HPLC法測定獼猴桃果皮轉(zhuǎn)化液中乙酰丙酸含量

陳小敏　譚書明　王瑞　唐明權(quán)

摘 要：本文建立HPLC法檢測獼猴桃果皮轉(zhuǎn)化液中乙酰丙酸的含量。色譜柱為Agilent HC-C18柱（150 mm×4.6 mm×5 μm），甲醇-水體系（12：88）為流動相，柱溫30℃，進樣體積 5 μL ，檢測波長266 nm，流速 0.5 mL/min，等濃度洗脫，外標法定量。結(jié)果表明：在0.2 mg/mL～1.0 mg/mL濃度范圍內(nèi)，線性關系良好，得到儀器的最低檢出限為0.001 mg/kg，加標回收率（n=9）在 88.96%～97.97%范圍內(nèi)，儀器精密度RSD為1.077%，方法精密度RSD為4.275%。在此色譜條件下測得獼猴桃果皮轉(zhuǎn)化液中乙酰丙酸的含量為1.387 mg/mL。

關鍵詞：乙酰丙酸;獼猴桃;高效液相色譜法

中圖分類號：TS201

文獻標識碼：A

文章編號：1008-0457（2019）04-0076-05 國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2019.04.014

Determinetion of Levulinic Acid in Kiwi Fruit Peel Transforming Liquid by HPLC

CHEN Xiao-min1，TAN Shu-ming2*，WANG Rui3，TANG Ming-quan3

（1. College of Brewing and Food Engineering，Guizhou University，Guiyang，Guizhou 550025，China;2.College of Life Science，Guizhou University，Guiyang，Guizhou 550025，China;3. School of Food and Pharmaceutical Engineering，Guiyang College，Guiyang，Guizhou 550003，China）

Abstract：HPLC method was established to detect the content of transformation solution of levulinic acid in kiwi fruit peel. Methods： Chromatographic column was Agilent HC-C18 column （150 mm x 4.6 mm x 5 microns），methanol-water system （12：88） as mobile phase at a flow rate of 0.5 mL/min，the column temperature was 30 ℃，the injecting volume was 5 uL and the detection wavelength was at 266 nm，Elution of the same concentration，quantitative by external standard method. Results： The method was good linear correlation within the range of 0.2 mg/mL ～ 1.0 mg/mL for levulinic acid，and the minimum detection limit of the instrument was 0.001 mg/kg. The levulinic acid standard recovery （n=9） were within the range of 88.96% ～ 97.97%，the precision RSD of the instrument was 1.077% and the method was 4.275%. For all conditions to measurement what the content of levulinic acid was 1.387 mg/mL.

Key words：Levulinic acid; Kiwi fruit; HPLC

隨著社會的快速發(fā)展，化石能源的枯竭，不可再生資源的供應緊張及使用石油資源等引起的溫室效應、臭氧層破環(huán)、酸雨等問題，已成為全球人民熱議的話題。所以，人們尋找新的替代能源已成為當今社會刻不容緩的問題。生物質(zhì)因其儲存量豐富、可持續(xù)發(fā)展、對環(huán)境破壞小等特點被視為未來最重要的可替代能源之一[1-2]。生物質(zhì)是指通過光合作用而產(chǎn)生可再生的或可循環(huán)的有機物質(zhì)，化學組分可分為木質(zhì)纖維素、淀粉和油脂[3]。隨著研究的不斷深入，通過生物質(zhì)反應得到的價格低廉、用途廣泛的綠色平臺化合物逐漸成為人們關注的熱點。

美國報告和2010年新修訂的平臺化合物中指出了乙酰丙酸是一種具有代表性的綠色平臺化合物[4-6]。乙酰丙酸 （ Levulinic acid，LA ） ，又名左旋糖酸或果糖酸[7]。可通過木質(zhì)纖維素水解得到，而且因其官能團特性使其能夠通過多種化學反應來制備各種高附加值化學品[8]。衍生出來的化學品在電子產(chǎn)品、香料、食品、化妝品、醫(yī)藥、燃料等領域應用廣泛[9-10]。所以對乙酰丙酸的研究與測定必不可少，目前乙酰丙酸的檢測方法有薄層掃描法[11]、香草醛-硫酸法[12-13]、離子色譜法[14-15]、氣相色譜法等[16-17]。但每種方法都有不足之處，薄層掃描法對乙酰丙酸的測定只能半定量、香草醛-硫酸法只能定性不能準確定量、氣相色譜法前處理復雜，成本高、離子色譜法設備要求高，裝置復雜，色譜柱非常昂貴，整個過程耗時長。高效液相色譜（high performance liquid chromatogram，HPLC） 法因處理樣品簡單、快速，且能同時測定幾種成分而被廣泛應用于各類化合物的檢測[18]。通過對以上檢測方法的比較與參考，本文以獼猴桃果皮為生物質(zhì)原料來制備乙酰丙酸，建立高效液相色譜法對獼猴桃轉(zhuǎn)化液中乙酰丙酸的含量進行檢測，尋找一種更快速、便捷、有效的檢測方法，為乙酰丙酸的檢測尋找更多、更有效的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

