恩諾沙星曝露下企鵝珍珠貝腸道微生物多樣性及優勢菌變化規律

陳明強 李有寧 鄧正華 于剛 馬振華 鄭興 洪嘉煒 魏海軍 王雨

摘要：【目的】明確恩諾沙星曝露下企鵝珍珠貝腸道微生物群落結構尤其是優勢菌的變化規律，為企鵝珍珠貝養殖過程中恩諾沙星的科學用藥提供參考依據。【方法】針對3個恩諾沙星濃度（0、5和10 mg/L）共9個企鵝珍珠貝腸道樣本中的細菌構建16S rRNA文庫，再采用Illlumina高通量測序技術從門和屬水平上比較分析各處理組間腸道微生物群落結構和多樣性的差異。【結果】從9個企鵝珍珠貝腸道樣本中共檢測到10個菌門，其優勢菌門分別是變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、梭桿菌門（Fusobacteria）、螺旋體門（Spirochaetae）、藍藻門（Cyanobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes）;共檢測到79個菌屬，優勢菌屬主要包括弧菌屬（Vibrio）、發光桿菌屬（Photobacterium）、嗜冷菌屬（Psychrilyobacter）、假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonas）、疏螺旋體屬（Borrelia）、交替單胞菌屬（Alteromonas）、微擬球藻屬（Nannochioropsis-oceanica）、弓形桿菌屬（Arcobacter）、Thalassotalea、Amphritea、Tenacibaculum和微小桿菌屬（Exiguobacterium）等。不同恩諾沙星濃度處理下，企鵝珍珠貝腸道的優勢菌門與菌屬種類豐度差異明顯。經恩諾沙星處理后，企鵝珍珠貝腸道變形菌門相對豐度顯著升高（P<0.05，下同）、擬桿菌門相對豐度顯著降低;弧菌屬相對豐度顯著升高，微擬球藻屬、Aquibacter、BD1-7_clade及希瓦氏菌屬（Shewanella）相對豐度則顯著降低;此外，弓形桿菌屬相對豐度經10 mg/L恩諾沙星處理后顯著升高，Psychrobium相對豐度經5 mg/L恩諾沙星處理后顯著升高。【結論】經恩諾沙星處理后企鵝珍珠貝腸道微生物的多樣性與豐度發生明顯變化，且腸道微生物中一些具有特殊功能的優勢菌群結構比例也發生變化，該變化規律可為企鵝珍珠貝養殖過程中科學使用恩諾沙星提供參考依據。

關鍵詞： 企鵝珍珠貝;恩諾沙星;腸道微生物;菌群結構;多樣性;相對豐度;高通量測序

中圖分類號： S968.316? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）04-0851-09

Abstract：【Objective】Intestinal microbial diversity and dominant bacteria change analysis of Pteria penguin （R?ding） under enrofloxacin exposure were studied to provide reference for scientific administration of enrofloxacin du-ring P. penguin culture. 【Method】The bacterial 16S rRNA library was constructed using the nine P. penguin intestinal bacteria samples under three enrofloxacin concentrations（0，5 and 10 mg/L）. The differences in intestinal microbial structure and diversity were analyzed and compared among the groups at phylum level and genus level. 【Result】The analysis showed that， ten phyla were detected from the nine P. penguin intestinal samples， and the core phyla included Proteobacteria， Bacteroidetes， Fusobacteria， Spirochaetae， Cyanobacteria and Firmicutes. And 79 genera were detected， the dominant genera included Vibrio， Photobacterium， Psychrilyobacter， Pseudoalteromonas， Borrelia， Alteromonas， Nannochioropsis-oceanica， Arcobacter， Thalassotalea， Amphritea， Tenacibaculum and Exiguobacterium. After different enrofloxacin concentrations treatments， the abundance of dominant bacteria phyla and genera of P. penguin intestinal tract differed greatly. The relative abundance of Proteobacteria increased significantly under enrofloxacin treatment（P<0.05， the same below）， while that of Bacteroidertes decreased significantly. Relative abundance of Arcobacter was significantly increased， and relative abundance of Nannochloropsis， Aquibacte， BD1-7_clade and Shewanella were decreased significantly. Relative abundance of Arcobacter significantly increased after treated by 10 mg/L enrofloxacin， and relative abundance of Psychrobium significantly increased after treated by 5 mg/L enrofloxacin. 【Conclusion】The results indicate that enrofloxacin treatment can greatly change the intestinal microbial diversity and abundance in P. penguin， the proportions of dominant microbial community structure with specific functions also change. The findings in the present study can be served to the scientific administration of enrofloxacin during aquaculture of P. penguin.

