扶正解毒化瘀方對多重耐藥銅綠假單胞菌MexAB-OprM外排泵表達影響的研究

王玉婷　徐紅日　趙世同　程淼　姚興偉　常桂嬌　陳師林　王成祥

摘要?目的：研究扶正解毒化瘀方對多重耐藥銅綠假單胞菌MexAB-OprM外排泵表達的影響。方法：針對篩選出的MexAB-OprM陽性的銅綠假單胞菌菌株，通過微量稀釋法，測定哌拉西林-他唑巴坦的最小抑菌濃度和扶正解毒化瘀方水提物的最小殺菌濃度，從而確定熒光定量PCR細菌樣本時培養劑中哌拉西林-他唑巴坦和扶正解毒化瘀方水提物的濃度。繪制細菌生長曲線，確定細菌樣本的培養時間。利用實時熒光定量PCR技術檢測藥物干預前后mexB、oprM、mexR的表達量。結果：扶正解毒化瘀方水提物能降低MexAB-OprM外排泵陽性MDRPA菌株的mexB、oprM表達量（P<0.05），同時能增加mexR的表達量（P<0.05）。結論：扶正解毒化瘀方對MDRPA所致肺炎的作用機制之一可能是通過抑制MexAB-OprM外排泵的表達實現的。

關鍵詞?扶正解毒化瘀方;多重耐藥銅綠假單胞菌;外排泵;MexAB-OprM;最小抑菌濃度;生長曲線;實時熒光定量PCR;作用機制

Effects of Fuzheng Jiedu Huayu Decoction on the Expression of Efflux Pump MexAB-OprM of Multidrug-resistant Pseudomonas Aeruginosa

Wang Yuting1，Xu Hongri2，Zhao Shitong1，Cheng Miao1，Yao Xingwei3，Chang Guijiao3，Chen Shilin1，Wang Chengxiang4

（1 Respiratory Department，Dongzhimen Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100700，China; 2 Emergency Department，Beijing University of Chinese Medicine Third Affiliated Hospital，Beijing 100029，China; 3 Clinical Laboratory Department，Dongzhimen Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100700，China; 4 Respiratory Department，Beijing University of Chinese Medicine Third Affiliated Hospital，Beijing 100029，China）

Abstract?Objective：To study the effects of Fuzheng Jiedu Huayu Decoction on the expression of MexAB-OprM efflux pumps in multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa.Methods：The minimum inhibitory concentration of piperacillin-tazobactam and the minimum bactericidal concentration of the water extract of Fuzheng Jiedu Huayu Decoction were determined via microdilution method for selected MexAB-OprM positive Pseudomonas aeruginosa strains so as to determine the concentration of piperacillin-tazobactam and the water extract of Fuzheng Jiedu Huayu Decoction in the culture medium during the fluorescence quantitative PCR of bacterial samples.The bacterial growth curve was drawn and the culture time of the bacterial samples was determined.The expression levels of mexB，oprM，and mexR before and after drug intervention were detected by real-time fluorescence quantitative PCR technology.Results：The expression levels of mexB and oprM in MexB-OprM efflux pump positive strains were decreased after the intervention of Fuzheng Jiedu Huayu Decoction water extract（P<0.05），and that of mexR was increased than before（P<0.05）.Conclusion：The therapeutic effect of Fuzheng Jiedu Huayu Decoction on pneumonia caused by MDRPA may be attributed to the inhibition of the expression of MexAB-OprM efflux pump.

Key Words?Fuzheng Jiedu Huayu Decoction; Pseudomonas aeruginosa; Efflux pump; MexAB-OprM; Minimum inhibitory concentration; Growth curve; Real-time fluorescence quantitative PCR; Mechanism of action

