常組比較，模型組大鼠胃內殘渣量明顯增多（P<0.01）；胃黏膜組織中AQP3、Ghrelin蛋白陽性表達明顯減少，Substance P蛋白陽性表達較多；AQP3、Ghrelin、Claudin-1、Occludin蛋白表達水平顯著降低，Substance P、VIP蛋白表達水平顯著升高（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠胃內殘渣量明顯減少（P<0.05或P<0.01）；各給藥組大鼠胃黏膜組織中AQP3、Ghrelin蛋白陽性表達較多，Substance P蛋白陽性表達較少；各給藥組大鼠胃黏膜組織中AQP3、Occludin蛋白表達水平顯著升高，VIP蛋白表達水平顯著降低（P<0.05或P<0.01）；茯苓甘草湯高劑量組、茯苓甘草湯低劑量組和聯用組大鼠胃黏膜組織中Ghrelin、Claudin-1蛋白表達水平顯著升高，Substance P蛋白表達水平顯著降低（P<0.05）。結論：茯苓甘草湯可能通過對大鼠胃黏膜組織中AQP3、Ghrelin、Claudin-1、Occludin蛋白表達的上調和Substance P、VIP蛋白表達的下調，從而改善FD模型大鼠水液潴留癥狀。

關鍵詞 茯苓甘草湯；功能性消化不良；水通道蛋白3；胃促生長素；P物質；緊密連接蛋白1；閉鎖蛋白；血管活性腸肽；腦腸軸；大鼠

ABSTRACT OBJECTIVE： To study improvement effects of Fuling gancao decoction on functional dyspepsia （FD） model rats. METHODS： Sixty SD rats were randomly divided into normal group， model group， Fuling gancao decoction high-dose group （20 g/kg）， Fuling gancao decoction low-dose group （10 g/kg）， drug combination group （Fuling gancao decoction 10 g/kg+domperidone 0.004 g/kg）， domperidone group （0.004 g/kg）， with 10 rats in each group. Except for normal group， other groups were givenicy dilute hydrochloric acid intragastrically to establish FD model. After modeling， normal group and model group were given constant volume of distilled water at room temperature intragastrically， and other groups were given relevant drug solution （1 mL/100 g） intragastrically， once a day， for consecutive 7 d. The amount of gastric residue was measured to evaluate the gastric emptying function. Immunohistochemistry SP method was used to detect the protein expression of AQP3， Ghrelin and Substance P in gastric mucosa tissue. The protein expression of Claudin-1， Occludin and VIP were detected by Western blot assay. RESULTS： Compared with normal group， the amount of gastric residue was increased significantly in model group （P<0.01）； positive expression of AQP3 and Ghrelin protein in gastric mucosa tissue was decreased significantly， while the positive expression of Substance P protein tended to increase； the protein expression levels of AQP3， Ghrelin， Claudin-1 and Occludin were decreased significantly， while those of Substance P and VIP were increased significantly （P<0.05 or P<0.01）. Compared with model group， the amount of gastric residue was decreased significantly in administration groups （P<0.05 or P<0.01）； the positive expression of AQP3 and Ghrelin protein tended to increase， while less positive expression of Substance P was found； the protein expression levels of AQP3 and Occludin in gastric mucosa tissue were increased significantly in administration groups， while those of VIP were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）； the protein expression levels of Ghrelin and Claudin-1 in gastric mucosa tissue were increased significantly in Fuling gancao decoction high-dose group， Fuling gancao decoction low-dose group and drug combination group， while those of Substance P were decreased significantly （P<0.05）. CONCLUSIONS： Fuling gancao decoction may improve the symptom of fluid retention in FD model rats by up-regulating the protein expression of AQP3， Ghrelin， Claudin-1 and Occludin and down-regulating the protein expression of Substance P and VIP in gastric mucosa tissue of rats.