Key words： Pteria penguin（R?ding）; enrofloxacin; intestinal microorganism; microbial community structure; diversity; relative abundance; high-throughput sequencing

0 引言

【研究意義】企鵝珍珠貝[Pteria penguin（R?ding）]是一種熱帶、亞熱帶的大型海產經濟雙殼貝類，主要分布于日本九州南部、琉球群島、菲律賓及我國廣東、廣西、海南、臺灣等沿海地區（栗志民等，2011），具有適應環境能力強、生長和分泌珍珠質速度快的特點（余祥勇等，2005;梁飛龍等，2014），已成為我國培育大型海水附殼珍珠及游離正圓珍珠的主要貝種。但由于養殖海區海水環境的污染惡化及養殖病害的暴發，已嚴重制約海洋貝類產業健康發展，其中由細菌引起的疾病最明顯（李啟蒙，2017）。恩諾沙星（Enrofloxacin）屬于氟喹諾酮類藥物，是一種高效廣譜的抗菌藥物，已廣泛應用于動物細菌性疾病治療，其作用原理是選擇性抑制微生物的DNA拓撲異構酶Ⅱ，使其DNA無法復制。恩諾沙星具有抗菌譜廣、組織濃度高、吸收性好、半衰期長等優點，且與其他抗菌藥物不會發生交叉耐藥，能有效預防多種水產細菌性疾病，現已廣泛應用于水產養殖（Balaje et al.，2013）。因此，明確恩諾沙星對企鵝珍珠貝腸道細菌多樣性的影響，對指導企鵝珍珠貝養殖過程中科學使用恩諾沙星具有重要意義。【前人研究進展】目前，有關企鵝珍珠貝的研究主要集中在人工育苗（余祥勇等，2000;Wassnig and Southgate，2012）、珍珠人工培育（符韶和梁飛龍，2000;毛勇等，2004）、生殖細胞發生（Arijarasirikoon et al.，2004）、同工酶特征與遺傳分析（余祥勇等，2004）、母貝養殖培育（符韶等，2007;郭華陽等，2016）、相關基因克隆及表達響應等方面（邱瑩等，2016）。近年來，隨著企鵝珍珠貝養殖規模的不斷擴大，其病害頻繁發生。梁飛龍等（2007）對流沙灣養殖的企鵝珍珠貝多毛類寄生蟲病進行調查，結果發現，形籠養殖2～4年的企鵝珍珠貝母貝多毛類寄生蟲病感染率為39.13%～44.98%，而開放式養殖2～4年的感染率為26.6%～35.63%，說明企鵝珍珠貝多毛類寄生蟲病感染率與養殖方式間存在一定的相關性;程贊等（2011）研究表明，企鵝珍珠貝夏、秋兩季的污損生物優勢種群有海綿、才女蟲、盤管蟲、龍介蟲、藤壺和海鞘，春、冬兩季的污損生物優勢種群包含藤壺和草苔蟲。至今，國內外研究報道的貝類致病性細菌主要有愛德華氏菌（Edwardsiella tarda）、屈橈桿菌（Flexibacter maritimus）、加氏乳球菌（Lactococcus garvieae）、分枝桿菌（Mycobacterium sp.）、假單胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）、溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）等（陸彤霞等，2002;Sakatoku et al.，2018），但有關珍珠貝細菌性疾病方面的研究鮮見報道。【本研究切入點】在水產養殖業使用的抗菌藥物中，恩諾沙星是廣大養殖戶普遍認可的高效抗菌藥物之一，但至今鮮見恩諾沙星用于企鵝珍珠貝細菌類病害防治的研究報道。【擬解決的關鍵問題】利用Illumina平臺第三代測序技術研究恩諾沙星對企鵝珍珠貝腸道微生物多樣性的影響，明確恩諾沙星處理下企鵝珍珠貝腸道微生物群落結構尤其是優勢菌的變化規律，為企鵝珍珠貝養殖過程中恩諾沙星的科學用藥提供參考依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