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.04.014

銅綠假單胞菌（Pseudomonas Areuginas，PA）是醫院感染最常見的病原菌之一，尤以肺部感染最多見。PA耐藥形勢嚴峻，1996—2010年耐藥PA感染所致菌血癥患者病死率由16%升至26%，耐藥PA感染已成為院內感染死亡的主因之一[1-3]。PA因其自身結構的特殊性，對多數抗菌藥物天然耐藥或獲得性耐藥[4]，且耐藥機制復雜[5]，同時由于臨床抗菌藥物的不合理使用，細菌耐藥逐年增加，耐藥機制不斷變化，因此該菌引發的感染性疾病治療難度不斷增加。通過依據不同耐藥機制來尋找或探索相應的抗菌藥物已滯后于臨床需求，難以及時應用于臨床而起到預期的抗菌作用。據NHSN報道，細菌耐藥性的增加明顯限制了抗菌藥物的選擇，在過去20年已加速了抗菌藥物的研發，但針對耐藥PA感染，目前并無療效更好的藥物問世。因此，研發新的高效且低不良反應的藥物迫在眉睫。

本課題組在“十一五”國家科技支撐計劃項目證實，扶正解毒化瘀方在老年性肺炎的治療中，該方較單純應用抗生素能夠顯著改善病程達2周以上患者的呼吸道癥狀，促進炎性反應病灶的吸收，提高病程較長老年患者耐藥菌肺炎的臨床有效率[6]。經初步分析，扶正解毒化瘀方的療效機制可能與干預PA耐藥的相關環節從而逆轉PA的耐藥性，或與抗生素起到協同抑菌增效作用有關。外排泵系統是PA固有耐藥的主要機制，其中MexAB-OprM是最常見的藥物外排系統。本研究將通過觀察扶正解毒化瘀方對多重耐藥銅綠假單胞菌（MDRPA）的MexAB-OprM外排泵表達的影響，深入探索該復方的作用機制。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?菌株?實驗菌株由北京中醫藥大學東直門醫院檢驗科細菌室提供。在從臨床診斷為MDRPA感染所致肺炎患者深部呼吸道分泌物標本中分離、培養、純化、鑒定所得的18株MDRPA的菌株中（編號為P1～P18），利用碳酰-氰-間氯苯腙（CCCP）篩選出MexAB-OprM高表達株P17，-80 ℃冰箱保存備用。質控菌株為ATCC27853。

1.1.2?藥物?扶正解毒化瘀方：黃芩、連翹、漏蘆、赤芍、瓜蔞、西洋參、敗醬草、炒薏苡仁等組成。藥物劑型為北京康仁堂藥業有限公司制備的全有效成分提取配方顆粒。沸水溶解，用0.22 μm過濾器過濾，4 ℃冰箱低溫保存備用。哌拉西林/他唑巴坦（TZP，Wyeth Lederle S.R.L.，產品批號：AKGD/11）購自北京中醫藥大學東直門醫院西藥庫。

1.1.3?試劑與儀器?營養肉湯（賽默飛世爾生物化學制品有限公司，OXOID CM1168，批號1377374），RNAzol RT、RNAprep Pure總提取試劑盒（天根），逆轉錄試劑盒（DBI）;熒光定量PCR檢測試劑盒（Genecopies），DEPC（Vetec）。采用BD Phoenix-100 system全自動細菌分析儀（美國BD公司，型號BD Phoenix），恒溫濕培養箱（上海一恒科技儀器有限公司，型號LHS-250 HC-11），恒溫震蕩器（蘇州培英實驗設備有限公司，型號MSG.N 180L），臺式高速離心機（D3204R SCIlogex），熒光定量PCR儀（7500，ABI），微量核酸定量儀（Merinton，SMA4000）;基因擴增儀（Stratagene Mx3000P）。

1.1.4?引物設計?委托上海生物工程有限公司合成序列。目的基因mexB片斷長度為130 bp，上游引物：5′-TCGAGGAGATCGTCAAGCAA-3′，下游引物：5′-CAGAGGAACACCACCAGCAG-3′。目的基因oprM片斷長度為114 bp，上游引物：5′-ACGCGAAGATCCAGAAGGAC-3′，下游引物：5′-GCAACTGCTCGGTGAAGGTA-3′。目的基因mexR片斷長度為142 bp，上游引物：5′-GCAGCTTCCAGCTCTTCCTC-3′，下游引物：5′-CACTGGTCGAGGAGATGCAC-3′。內參基因rpsL片斷長度為99 bp，上游引物：5′-AACTCGGCACTGCGTAAGGT-3′，下游引物：5′-AACTCGGCACTGCGTAAGGT-3′。