KEYWORDS Fuling gancao decoction； Functional dyspepsia； AQP3； Ghrelin； Substance P； Claudin-1； Occludin； Vasoactive intestinal peptide； Brain-gut axis； Rat

功能性消化不良（Functional dyspepsia，FD）是無明顯胃器質性病變并以上腹部疼痛或不適、飽脹、噯氣不舒、嘔逆等為臨床癥狀的消化系統疾病；其在臨床上常表現為胃排空延遲，部分表現為胃液體排空延遲[1]。FD的癥狀表現可歸屬于中醫的胃虛飲停證的范疇。作為治療胃虛飲停證的代表方劑茯苓甘草湯，我國中醫經典《傷寒論》中記載其具有溫胃化飲的功效，主治心下悸、胃中痞滿、胃中有振水聲等。本課題組前期研究也發現，茯苓甘草湯能顯著促進FD模型大鼠胃中液體排空，其作用可能與提高胃底乙酰膽堿酯酶（AChE）含量、降低胃底一氧化氮（NO）含量的機制有關[2]。已有研究證實，FD的發生過程中常伴有胃黏膜組織中多種蛋白的異常表達[3-4]?；诖?，本實驗通過考察茯苓甘草湯干預治療FD模型大鼠后對其胃黏膜組織中水通道蛋白3（AQP3）、胃促生長素（Ghrelin）、P物質（Substance P）、緊密連接蛋白1（Claudin-1）、閉鎖蛋白（Occludin）、血管活性腸肽（VIP）蛋白表達的影響，探討茯苓甘草湯治療FD的作用機制，以期為該方劑的進一步開發和臨床應用提供實驗依據。

1 材料

1.1 儀器

FA124型電子分析天平（上海邦西儀器科技有限公司）；KD-202A型石蠟切片機（浙江科迪儀器設備有限公司）；CX21型光學顯微鏡（日本Olympus公司）；PowerPAC Basic型電泳儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 藥品與試劑

多潘立酮片（西安楊森制藥有限公司，批號：170306533，規格：10 mg）；AQP3、Ghrelin、Substance P、Claudin-1、Occludin、VIP和β-肌動蛋白（β-actin）抗體（一抗，英國Abcam公司，批號分別為ab125219、ab209790、ab216414、ab15098、ab216327、ab8556、ab8227）；山羊抗兔辣根過氧化酶抗體（二抗）、磷酸緩沖鹽溶液（PBS，pH7.2～7.4）（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號分別為109525、ZLI-9062）；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠制備試劑盒、BCA蛋白濃度定量試劑盒、ECL超敏發光液、蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒、二氨基聯苯胺（DAB）顯影劑（北京索萊寶生物科技有限公司，貨號分別為G1120、PC0020、PE0010、G1120、DA1010）；MinuteTM 動物細胞/組織總蛋白提取試劑盒[英文特生物（北京）技術有限公司，貨號：SD-001/SN-002]；水為自制蒸餾水（pH7.2～7.4）。

1.3 藥材

茯苓、桂枝、甘草（炙）、生姜均購自貴州同濟堂藥業有限公司，經貴陽中醫學院董麗莎教授鑒定為正品。茯苓甘草湯按《傷寒論》原方比例配伍：茯苓30 g、桂枝30 g、炙甘草15 g、生姜45 g。取按此比例配伍好的藥材100 g，分次加水1 000、800、800 mL煎煮3次，每次40 min；濾過，合并3次濾液，于60 ℃緩慢蒸發至每毫升藥液相當于原藥材1 g（動物實驗時給藥劑量以原藥材量計），在4 ℃條件下保存備用。

1.4 動物

SD清潔級大鼠60只，雌雄各半，體質量180～220 g，由長沙天勤生物技術有限公司提供[動物生產許可證號：SCXK（湘）2014-0011]，由貴陽中醫學院SPF級實驗室飼養[動物飼養許可證號：SYXK（黔）2012-0001]。室溫設為（20±2）℃，動物固體顆粒飼料由長沙天勤生物技術有限公司提供。

2 方法

2.1 分組、造模和給藥

取大鼠60只，隨機分為正常組、模型組、茯苓甘草湯高劑量組（20 g/kg）、茯苓甘草湯低劑量組（10 g/kg）、聯用組（茯苓甘草湯10 g/kg+多潘立酮0.004 g/kg）、多潘立酮組（0.004 g/kg），每組10只。正常組大鼠灌胃常溫蒸餾水0.8 mL，其余各組大鼠根據文獻[2]灌胃溫度為0 ℃、濃度為0.5 mol/L的稀鹽酸0.8 mL建立大鼠FD模型。連續灌胃14 d后，正常組和模型組大鼠灌胃等體積常溫蒸餾水，其余各組大鼠灌胃常溫相應濃度的藥物溶液1 mL/100 g（藥品/藥液均以蒸餾水稀釋至適當濃度），每天1次，連續7 d。

2.2 大鼠胃排空功能檢查

末次給藥前，各組大鼠先禁食8 h，然后給予半流質飼料（固體顆粒飼料搗碎后加水調配）和碳粉混合物（2 g/只），10 min后再給予蒸餾水或相應藥物。給藥30 min后，處死大鼠，取胃組織在洗凈前后分別稱定質量，并計算胃內殘渣量（胃內殘渣量=胃總質量-胃凈質量），以評價大鼠胃排空功能。