試驗用企鵝珍珠貝購自海南陵水新村市場，運回中國水產科學研究院南海水產研究所熱帶水產研究開發中心基地，參照蒙釗美等（1996）的管理方法暫養2周。企鵝珍珠貝規格：殼長115.52±3.93 mm，殼高127.16±8.72 mm，殼寬44.99±5.09 mm，體重279.97±64.46 g。

1. 2 試驗設計與取樣

稱取恩諾沙星晶體，溶解于裝有砂濾海水的3個玻璃鋼桶（體積400 L）中，使恩諾沙星濃度分別為0、5和10 mg/L（Fang et al.，2012），標號為PPA、PPB和PPC;然后將30只健康的企鵝珍珠貝平均分配懸吊在玻璃鋼桶中，每桶各10只，試驗開始后停止投喂。企鵝珍珠貝在恩諾沙星海水溶液中浸泡24 h。從每處理組中隨機挑取3只企鵝珍珠貝，做好標記，其中，0 mg/L處理標號PPA1、PPA2和PPA3，5 mg/L處理標號PPB1、PPB2和PPB3，10 mg/L處理標號PPC1、PPC2和PPC3。用解剖刀切斷企鵝珍珠貝閉殼肌，取出其內臟團，以無菌海水將內臟團沖洗干凈后無菌條件下采集其腸道，無菌水沖洗干凈，采用75%乙醇浸泡3 min，再用無菌水沖洗3次，然后將腸道內容物放入1.5 mL的無菌離心管中，-80 ℃保存備用。

1. 3 PCR擴增及基因文庫構建

采用E.Z.N.A? DNA試劑盒（OMEGA Bio-tek）提取企鵝珍珠貝腸道基因組總DNA，采用Qubit? 3.0熒光光度計及瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA含量和質量。PCR擴增以20～30 ng DNA為模板，選取16S rDNA序列V3～V4可變區用于后期的分類分析。針對V3～V4保守區域，以Illumina MiSeq平臺設計特異性引物（5'-CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT-3'和5'-GGACTACNVGGGTWTCTAATCC-3'），通過PCR擴增腸道細菌16S rDNA序列V3～V4兩個高度可變區。PCR擴增產物末端加入適配接頭，以便于后期的Miseq上機測序。PCR反應體系25.0 μL：2.5 μL TransStart緩沖液，2.0 μL dNTPs，上、下游引物各1.0 μL，20 ng DNA模板，去離子水補足至25.0 μL。擴增程序：94 ℃預變性3 min;94 ℃ 5 s，57 ℃ 90 s，72 ℃ 10 s，進行24個循環;72 ℃延伸5 min。PCR擴增產物采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行質量檢測，然后按照Quick Gel提取試劑盒（QIAGEN公司）進行分離與純化。3次重復。純化PCR擴增產物用于基因文庫構建及高通量測序。

1. 4 生物信息學分析

基因文庫采用Qubit 3.0分光光度計檢測濃度，并定量至10 nM，然后按照說明將其上樣至Illumina MiSeq設備進行高通量測序（Illumina，San Diego，CA，USA），采用PE 250/300進行配對末端測序，并以MiSeq設備附帶的the MiSeq控制軟件進行圖片分析及堿基核對。測序后加入末端配對的讀碼框，根據條形碼、切斷條形碼及引物序列對樣本進行分類分析（Schloss et al.，2009）。根據連接序列進行質量過濾，對未達以下標準的序列進行拋棄：序列長度<200 bp，無模棱兩可的堿基，平均質量分數≥20。然后，根據參考數據庫（RDP gold database）進行數據比對，采用Uchime鹽酸法推測一些不合理的序列并去除。