獼猴桃：購于貴州省貴陽市修文縣。

1.2 試劑

乙酰丙酸、分析純：北京百靈威科技有限公司;甲醇，AR：Aladdin Chemistry Co;純凈水：實驗室自制。

1.3 儀器

LC-15C高效液相色譜儀：日本島津公司;KQ5200DB數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司;MA110電子天平：上海良平儀器儀表有限公司;UV-2700紫外分光光度計：島津企業(yè)管理（中國）有限公司。

1.4 方法

1.4.1 標準品溶液的制備

精密稱取 0.50026 g（精確至0.0001 g）乙酰丙酸標準品，用純凈水配成濃度為 100 mg/mL 的標準儲備液，避光保存于4℃冰箱備用。

1.4.2 樣品溶液的制備

量取獼猴桃果皮壓榨制備的汁液25 mL，稱取經(jīng)氨水滴定法并高溫煅燒過所制得的催化劑P2O5 0.5 g，兩者同時加入高溫反應釜中在 190℃ 高溫下反應 20 min提取獼猴桃汁液中的乙酰丙酸，過濾并定容到50 mL 的容量瓶中得樣品液1瓶。用100～1000 uL 的移液槍取 2 mL的樣品溶液于 10 mL 的容量瓶中加純凈水至刻度線，搖勻放入 4℃的冰箱備用。

1.4.3 確定最大吸收波長

利用紫外分光光度計在200～450 nm處，對乙酰丙酸標準品進行3次波長掃描取平均值，確定最大紫外吸收波長。

1.4.4 確定最佳流速

確定甲醇-水體系（12∶88）為流動相;色譜柱為Agilent HC-C18柱（150 mm×4.6 mm×5 μm）;柱溫30℃;進樣體積 5 μL ;檢測波長266 nm，更換0.3、0.5、0.8 mL/min三種流速;每種流速條件下分別對乙酰丙酸標樣及乙酰丙酸樣品進樣，比較標樣出峰對應的時間下樣品的分離情況，篩選出最佳的流速。

1.4.5 確定最佳流動相

色譜柱為Agilent HC-C18柱（150 mm×4.6 mm×5 μm）;柱溫30℃;進樣體積 5 μL ;檢測波長266 nm;流速 0.5 mL/min，等濃度洗脫。控制流動相甲醇與水的體積比分別為：10∶90、12∶88、20∶80、30∶70四種比例;在每種流動相比例條件下分別對乙酰丙酸標樣及乙酰丙酸樣品進樣，比較在標樣對應的出峰時間下樣品的出峰情況，觀察乙酰丙酸的分離情況，篩選出最佳流動相比例。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效液相色譜條件

2.1.1 最大吸收波長的測定

利用紫外檢測器，在200～450 nm處對乙酰丙酸標準樣品進行最大紫外吸收波長的掃描，掃描3次取平均值（圖1）。當波長在266 nm時，乙酰丙酸吸光度為1.086達到最大紫外吸收，確定266 nm為乙酰丙酸的最佳檢測波長。

2.1.2 流動相比例

色譜柱為Agilent HC-C18柱（150 mm×4.6 mm×5 μm）;柱溫30℃;進樣體積 5 μL ;檢測波長266 nm;流速 0.5 mL/min，等濃度洗脫。控制流動相甲醇與水的體積比分別為：10∶90、12∶88、20∶80、30∶70四種比例;在每種流動相比例條件下分別對乙酰丙酸標樣及樣品進樣，比較在標樣對應的出峰時間下樣品的出峰情況，觀察乙酰丙酸的分離情況。圖2從上到下流動相水與甲醇比依次為90∶10、88∶12、80∶20、70∶30，可以看出當流動相比例為88∶12時，乙酰丙酸能被很好的分離。

