復合垂直潛流人工濕地中硝化和反硝化細菌的篩選及其特性分析

張成龍 李冰 侯詒然 封功成 陶冶 朱健

摘要：【目的】通過在復合垂直潛流人工濕地系統中篩選高效的硝化細菌和反硝化細菌，以降低氮素污染對養殖水域生態系統的危害，為加強人工濕地氮素凈化功能提供科技支撐。【方法】在復合垂直潛流人工濕地—池塘循環水養殖系統的不同運行階段采集樣品，利用選擇性培養基定向篩選，選擇一株高效硝化細菌和一株高效反硝化細菌，對其進行菌種鑒定，并分別研究對應菌株的硝化特性或反硝化特性?！窘Y果】通過個體形態特征觀察、生理生化鑒定及16S rDNA同源性比對分析，確定硝化菌株ZX2屬于不動桿菌屬（Acinetobacter），反硝化菌株ZF7屬于假單胞菌屬（Pseudomonas）。在pH為7.0，溫度為30 ℃，亞硝酸鈉濃度為0.8 g/L的條件下硝化菌株ZX2的硝化能力最強，OD600可達0.80以上，硝化速率達68.4 mg/（L·d）。在pH為7.0，溫度為35 ℃，接種量為6%的條件下反硝化菌株ZF7的反硝化能力最強，OD600可達1.00以上，脫氮率達94.5%?！窘Y論】篩選得到的硝化細菌和反硝化細菌具有很好的氮素凈化效果，可為下一步強化人工濕地氮素凈化功能提供備用菌株。

關鍵詞： 人工濕地;硝化細菌;反硝化細菌;氮素污染;含氮廢水凈化

中圖分類號： S182? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）04-0736-09

Abstract：【Objective】A high-efficiency nitrifying bacteria and denitrifying bacteria was screened in the integrated vertical subsurface flow constructed wetlands system to reduce the harm of nitrogen pollution to the aquaculture water ecosystem， and provided a theoretical basis for strengthening the nitrogen purification function of the constructed wetlands.【Method】Samples were collected at different operational stages of the integrated vertical subsurface flow constructed wetland-pond recirculating aquaculture system. A selective media was used for targeted screening，then a high-efficiency nitrifying bacteria and a highly efficient denitrifying bacteria were selected for strain identification and studying separately the nitrification or denitrification characteristics of the corresponding strain. 【Result】The nitrifying strain ZX2 was initially identified as Acinetobacter and the denitrifying strain ZF7 was Pseudomonas based on its morphological observation， physio-logical and biochemical tests as well as 16S rDNA phylogenetic analysis. The nitrification ability of nitrifying strain ZX2 was the highest under the conditions of pH 7.0， temperature 30 ℃，and sodium nitrite concentration 0.8 g/L. OD600 value could reach above 0.80，and the nitrification rate reached 68.4 mg/（L·d）. Under the conditions of pH 7， temperature 35 ℃， the inoculum amount 6%，the denitrification capacity of denitrifying strain ZF7 was the highest. OD600 value could reach above 1.00， and the denitrification rate reached 94.5%. 【Conclusion】The nitrifying bacteria and denitrifying bacteria screened in this study have good effect on nitrogen purification， and can provide a spare strain for further strengthening the nitrogen purification function of the constructed wetlands.

Key words： constructed wetland; nitrifying bacteria; denitrifying bacteria;nitrogen pollution; nitrogen-containing wastewater purification