原始數據經Flash拼接、Qiime過濾和Uchime Algorithm去除嵌合體后，即得到有效數據（Caporaso et al.，2010），計算每個樣品的α多樣性。再用Uparse對有效數據在97%水平上的操作分類單元（Operational taxonomic unit，OTU）進行聚類，并用基于Green Gene數據庫的RDP Classifier分類工具進行物種注釋。稀釋曲線采用Mothur v1.30進行分析。

1. 5 統計分析

試驗數據采用SPSS 19.0進行分析，并進行單因素方差分析（One-way ANOVA）。

2 結果與分析

2. 1 序列數與OTU數量統計分析結果

為獲得更高質量及更準確的分析結果，3個處理組（PPA、PPB和PPC）共9個樣本（PPA1、PPA2、PPA3、PPB1、PPB2、PPB3、PPC1、PPC2和PPC3）的原始數據經Cutadapt（v1.9.1）、Vsearch（1.9.6）及Qiime（1.9.1）分析，去除序列拼接中含有N的序列、引物、接頭序列及嵌合體序列，分別獲得43345、44283、82654、52772、127402、45194、128256、44999和51991條有效序列，去除嵌合體后有效序列數目與原始PE reads數目的百分比在83.92%以上。將相似水平在97%以上的所有序列進行OTU劃分和聚類分析，如圖1所示，PPA處理組特有的OTUs為14個，PPB處理組特有的OTUs為12個，PPC處理組特有的OTU為1個，而3個處理組樣本共有OTUs為228個。

2. 2 腸道菌群α多樣性分析結果

如圖2所示，3個處理組9個樣本的稀釋曲線斜率隨測序通量的增大而逐漸降低，最終趨于平坦。同時，以Shannon、Simpson、Chao1和ACE等指數衡量各樣本中微生物的多樣性，其中3個處理組樣本的覆蓋率（Goods_coverage）均高達100.00%（表1）。Rank-Abundance曲線反映出PPC處理組企鵝珍珠貝腸道菌群的豐度及均勻度均最高（圖3）。綜上所述，隨測序深度的增加，測序量已飽和且測序數據量合理，說明各樣本中幾乎所有細菌序列均被檢出。3個處理組樣品的菌群α多樣性因處理不同而存在差異。

2. 3 腸道菌群結構

2. 3. 1 門水平下的企鵝珍珠貝腸道菌群結構 3個處理組9個企鵝珍珠貝樣本的有效序列分別有74.34%、62.98%和63.40%能注釋到門分類水平，共檢測到10個菌門，其相對豐度由高到低分別是變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、梭桿菌門（Fusobacteria）、螺旋體門（Spirochaetae）、藍藻門（Cyanobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、無壁菌門（Tenericutes）、異常球菌—棲熱菌門（Deinococcus-Thermus）、纖維桿菌門（Fibrobacteres）和Gracilibacteria。由圖4可見，PPA處理組的變形菌門相對豐度在50.00%以上，而在PPB和PPC處理組中變形菌門的相對豐度均在75.00%以上。變形菌門、擬桿菌門、梭桿菌門、螺旋體門、藍藻門、厚壁菌門和無壁菌門雖然同為企鵝珍珠貝腸道中的優勢菌門，但其相對豐度發生不同程度的改變（表2）。其中，PPB和PPC處理組企鵝珍珠貝腸道變形菌門相對豐度顯著高于PPA處理組（P<0.05，下同），擬桿菌門相對豐度則顯著低于PPA處理組，但PPB和PPC兩處理組間無顯著差異（P>0.05，下同）;其他優勢菌門在不同處理組間也有差異，但差異不顯著。