1.2?方法

1.2.1?TZP最小抑菌濃度（MIC）測定?利用微量稀釋法，在96孔板1～10孔中加入100 μL肉湯，第1孔加入配置好的含有4 096 μg/mL TZP的肉湯100 μL，將TZP進行對倍稀釋;再往12、13孔加入200 μL肉湯分別作為陽性和陰性對照;配制菌液，分別往1～11孔中加入已調制好的菌液10 μL，最終接種菌量約為5×105 CFU/mL，重復3行。

上述96孔板振蕩培養18～24 h，放入酶標儀中檢測，參數調整為single，570 nm，讀出相應的OD值。MIC判定標準：抑菌率（%）=（陽性對照OD值-試驗OD值）/（陽性對照OD值-陰性對照OD值）×100≥80%。

1.2.2?扶正解毒化瘀方最小殺菌濃度（MBC）測定??微量稀釋法將中藥水提物對倍稀釋成10個梯度，第1孔濃度為1.56 g/mL，11孔為陽性對照，12孔為陰性對照;配制菌液，往1～11孔中加入已調制好的菌液10 μL，最終接種菌量約為5×105 CFU/mL，重復3行。

上述96孔板振蕩培養18～24 h。實驗結果判定：接種環挑取96孔板中1～10孔內菌液涂至增菌培養基血平板上，37 ℃恒溫濕培養箱靜置培養18～24 h觀察結果。培養出3個菌落以內的濃度為中藥水提物的最小殺菌濃度。

1.2.3?生長曲線測定?取4支50 mL無菌離心管，每只離心管中加入30 mL肉湯，于1、2、3管內加入上述實驗中配置的菌液1.5 mL（菌液終濃度為5×105 CFU/mL），前三管為平行實驗組，第4管不加菌，為陰性對照組。將離心管放置于恒溫震蕩器中進行震蕩培養，溫度37 ℃，轉速200 r/min。在菌液震蕩培養的0～24 h中，每隔1 h使用酶標儀測定菌液的OD570nm值，對OD570nm值用統計軟件進行分析，繪制標準生長曲線，確定PCR實驗中所需MDRPA菌株樣本的最佳培養時間。

1.2.4?實時熒光定量PCR分離提取總RNA?1）培養細菌：挑取單個細菌菌落分別置于含TZP、中藥水提物的營養肉湯及純營養肉湯中，37 ℃過夜振蕩（200 r/min）培養，收集5 mL含菌培養液，10 000 r/min離心1 min，盡量吸凈上清。往沉淀中加入1 mLRNAzol RT，反復吹打裂解細胞，裂解液轉移至2 mL離心管中。2）相分離：每1 mLRNAzol RT加入400 mL ddH2O，蓋上蓋子，振蕩混勻約15 s，室溫靜置5～15 min。10 000 r/min離心15 min。3）沉淀：轉移上清至新的2 mL離心管中，加入等體積的異丙醇，室溫靜置10 min。10 000 r/min離心10 min。4）洗滌棄上清，余下沉淀加入400 μL 75%乙醇，混勻后7 500 r/min離心1～3 min，此步重復1次。5）溶解：棄上清，自然風干沉淀，加入50 μL ddH2O溶解，即為總RNA。

逆轉錄反應：取一PCR管，加入含2 μg RNA的溶液，加入1 μLoligo（dT）15，用無核糖核酸酶的去離子水補足至12 μL，于PCR儀上70 ℃保溫5 min，迅速置冰上冷卻，依次加入4 μL 5×buffer，2 μL 10 mmol/L dNTPs，1 μL RNA inhibitor和1 μL反轉錄酶，用槍抽吸混勻。于PCR儀上42 ℃保溫30 min，結束后80 ℃保溫5 min滅活反轉錄酶。