0 引言

【研究意義】發展高密度養殖和集約化管理是我國水產養殖業的發展趨勢，高密度集約化養殖在促進漁業增效和漁民增收的同時，不可避免地帶來養殖水環境污染問題。在水產養殖過程中，魚類排泄物和未被消耗飼料的降解使得養殖水體中的氨氮劇增，氨氮和亞硝酸氮含量過高會對水產養殖動物產生毒害作用，甚至導致大規模死亡現象發生;此外，未經處理的養殖廢水排放到自然水體中也會造成富營養化，嚴重影響水產養殖業的綠色可持續發展（梁新雪，2011;劉國鋒等，2018）。因此，解決高密度水產養殖廢水的凈化問題迫在眉睫。【前人研究進展】目前水產養殖業中氮素凈化應用較廣泛的技術是微生物處理技術和生態處理技術。微生物處理技術是利用硝化或反硝化能力強的微生物對水產養殖廢水進行凈化，具有氮素凈化作用的微生物主要有硝化細菌（王薇等，2007）、紅球菌屬（張艷等，2007）、產堿桿菌屬（王弘宇等，2009）、固氮弧菌屬（王小菊等，2013）、假單胞菌屬（楊浩鋒等，2014）、不動桿菌屬（顏薇芝等，2017）等，但該技術在處理效果、處理成本、推廣適用性等方面尚有待進一步探究。在生態處理技術方面，已有研究表明人工濕地中存在相當數量與氮素凈化相關的菌種（雷旭等，2015），且硝化細菌和反硝化細菌分布狀況在一定程度上受濕地結構和濕地植物的影響（王愛平等，2010）;研究顯示，表面流人工濕地（魯敏等，2012）、水平潛流人工濕地（李寶華等，2013）及垂直潛流人工濕地（董玉峰，2014）對水體中的氮磷、重金屬等有較穩定的處理能力，但隨著使用年限的增長，人工濕地的凈化效率和穩定性必然會下降（尹煒等，2004）。【本研究切入點】復合垂直潛流人工濕地作為生態處理技術的一種典型應用模式，其對于水產養殖廢水氮素的去除效果明顯（董玉峰，2014）。微生物的硝化和反硝化作用是去除氮素的最主要途徑（張鴻等，1999），目前研究報道具有氮素凈化作用的微生物種類較多，但關于復合垂直潛流人工濕地中硝化和反硝化細菌的篩選、鑒定及其特性分析的研究鮮見報道?！緮M解決的關鍵問題】通過特定生境下硝化及反硝化細菌的篩選、鑒定、分析及應用，實現人工濕地氮素處理效率的提升，以期為加強人工濕地氮素凈化功能提供技術支撐。

1 材料與方法

1. 1 試驗地點及概況

1. 1. 1 復合垂直潛流人工濕地—池塘循環水養殖系統結構 試驗地點位于中國水產科學研究院淡水漁業研究中心大浦科研試驗基地。復合垂直潛流人工濕地主要由5個單元構成，即沉淀池、上行垂直潛流濕地、下行垂直潛流濕地、預警池及清水池，面積約600 m2。濕地基質為直徑8～10 cm大鵝卵石、4～6 cm小鵝卵石和2～4 cm生物陶粒。濕地植物為生長周期較長的梭魚草（Pontederia cordata）和再力花（Thalia dealbata），上行池主要種植再力花，下行池種植梭魚草，再力花株距60 cm，梭魚草株距40 cm，種植時間為5月初。池塘養殖鯽魚、團頭魴、鰱魚和鳙魚，密度依次為0.011、0.136、0.020和0.006 kg/m3，每天上午9：00—10：00和下午16：00—17：00投喂飼料。試驗于2017年濕地運行的6—10月進行。復合垂直潛流人工濕地—池塘循環水養殖系統結構如圖1所示。

1. 1. 2 復合垂直潛流人工濕地—池塘循環水養殖系統基本數據 人工濕地水力負荷（HLR）和水力停留時間（HRT）根據公式計算得出。

式中，S為人工濕地主體面積（m2），W為污水設計流量（100 m3/d），γ為人工濕地孔隙度（%），h為人工濕地深度（m）。

復合垂直潛流人工濕地—池塘循環水養殖系統基本數據見表1，不同時間段的人工濕地溫度、pH和溶氧量見表2。

1. 2 樣品采集及培養基制備

1. 2. 1 樣品采集 在濕地運行初期（6月底）、中期（8月底）和末期（10月底），采用三點取樣法在上行池和下行池進行采樣，分別采集濕地植物根系、根系附近基質及植物附近水樣，每個取樣點選取3株相鄰植株進行平行取樣，裝入取樣袋，置于4 ℃環境中冷藏待用。

1. 2. 2 培養基制備 硝化液體富集培養基：亞硝酸鈉1.0 g、硫酸鎂0.5 g、碳酸鈉1.0 g和硫酸亞鐵0.4 g，加蒸餾水定容至l L。該培養液在滅菌前用氫氧化鈉調pH至7.5～8.0，再加0.5 g磷酸氫鉀（磷酸鹽單獨滅菌，且在培養液冷卻至室溫后加入）（王小菊等，2013）。