2. 3. 2 屬水平下的企鵝珍珠貝腸道菌群結構 3個處理組9個企鵝珍珠貝樣本的有效序列分別有77.80%、91.60%和88.90%能注釋到屬分類水平，共檢測到79個菌屬，其相對豐度較高的菌屬有弧菌屬（Vibrio）、發光桿菌屬（Photobacterium）、嗜冷菌屬（Psychrilyobacter）、假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonas）、疏螺旋體屬（Borrelia）、交替單胞菌屬（Alteromonas）、微似球藻屬（Nannochioropsis-ocea-nica）、弓形桿菌屬（Arcobacter）、Thalassotalea、Amphritea、Tenacibaculum和微小桿菌屬（Exiguobacterium）等。弧菌屬在PPB和PPC處理組中的相對豐度最高，均在50.00%以上。此外，發光桿菌屬、嗜冷菌屬、假交替單胞菌屬、疏螺旋體屬、交替蛋白菌屬、微擬球藻屬和弓形桿菌屬等的相對豐度也較高，均為優勢菌屬（圖5）。由表3可知，經恩諾沙星處理（PPB和PPC處理組）后，企鵝珍珠貝腸道中弧菌屬相對豐度顯著升高，微擬球藻屬、Aquibacter、BD1-7_clade及希瓦氏菌屬相對豐度則顯著降低。PPC處理組企鵝珍珠貝腸道弓形桿菌屬相對豐度顯著高于PPA和PPB處理組;PPB處理組企鵝珍珠貝腸道Psychrobium相對豐度顯著高于PPA和PPC處理組。

3 討論

水產動物腸道內部細菌的數量級一般在105～108（Skrodenyt?-Arba?iauskien?，2007），主要包括變形菌、厚壁菌、假單胞菌和不動桿菌等，其中部分細菌在水產動物的生長及代謝活動中發揮關鍵作用（Skrodenyt?-Arba?iauskien? et al.，2008;Sullam et al.，2012）。機體腸道中各種微生物與宿主的關系非常密切，對其生長、發育和健康均有重要影響，而腸道微生物的群落結構和豐度又受宿主基因型、日齡及棲息環境等因素的影響（Hooper and Gordon，2001;Savas et al.，2005;Navarrete et al.，2012;Meng et al.，2014）。在正常生長環境下，優勢微生物能影響和決定宿主自身微生物的組成、群落結構并維持菌落平衡（Wu et al.，2015），而腸道菌落結構失衡可能會導致宿主疾病發生。本研究結果表明，變形菌門、擬桿菌門、梭桿菌門、螺旋體門、藍藻門、厚壁菌門、無壁菌門、異常球菌—棲熱菌門、纖維桿菌門和Gracilibacteria是企鵝珍珠貝腸道中的優勢菌門，即企鵝珍珠貝腸道菌群的多樣性規律與鯉魚（Ye et al.，2014）、虹鱒（Lyons et al.，2015）及金鯧（Chen et al.，2018）腸道細菌多樣性規律一致。

變形菌門是養殖海水環境或高鹽湖泊環境中最主要的細菌群體之一（Demergasso et al.，2004;Stevens et al.，2005;Wu et al.，2015）;擬桿菌門作為海水環境中的重要微生物類群，是溶解性有機物質的主要消費者（Cottrell and Kirchman，2000）。擬桿菌門中的Flavobacteriia綱是海水養殖中高分子有機物的主要降解者，可能是有機物降解菌群的大量存在有利于加快有機物降解，從而減輕水產動物面臨的環境壓力（陳瓊等，2017）。厚壁菌門中95%細菌16S rDNA序列隸屬梭菌綱，且大部分16S rDNA序列與丁酸產生菌存在相關性，對腸道上皮的維持與保護非常重要。厚壁菌門作為一種典型的GC堿基低含量菌門，也是老鼠和人類等高等生物腸道菌群中豐度最高的菌門，與能量再吸收和脂肪代謝有關（Ley et al.，2006;Komaroff，2017;趙翔剛等，2017）。變形菌門和厚壁菌門是常見的水產動物腸道微生物，對腸道的生理功能起重要作用（Jumpertz et al.，2011）。本研究發現，3個處理組企鵝珍珠貝腸道優勢菌門的相對豐度發生了明顯變化。其中，PPA處理組企鵝珍珠貝腸道變形菌門的相對豐度在50.00%以上，在PPB和PPC處理組中變形菌門顯著升高，其相對豐度均在75.00%以上;而擬桿菌門相對豐度的變化與其恰好相反，PPB和PPC處理組擬桿菌門的相對豐度顯著低于PPA處理組，且PPC處理組擬桿菌門的相對豐度最低。可見，恩諾沙星處理對企鵝珍珠貝腸道優勢菌門相對豐度影響明顯。