2.3 大鼠胃黏膜組織中AQP3、Ghrelin、Substance P的蛋白表達水平檢測

采用免疫組化SP法檢測。取“2.2”項下各組5只大鼠的胃組織，放入4%多聚甲醛中固定后，以自來水沖洗4 h，再以不同體積分數的乙醇（由低到高）分別脫水1 h；二甲苯透明20 min×2次；液體石蠟中浸蠟1.5 h×2次，包埋，切片（厚度為6 μm）；以常規二甲苯脫蠟15 min×2次，以不同體積分數的乙醇（由高到低）分別水化；PBS浸泡5 min，3%過氧化氫封閉10 min；PBS沖洗后分別滴加AQP3、Ghrelin、Substance P抗體（1 ∶ 100），4 ℃孵育12 h后滴加二抗（1 ∶ 300）；DAB顯色，自來水沖洗，蘇木素復染，脫水，透明并封片鏡檢。于顯微鏡下觀察胃黏膜組織中目的蛋白表達情況，陽性表達呈棕黃色。每組各蛋白隨機選擇5張切片，每張切片隨機選擇3個視野，采用Image Pro Plus 6.0軟件分析光密度值以表示蛋白表達水平。

2.4 大鼠胃黏膜組織中Claudin-1、Occludin、VIP蛋白表達水平檢測

采用蛋白印跡法檢測。取“2.2”項下各組5只大鼠的胃組織，-80 ℃條件下低溫保存。檢測時取50 mg胃黏膜組織，按照MinuteTM動物細胞/組織總蛋白提取試劑盒說明書方法進行總蛋白提取后，采用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。采用SDS-PAGE凝膠制備試劑盒制備12%的分離膠和5%的濃縮膠，取蛋白50μg上樣，濃縮膠80 V電泳1 h，分離膠130 V電泳1 h。根據目的蛋白分子量切膠后，60 V轉膜2 h，5%脫脂奶粉封閉2 h；分別加入Claudin-1、Occludin、VIP蛋白抗體（1 ∶ 3 000）和β-actin抗體（1 ∶ 8 000），4 ℃孵育24 h；TBST緩沖液沖洗3次，加入二抗（1 ∶ 7 000），常溫孵育2 h；TBST緩沖液沖洗3次，ECL發光液顯影。以β-actin為參比，采用Ima- ge Pro Plus 6.0軟件分析目的蛋白條帶相對灰度值，以表示蛋白表達水平。

2.5 統計學方法

采用SPSS17.0軟件對數據進行統計分析。計量資料以x±s表示，組間比較采用非參數秩和檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 茯苓甘草湯對大鼠胃排空功能的影響

與正常組比較，模型組大鼠胃內殘渣量明顯增多，差異有統計學意義（P<0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠胃內殘渣量明顯減少，差異均有統計學意義（P<0.05），詳見表1。

3.2 茯苓甘草湯對大鼠胃黏膜組織中AQP3、Ghrelin、Substance P蛋白表達的影響

正常組大鼠黏膜組織腺泡內AQP3、Ghrelin蛋白陽性表達較多，其中Ghrelin蛋白在黏膜至黏膜下層都有明顯表達；Substance P蛋白陽性表達較少。模型組大鼠黏膜組織腺泡內AQP3、Ghrelin蛋白陽性表達明顯減少，其中AQP3蛋白表達從黏膜至黏膜下層逐步減少；Substance P蛋白陽性表達較多，在黏膜至黏膜下層表達明顯。茯苓甘草湯高劑量組、茯苓甘草湯低劑量組、聯用組和多潘立酮組大鼠黏膜組織中AQP3、Ghrelin蛋白陽性表達較多，與正常組相似；Substance P蛋白陽性表達較模型組明顯減少。各組大鼠胃黏膜組織中AQP3、Ghrelin、Substance P蛋白表達的組織切片顯微圖見圖1～圖3。

定量分析結果顯示，與正常組比較，模型組大鼠胃黏膜組織中AQP3、Ghrelin蛋白表達水平均顯著降低，Substance P蛋白表達水平顯著升高，差異均有統計學意義（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠胃黏膜組織中AQP3蛋白表達水平顯著升高；茯苓甘草湯高劑量組、茯苓甘草湯低劑量組和聯用組大鼠胃黏膜組織中Ghrelin蛋白表達水平顯著升高，Substance P蛋白表達水平顯著降低，差異均有統計學意義（P<0.05）。各組大鼠胃黏膜組織中AQP3、Ghrelin、Substance P蛋白表達水平檢測結果見表2。