反硝化液體富集培養基：硝酸鉀2.0 g、硫酸鎂0.2 g、磷酸氫鉀0.5 g和酒石酸鉀鈉20.0 g，加蒸餾水定容至1 L;pH 7.0～7.5（曾慶武等，2008）。

平板分離培養基：在富集培養基中加入約1.8%瓊脂糖即可。

純化培養基：胰蛋白胨10.0 g、酵母提取物5.0 g和氯化鈉10.0 g，加水定容至1 L;氫氧化鈉調pH至7.0。

1. 3 試驗方法

1. 3. 1 細菌篩選 取濕地水樣10 mL、基質若干及適量植物根系加入到含100 mL滅菌蒸餾水的250 mL三角燒瓶中，30 ℃下170 r/min振蕩30 min后，取10 mL上清液加入到含100 mL硝化液體培養基的250 mL三角瓶中，另取10 mL上清液加入到含100 mL反硝化液體培養基的250 mL三角瓶中（夏輝和梁運祥，2006）;在30 ℃、170 r/min條件下，硝化培養液振蕩富集培養10 d（每2 d吸取適量硝化富集液，在白瓷板上與二苯胺試劑發生顯色反應，根據顯色反應判斷液體培養基中亞硝酸根的減少和硝酸根的生成狀況）（胡朝松等，2009），反硝化培養液靜置密閉富集培養3 d。選取顏色變深的硝化培養液和富集培養3 d后的反硝化培養液按稀釋分離方法稀釋至10-2、10-3和10-4 3個稀釋度，分別在硝化細菌和反硝化細菌固體培養基上涂布分離，硝化固體培養基在30 ℃恒溫培養箱中培養10 d左右，反硝化固體培養基培養3 d左右。挑選8株典型單菌落，經溶菌肉湯（LB）培養基多次劃線純化，轉入斜面保存備用。

1. 3. 2 備用菌液培養 將上述分離得到且保存在斜面的單菌株分別接種到含20 mL LB液體培養基的100 mL三角瓶中，28 ℃下170 r/min振蕩培養24 h，作為備用菌液。

1. 3. 3 脫氮率和硝化速率測定 將1.3.2獲得的備用硝化菌液按6%的接種量接種至含有硝化液體培養基的三角瓶中，反硝化菌液按2%的接種量接種至含有反硝化液體培養基的三角瓶中（其中1瓶不接種，作為對照），設3個平行，結果取其平均值。3 d后參照曾慶武等（2008）的方法檢測硝酸鹽和亞硝酸鹽含量，并計算脫氮率，以硝酸鹽降解、亞硝酸鹽積累及脫氮率為反硝化細菌的篩選指標，其中以脫氮率為主要指標。

10 d后利用比色法（國家環境保護總局《水和廢水監測分析方法》編委會，2002）測定亞硝酸根量。硝化速率以單位時間、單位體積培養液轉化亞硝酸根的量（亞硝酸根的減少量）表示（王小菊等，2013）。

式中，C1為不接種樣品中亞硝酸根濃度（mg/L），C0為接種樣品中亞硝酸根濃度（mg/L），t為培養時間（d）。

1. 3. 4 菌種鑒定 選取工作效率最高的硝化和反硝化細菌，參照蔡妙英和東秀珠（2001）的方法進行菌株形態和生理生化鑒定;同時，測定16S rDNA序列和構建系統發育進化樹。

1. 3. 5 菌種特性分析

1. 3. 5. 1 溫度對菌株特性的影響 硝化細菌按備用菌液6%的量接種至含有硝化培養液的三角瓶中（亞硝酸鈉濃度1.0 g/L），反硝化細菌按備用菌液2%的量接種至含有反硝化培養液的三角瓶中。初始pH控制在7.0，溫度依次設為10、20、30、35和40 ℃，以不加菌液的三角瓶為對照，每個試驗3次重復。硝化細菌每24 h測定一次OD600指示菌株的生長情況，5 d后檢測亞硝酸鹽含量，并計算硝化速率;反硝化細菌每6 h測定一次OD600，同時測定硝酸鹽和亞硝酸鹽含量，并計算脫氮率。