2.1.3 流速的選擇

確定甲醇-水體系（12：88）為流動相;色譜柱為Agilent HC-C18柱（150 mm×4.6 mm×5 μm）;柱溫30℃;進樣體積 5 μL ;檢測波長266 nm，流速分別為：0.3、0.5、0.8 mL/min時，如圖3（從上到下依次為0.3、0.5、0.8 mL/min）可以看出當流速為0.5 mL/min時乙酰丙酸能被很好的分離，沒有雜質(zhì)峰的干擾;當流速為0.3 mL/min時，由于流速較低乙酰丙酸沒有被分離，流速到0.8 mL/min時乙酰丙酸也沒有被分離出來，確定最佳流速為0.5 mL/min。

2.1.4 標準曲線的繪制

精密稱取乙酰丙酸標準品0.50026 g，用純凈水配成濃度為100 mg/mL的標準儲備液，在5支10 mL容量瓶中分別精密量取標準儲備液配制成濃度為：0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的標準溶液。每個濃度的溶液在優(yōu)化的色譜條件下用HPLC重復三次進樣，峰面積取平均值作標準曲線。得到乙酰丙酸標準曲線的線性方程為y=98449x-526.4（y為峰面積，x為乙酰丙酸的濃度）：相關系數(shù)R為0.9999，標準曲線以及線性方程（圖4）。

2.1.5 檢出限

通過實驗得到，當乙酰丙酸達到一定濃度時，色譜柱由于過載，保留時間前移，不能準確定性，根據(jù)信噪比S/N=3計算，該方法檢出限為0.001 mg/kg。

2.1.6 精密度試驗

取濃度為0.60 mg/mL的乙酰丙酸標準品溶液在優(yōu)化的色譜條件下連續(xù)進樣7次，測定峰面積如表1，結(jié)果得到標準品的峰面積RSD為1.077%（n=7），表明儀器的精密度良好。

2.1.7 重復性試驗

取樣品溶液按相同的處理方法平行制備7份樣品進樣液，在優(yōu)化的色譜條件下對7份樣品溶液進行檢測，結(jié)果按表2測定的峰面積來計算，RSD為4.275%（n=7）。

2.1.8 回收率試驗

取已知濃度的獼猴桃轉(zhuǎn)化液9份，加入等體積已知濃度的乙酰丙酸標準溶液，利用高效液相色譜重復檢測3次，計算回收率（如表3），結(jié)果得到平均回收率為88.96%～97.97%。

2.1.9 樣品溶液的測定

將1.4.1和1.4.2中制備的乙酰丙酸標準品溶液和樣品溶液在優(yōu)化的色譜條件下進樣分析檢測。結(jié)果如圖5所示，乙酰丙酸標準品和樣品溶液出峰時間吻合，峰面積為13131，代入公式y(tǒng)=98449x-526.4，經(jīng)過計算得生物質(zhì)轉(zhuǎn)化液中乙酰丙酸的含量為1.387mg/mL。

3 結(jié)論與討論

乙酰丙酸是一種具有代表性的綠色平臺化合物，可通過生物質(zhì)反應得到，被廣泛的應用于醫(yī)藥、農(nóng)藥、有機合成中間體、香料原料、聚合物、塑料改性劑、樹脂、潤滑油、橡膠助劑、印刷油墨及涂料的添加劑等，涉及到化工、醫(yī)藥、化妝品、食品、紡織、電子產(chǎn)品等眾多領域。因此，建立一種高效、快速、專屬性強、操作簡單的檢測方法意義重大。

本文建立了獼猴桃果皮轉(zhuǎn)化液中乙酰丙酸的 HPLC 檢測方法，最佳的色譜條件為：流動相 A 為 88%的水溶液，流動相 B 為 12%的水溶液，色譜柱AgilentHC-C18柱（150 mm×4.6 mm×5 μm），柱溫30℃，檢測波長 266 nm，流速0.5 mL/min，進樣體積 5 μL，等濃度洗脫。在此色譜條件下，得到乙酰丙酸標準曲線的線性方程為y=98449x-526.4（y為峰面積，x為乙酰丙酸的濃度）：相關系數(shù)R為0.9999，在 0.2 mg/mL～1 mg/mL 范圍內(nèi)線性關系良好;平均回收率為88.96%～97.97%，表明方法準確可信。精密度RSD為1.077%（n=7），變異系數(shù)低于 2%，表明儀器的精密度良好。

利用建立的色譜條件檢測出獼猴桃果皮轉(zhuǎn)化液中乙酰丙酸的含量為1.387 mg/mL。但本文不足之處是只用一種生物質(zhì)轉(zhuǎn)化液來進行檢測，如果利用不同的生物質(zhì)轉(zhuǎn)化液來檢測其中的乙酰丙酸含量，其結(jié)果更具有說服力。

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