3.3 茯苓甘草湯對大鼠胃黏膜組織中Claudin-1、Occludin、VIP蛋白表達的影響

與正常組比較，模型組大鼠胃黏膜組織中Claudin-1、Occludin蛋白表達水平均顯著降低，VIP蛋白表達水平顯著升高，差異均有統計學意義（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，茯苓甘草湯高劑量組、茯苓甘草湯低劑量組和聯用組大鼠胃黏膜組織中Claudin-1蛋白表達水平顯著升高；各給藥組大鼠胃黏膜組織中Occludin蛋白表達水平顯著升高，VIP蛋白表達水平顯著降低，差異均有統計學意義（P<0.05或 P<0.01）。各組大鼠胃黏膜組織中Claudin-1、Occludin、VIP蛋白表達電泳圖見圖4，蛋白表達水平檢測結果見表3。

4 討論

隨著社會快速發展、人們工作和生活壓力的不斷增加，FD的發病率逐年增加，而胃和小腸排空異常是導致FD發生的主要病理生理機制之一[5-6]。其發病原因常與腦腸軸失衡、慢性炎癥、內臟感覺異常、幽門螺旋桿菌感染、精神壓力及飲食失調等密切相關，發病過程較為復雜[7]。AQP3蛋白作為跨膜轉運蛋白，廣泛分布于胃腸道上皮細胞層內，對水分轉運起重要作用[8]。Occludin、Claudin-1蛋白屬于緊密連接家族蛋白成員，在上皮細胞和內皮細胞間作為骨架蛋白起連接作用，是胃腸黏膜屏障功能和生理結構完整性的重要保護蛋白，對維持水分子、細胞大分子等物質進行細胞旁通透有重要意義，兩者的異常表達會造成胃腸黏膜緊密連接功能異常和組織滲透壓失衡[9-10]。Ghrelin蛋白是一種生長激素促分泌素受體的配體蛋白，作為垂體-下丘腦-胃腸道的媒介蛋白，其主要分布在胃腸道，在胃組織中含量最高，參與能量代謝、胃腸消化蠕動、內分泌等過程，具有促進攝食的作用[11-12]。VIP蛋白為舒血管腸肽，屬于神經腦腸肽，在消化系統、呼吸系統等多個組織均有分布，主要分布在黏膜內分泌細胞和黏膜下神經叢和肌層，它能調節平滑肌和腺體分泌，對胃腸動力有抑制性調節作用[13-14]。Substance P蛋白作為雙向調節蛋白，在介導疼痛和炎癥浸潤等過程中有重要作用，與受體結合能引起血管舒張和通透性增高，參與組織損傷，同時又可刺激胃腸蠕動等[15]。

本研究選擇多潘立酮作為陽性對照藥物，其為多巴胺受體拮抗劑，臨床常用來治療FD。該藥可通過拮抗多巴胺受體，擴張食管括約肌，改善幽門收縮，增強腸胃動力，促進腸胃蠕動，加快腸胃排空[16]。本實驗結果顯示，經冰稀鹽酸造模模擬胃虛飲停證的大鼠出現FD現象，而給予茯苓甘草湯后能明顯減少大鼠胃內殘渣量，表明該湯劑具有促胃腸運動作用，可改善因消化不良造成的胃內潴留。將不同劑量的茯苓甘草湯單用或者與多潘立酮聯用，可使AQP3蛋白表達水平升高，從而促進水液代謝、減少胃內水液潴留；可使Ghrelin、Claudin-1、Occludin等連接蛋白表達水平升高，從而減輕水液潴留所致腹脹、胃動力低下的癥狀；可使Substance P、VIP蛋白表達水平降低，從而減輕胃腸蠕動抑制，減少血管因擴張導致的通透性增加，減輕水液積聚。而單獨使用多潘立酮后，也同樣對上述蛋白表現出相似的調節作用。

綜上所述，茯苓甘草湯可能通過對大鼠胃黏膜組織中AQP3、Ghrelin、Claudin-1、Occludin蛋白表達的上調和Substance P、VIP蛋白表達的下調，從而改善FD模型大鼠水液潴留癥狀。

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（收稿日期：2018-09-09 修回日期：2019-01-01）

（編輯：段思怡）