1. 3. 5. 2 pH對菌株特性的影響 試驗設計同1.3.5.1，初始溫度控制在30 ℃，pH依次設為5.0、6.0、7.0、8.0和9.0。

1. 3. 5. 3 亞硝酸鈉濃度對硝化特性的影響 試驗設計同1.3.5.1，初始溫度控制在30 ℃，pH控制在7.0，亞硝酸鈉濃度依次設為0.6、0.8、1.0、1.2、1.4和1.6 g/L。

1. 3. 5. 4 接種量對反硝化特性的影響 初始溫度30 ℃，pH 7.0，接種量依次設為2%、4%、6%和8%。每6 h測定一次OD600，48 h后測定硝酸鹽和亞硝酸鹽含量，并計算脫氮率。

1. 3. 6 數據測定方法 硝酸鹽含量采用紫外分光光度法測定;亞硝酸鹽含量采用N-（1-萘基）-乙二胺光度法測定;菌株的生長情況使用可見分光光度法測定。

16S rDNA序列測定由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，所得測序拼接結果提交GenBank進行BLAST比對分析，獲得同源性最高種屬的16S rDNA序列，采用MEGA 5.2的鄰位相連法（Neighbor-joining method）進行系統發育進化樹分析，以確定菌株分類地位。

1. 4 統計分析

采用SPSS 22.0進行單因素方差分析（One-way ANVOA），并進行Duncan’s多重比較。在數據統計分析前，試驗數據需進行正態性和方差齊性檢驗（Zar，1999）。

2 結果與分析

2. 1 硝化和反硝化細菌的篩選鑒定結果

由表3可知，濕地運行不同階段菌株的工作效率有所不同。選擇硝化速率最高的菌株，即濕地運行初期從再力花根基樣品中篩選出的硝化細菌，命名為ZX2;選擇反硝化速率最高的菌株，即濕地運行末期從再力花根基樣品中篩選出的反硝化細菌，命名為ZF7。

硝化菌株ZX2的菌落生態特征及生理生化特征：菌體呈淺褐色球狀，不透明，革蘭氏染色陰性;葡萄糖氧化呈陽性，V-P試驗及甲基紅試驗呈陽性，不能水解淀粉，不利用檸檬酸，不產H2S，不具運動性，過氧化氫試驗、吲哚試驗和氧化酶試驗均呈陰性。根據菌株生態及生理生化特征，結合《伯杰氏細菌鑒定手冊》（布坎南和吉本斯，1984）及16S rDNA序列鑒定結果，可確定ZX2菌株為不動桿菌屬（Acinetobacter）。對菌株ZX2進行系統發育進化樹分析，結果（圖2-A）表明，該菌株與不動桿菌屬中的約氏不動桿菌（A. johnsonii）的遺傳進化距離最近。

反硝化菌株ZF7的菌落生態特征及生理生化特征：菌體呈黃白色圓形，半透明，表面光滑，邊緣整齊，革蘭氏染色陰性;氧化酶試驗呈陽性，精氨酸雙水解酶和硝酸鹽還原陽性，甲基紅和V-P試驗呈陰性，不液化明膠，不水解淀粉。根據菌株生態及生理生化特征，結合《伯杰氏細菌鑒定手冊》（布坎南和吉本斯，1984）及16S rDNA序列鑒定結果，可確定ZF7菌株為假單胞菌屬（Pseudomonas）。對菌株ZF7進行系統發育進化樹分析，結果（圖2-B）表明，該菌株與惡臭假單胞菌（P. putida）的遺傳進化距離最近。

2. 2 菌種特性分析結果

2. 2. 1 溫度的影響 將菌株ZX2按照一定量接入硝化細菌培養液中，不同溫度下菌株ZX2的硝化速率變化如圖3所示。不同溫度對硝化速率有顯著影響（P<0.05，下同），在10～30 ℃范圍內硝化速率隨溫度的升高呈顯著上升趨勢，但溫度超過30 ℃后，硝化速率隨溫度的持續升高而呈下降趨勢。該菌株最適宜的硝化溫度為30 ℃，硝化速率達62.9 mg/（L·d）。

溫度對菌株ZF7反硝化作用脫氮率的影響如圖4所示，不同溫度條件下，菌株ZF7的脫氮率隨培養時間的延長總體上呈逐步上升后趨于穩定的變化趨勢;48 h內菌株ZF7在35 ℃下反硝化能力最強，脫氮效果最佳，最高脫氮率達93.9%，溫度過高或過低均會影響菌株反硝化作用的效率。