定量PCR反應：使用All in one qPCR Mix進行定量PCR反應。取0.2 mL PCR管，配制如下反應體系：2×All-in-One qPCR Mix 10.0 μL，PCR forward primer（2 μmol/L）2.0 μL，PCR reverse primer（2 μmol/L）2.0 μL，cDNA 2.0 μL，50×Rox Reference Dye 0.4 μL，ddH2O 3.6 μL。PCR擴增反應條件：95 ℃ 10 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 35 s，共進行40個循環。循環結束后從55 ℃升高到95 ℃獲取熔解曲線。根據標準品反應后所得數值獲得標準曲線，目的基因的反應則根據標準曲線進行定量分析。目的基因初始模板量與內參基因初始模板量的比值，為所測目的基因的相對表達量。

1.3?統計學方法?采用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，方差齊采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），多重比較采用LSD法;方差不齊采用Welch近似方差分析，多重比較采用Dunnett′S T3法。以P<0.05為差異有統計學意義。

2?結果

2.1?微量稀釋法測定TZP的MIC值&nbsp;根據抑菌率≥80%的MIC判定標準得出，P17和ATCC27853菌株TZP的MIC值分別為1 024 μg/mL和2 μg/mL。參照美國臨床和實驗室標準協會（CLSI）標準[7]，MIC≤16 μg/mL即為敏感，ATCC27853 MIC值可以驗證實驗方案的可行性，實驗菌株P17對TZP耐藥。

2.2?微量稀釋法測定中藥水提物的MBC值?將96孔板中1～10孔內菌液接種于血平板上，37 ℃恒溫濕培養箱靜置培養18～24 h，結果顯示只有初始濃度的孔未培養出菌落，最終確定扶正解毒化瘀方水提物的MBC值為0.78 g/mL。

2.3?繪制多重耐藥銅綠假單胞菌的標準生長曲線??酶標儀測得培養24 h的MDRPA實驗管及陰性對照管的OD570nm值。見表1。

OD570nm值反應菌液的濃度，OD570nm值越大菌液濃度越大，細菌生長數量越多。由上表可見在24 h內隨著培養時間的增加細菌OD570nm值逐漸增大，說明培養劑中的MDRPA生長、繁殖菌量逐漸增多。以培養時間為橫坐標，OD570nm值為縱坐標，繪制實驗菌株P17的標準生長曲線。結果提示，在0～6 h細菌進入新的營養環境的適應階段，細菌分裂很少，細菌數量增加不明顯，為遲緩期，此階段為細菌下一階段的分裂增殖做準備。在6～21 h進入細菌的快速分裂增值增殖階段，以指數方式增加，為指數增長期。21 h后隨著培養基中營養物質的消耗，代謝產物的累積，細菌的增殖和死亡達到平衡，細菌量維持在一定水平，進入平穩期。細菌在指數增長期基因復制處于較高水平，因此實驗菌株P17在進行實時熒光定量PCR實驗時，最佳的菌株樣本制備時間為18～21 h。見圖1。

2.4?實時熒光定量PCR測定扶正解毒化瘀方對MexAB-OprM外排泵表達的影響?根據預實驗結果，實時熒光定量PCR菌株樣本制備的營養基中TZP組TZP的濃度為1/32MIC值，即32 μg/mL;扶正解毒化瘀方水提物的濃度為1/4MBC值，即0.195 g/mL。單純營養肉湯培養的菌株樣本作為空白對照組。空白對照組、TZP組、扶正解毒化瘀方水提物組mexB、oprM、mexR的表達量之間差異均有統計學意義（P<0.05）。扶正解毒化瘀方水提物干預組mexB、oprM的表達量較空白組降低，TZP組較空白組增高。經TZP干預組和扶正解毒化瘀方水提物干預組mexR表達量均高于空白組，TZP干預組較扶正解毒化瘀方水提物干預組升高明顯。見表2。