微生物鑒定只有在其種或屬的水平上分類才具有意義（Petrosino et al.，2009）。在屬分類水平上，弧菌屬、發光桿菌屬、嗜冷菌屬、假交替單胞菌屬、疏螺旋體屬、交替單胞菌屬、微擬球藻屬、弓形桿菌屬、Thalassotalea、Amphritea、Tenacibaculum和微小桿菌屬為企鵝珍珠貝腸道的優勢菌屬。其中，弧菌屬是海洋環境中的常見細菌屬，與埃希氏菌屬—志賀氏菌屬都是變形菌門的主要菌屬，屬于條件致病菌，在黃鲇魚、草魚和對蝦腸道中均有發現（Oxley et al.，2002;Wu et al.，2010;Hamilton et al.，2013;Tan et al.，2014）。弧菌在養殖水體有機物降解方面具有重要意義，同時發揮著硝酸鹽異化作用，但一些弧菌對珍珠貝等水產動物甚至人類具有潛在的致病性（艾紅等，2003;趙曉偉等，2015;畢水蓮等，2017）。微小桿菌屬也是厚壁菌門的主要菌屬之一，能促進凡納濱對蝦的生長與存活，還能產生大量的消化酶類（張瑩等，2013;Sombatjinda et al.，2014;Pandey and Bhatt，2015;施兆鴻等，2015）。Ward-Rainey等（1996）從黑刺參腸道內分離獲得43株細菌，其中24株為弧菌，為腸道內的核心菌屬，其余分別歸屬于芽孢桿菌屬、放線菌和變形桿菌，與本研究中弧菌在企鵝珍珠貝腸道菌屬結構中的絕對優勢相一致。

假單胞菌可引發海水養殖蝦類爛鰓病、紅腿病等細菌性疾病，還有研究發現假單胞菌具有直接或間接的殺藻作用，尤其與假單胞菌在養殖水體中保持一定數量時有利于對蝦生長;當部分弧菌、假單胞菌和單胞菌等大量存在時，可使對蝦患病（陳瓊等，2017）。本研究結果表明，在不同恩諾沙星處理下企鵝珍珠貝腸道優勢菌屬種類的相對豐度差異明顯。經恩諾沙星處理后，企鵝珍珠貝腸道內弧菌屬相對豐度顯著升高，微擬球藻屬、Aquibacter、BD1-7_clade及希瓦氏菌屬相對豐度則顯著降低;此外，弓形桿菌屬相對豐度經10 mg/L恩諾沙星處理后顯著升高，Psychrobium相對豐度經5 mg/L恩諾沙星處理后顯著升高。說明企鵝珍珠貝經恩諾沙星處理后其腸道內菌群結構發生一定程度的變化，該結論可為企鵝珍珠貝養殖生產過程中科學使用恩諾沙星提供參考依據。

4 結論

經恩諾沙星處理后企鵝珍珠貝腸道微生物的多樣性與豐度發生明顯變化，且腸道微生物中一些具有特殊功能的優勢菌群結構比例也發生變化，該變化規律可為企鵝珍珠貝養殖過程中科學使用恩諾沙星提供參考依據。

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（責任編輯 蘭宗寶）