3?討論

主動外排系統的過度表達是PA固有耐藥的重要原因之一。1993年，首次報道PA外排泵的表達。許多革蘭氏陰性桿菌均有外排泵，PA外排泵是一種質子泵，可將多種藥物泵出細胞并參從而產生多重耐藥[8]。根據PA全基因組序列分析，推測該菌至少有12種主動外排系統，至今已經通過基因檢測發現了7種[9]。MexAB-OprM是在PA中發現的最主要的外排系統，也是臨床上最常見的藥物外排系統。MexAB-OprM具有最廣的底物特異性，包括β-內酰胺類、β-內酰胺酶抑制劑、喹諾酮類、大環內酯類、四環素類、氯霉素類、新生霉素類、磺胺類及甲氧芐氨嘧啶，可導致野生型PA對上述藥物耐藥[10]。目前研究[11-14]表明，MexAB-OprM是惟一的確定存在于野生型PA中的外排蛋白，對其天生的耐藥性起重要作用而MexAB-OprM的失活可恢復野生型PA對多種抗菌藥物的敏感性。MexAB-OprM由MexAB-OprM操縱子mexO編碼，mexR、nalC、nalD基因可負性調節操縱子mexO的表達，使mexR基因突變失活。mexB和oprM基因位于同一個操縱子，mexR是MexAB-OprM操縱子的上游基因序列，控制產生MexAB-OprM的阻遏蛋白MexR[15]，mexR的表達量增加，則會抑制MexAB-OprM外排泵基因的表達。

盡管抗菌藥物的使用目前仍然是臨床上治療耐藥菌感染最為常用的手段，但由于PA耐藥機制復雜，抗生素的選擇壓力逐年增加。中醫藥是一個偉大的寶庫，對于感染性疾病的治療具有豐富的理論和臨床實踐基礎。近年來中藥治療耐藥菌感染的研究進展較快，取得了較為積極的成果。林冬玲[16]等發現加味銀翹散可通過降低PA外膜蛋白OprD2的表達而減弱其耐藥性。李少濱等[17]證實黃芩苷能夠體外抑制PA生物膜的形成，從而降低PA的耐藥性。

王淋荊等[18]發現中藥穿心蓮、金銀花、夏枯草和五倍子可通過促進外排泵基因的表達拮抗抗生素的抗菌作用。

本課題組在臨床研究療效肯定的基礎上，選用MDRPA最為重要的外排泵耐藥機制為切入點，對扶正解毒化瘀方延緩或逆轉MDRPA耐藥性的相關機理進行深入研究。利用泵抑制劑和PCR法篩選出MexAB-OprM外排泵陽性的菌株，并對其用TZP和扶正解毒化瘀方水提物進行干預培養。實時熒光定量PCR檢測結果顯示，扶正解毒化瘀方水提物干預后oprM的表達量降低（P<0.05），mexB表達量顯著降低（P<0.05），mexR表達量明顯高于空白組（P<0.05），表明扶正解毒化瘀方治療MDRPA感染所致肺炎的有效性可能是通過直接和間接抑制MexAB-OprM外排泵的表達，降低細菌耐藥實現的。TZP作為半合成青霉素與β-內酰胺酶抑制劑的復合制劑，除其本身殺菌作用外，還可以通過促進產生阻遏蛋白MexR，而抑制MexAB-OprM外排泵基因的表達，從而降低細菌耐藥性。

近年來對中藥抑菌作用的研究涉及到體外研究與體內研究。體外研究多從單味中藥或中藥復方對細菌的直接抑菌作用入手探討中藥的抑菌機制。但綜合分析目前中藥的體外抑菌研究，未能得出令人滿意的結果。并且，在組方用藥方面，目前的體外實驗用藥多局限于清熱解毒類藥物，較少涉及含有扶正類藥物的中藥復方。因此，進一步的研究，應在傳統中醫理論的指導下，辨病與辨證相結合，更加重視耐藥菌感染肺炎病機中正氣不足的因素，采用更為切合病機的中藥復方進行干預，深入挖掘中藥在直接抑菌、逆轉PA耐藥及與抗生素協同抑菌等方面的作用機制和巨大潛力，從而多角度、多層面探索中醫藥對于耐藥菌感染性疾病的療效機制。

參考文獻

[1]Werth B J，Carreno J J，Reveles K R.Shifting trends in the incidence of Pseudomonas aeruginosa septicemia in hospitalized adults in the United States from 1996-2010[J].American journal of infection control，2015，43（5）：465-468.

[2]Thaden JT，Park LP，Maskarinec SA，et al.Results from a 13-year prospective cohort study show increased mortality associated with bloodstream infections caused by Pseudomonas aeruginosa compared to other bacteria[J].Antimicrobial agents and chemotherapy，2017，61（6）：e02671-16.

[3]Gonalves I R，Dantas R C C，Ferreira M L，et al.Carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa：association with virulence genes and biofilm formation[J].brazilian journal of microbiology，2017，48（2）：211-217.

[4]曾為倫，吳海鷗，章如玲，等.多重耐藥銅綠假單胞菌的相關耐藥機制研究[J].中國抗生素雜志，2016，41（5）：377-381.

[5]謝朝云，蒙桂鸞等.耐多藥銅綠假單胞菌感染臨床特征及相關因素分析[J].中華醫院感染學雜志，2018，28（11）：1617-1620.

[6]Xu H，Li M，Wang C，et al.Evaluation on clinical efficacy of Fuzheng Jiedu Huayu Decoction combined with antibiotics in the treatment of pneumonia in the elderly-A multi-center，double-blind，parallel，randomized controlled trial[J].Complementary therapies in medicine，2018，37：127-132.

[7]Performance standards for antimicrobial susceptibility testing.Twenty-seventh informational supplement[S].CLSI documents M100-S27，CLSI，2017：40-42.

[8]Soto SM.Role of efflux pumps in the antibiotic resistance of bacteria embedded in a biofilm[J].Virulence，2013，4（3）：223-229.

[9]Li Y，Mima T，Komori Y，et al.A newmember of the tripartite multidrug efflux pumps，MexVW-OprM，in Pseudomonas aeruginosa[J].J Antimicrob Agents Chem-other，2003，47（3）：1101-1111.

[10]S.Islam，H.Oh，S.Jalal，F.Karpati，O.Ciofu，N.Hoiby，B.Wretlind.Chromos-omal mechanisms of aminoglycoside resistance in Pseudomonas aeruginosa isolates from cystic fibrosis patients[J].Clinical Microbiology and Infection，2009，15（1）：345-348.

[11]Choudhury D，Ghosh A，Dhar C D，et al.Premature Termination of MexR Leads to Overexpression of MexAB-OprM Efflux Pump in Pseudomonas aeruginosa in a Tertiary Referral Hospital in India[J].Plos One，2016，11（2）：e0149156.

[12]Anandapadamanaban M，Pilstl R，Andresen C，et al.Mutation-induced population shift in the MexR conformational ensemble disengages DNA binding：a novel mechanism for MarR family derepression[J].Structure，2016，24（8）：1311-1321.

[13]Suresh M，Nithya N，Jayasree P R，et al.Mutational analyses of regulatory genes，mexR，nalC，nalD，and mexZ，of mexAB-oprM，and mexXY，operons，in efflux pump hyperexpressing multidrug-resistant clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa[J].World Journal of Microbiology & Biotechnology，2018，34（6）：83.

[14]魏光，葉英，鄭美娟，等.碳青霉烯類耐藥銅綠假單胞菌外排泵MexAB-OprM的研究[J].中國感染與化療雜志，2015，15（3）：193-198.

[15]Starr L M，Fruci M，Poole K.Pentachlorophenol Induction of the Pseudomonas aeruginosa mexAB-oprM Efflux Operon：Involvement of Repressors NalC and MexR and the Antirepressor ArmR[J].PLoS ONE，2012，7（2）：e32684-e32684.

[16]林冬玲，伍彬寧，等.加味銀翹散對銅綠假單胞菌外膜蛋白OprD2干預作用[J].中國熱帶醫學，2017，17（12）：1181-1183，1228.

[17]李少濱，方泓，成顏琦，等.黃芩苷、黃芪甲苷對銅綠假單胞菌生物膜的體外干預實驗研究[J].上海中醫藥雜志，2017，51（11）：63-67，83.

[18]王淋荊，曾建明，魯洋，等.中藥對多重耐藥銅綠假單胞菌外排泵的作用研究[J].分子診斷與治療雜志，2017，9（06）：401-407，362.