通過定時測定培養液OD600的變化來反映菌株的生長狀態，菌株ZX2在不同溫度下的生長變化如圖5-A所示，不同溫度條件下菌株ZX2的OD600隨培養時間的延長總體呈先上升后趨于穩定的變化趨勢，該菌株在30 ℃下細菌濃度最大（0.87），生長狀態最佳;圖5-B反映溫度對菌株ZF7生長的影響情況，菌株ZF7在35 ℃下生長狀態最佳，利用硝酸鹽的能力最強，同時在30和35 ℃條件下，培養48 h OD600均可達1.00以上。

2. 2. 2 pH的影響 在不同pH條件下，菌株ZX2的硝化速率和細菌濃度呈先上升后下降的變化趨勢，且pH為7.0時，菌株ZX2所表現的硝化速率和細菌濃度均最高，分別為68.4 mg/（L·d）和0.72（圖6）。圖7顯示，在不同pH條件下，隨著培養時間的延長，菌株ZF7的脫氮率和細菌濃度呈先上升后趨于穩定的變化趨勢，pH為7.0時，菌株ZF7表現的脫氮率和細菌濃度均最高（分別為94.4%和1.39），培養至48 h，pH 6.0～8.0的脫氮率可維持在80.0%以上，且OD600大于0.80。

2. 2. 3 亞硝酸鈉濃度對菌株ZX2硝化特性的影響 將菌株ZX2按照一定量接種至硝化細菌培養液中，在不同亞硝酸鈉濃度下培養，硝化速率和細菌濃度OD600如圖8所示，隨著亞硝酸鈉濃度的升高，硝化速率和細菌濃度總體呈先上升后下降的變化趨勢;菌株ZX2在亞硝酸鈉濃度為0.8 g/L時的生長狀態最佳，硝化速率最高[65.6 mg/（L·d）]，當亞硝酸濃度高于1.2 g/L后，硝化速率和細菌濃度均迅速下降。

2. 2. 4 接種量對菌株ZF7反硝化特性的影響 圖9顯示，在48 h培養時間內，菌株ZF7在接種量為6%的條件下OD600始終最高，生長狀態最佳（圖9-A）;接種量對脫氮率的影響較小，4個接種量在培養48 h后脫氮率均達80.0%以上，其中6%接種量的脫氮率最高（94.5%），顯著高于4%接種量，與2%和8%接種量的脫氮率差異不顯著（P>0.05）（圖9-B）。

3 討論

3. 1 關于菌種鑒定結果

通過個體形態特征觀察、生理生化鑒定及16S rDNA同源性比對分析，表明篩選的反硝化細菌屬于假單胞菌屬，硝化細菌屬于不動桿菌屬。目前，已報道假單胞菌屬中具有反硝化功能的細菌包括產堿假單胞菌（P. pseudoalcaligenes）（楊基先等，2008）、惡臭假單胞菌（王弘宇等，2009）、施氏假單胞菌（P. stutzeri）（胡國元等，2012）及熒光假單胞菌（P. fluorescens）（連紅民等，2015）。本研究得到反硝化菌株初步鑒定為假單胞菌屬的惡臭假單胞菌。本研究對惡臭假單胞菌的反硝化特性進行分析，發現菌株ZF7具備很強的反硝化脫氮能力，在pH為7.0、溫度為35 ℃，接種量為6%的條件下，其脫氮率可達94.5%，一定程度上加深了對惡臭假單胞菌在氮素凈化特性的認識。

國內外對于具備硝化功能不動桿菌屬的研究較少，但近幾年不動桿菌屬的異養硝化和好氧反硝化特點引起學者的廣泛關注。目前，已報道不動桿菌屬中具有氮凈化功能的細菌包括鮑曼不動桿菌（A. baumannii）（孔慶鑫，2004）、溶血不動桿菌（A. haemolyticus）（劉玉香，2012）、約氏不動桿菌（劉小英等，2016）和瓊氏不動桿菌（A. junii）（顏薇芝等，2017）。金少鋒（2018）在池塘底部篩選的1株不動桿菌對氨氮和硝酸鹽氮具有很好的去除能力，好氧反硝化能力處于較高水平。本研究篩選獲得的硝化細菌初步鑒定為約氏不動桿菌，該菌株在適宜條件下去除氮素的效率可達68.4 mg/（L·d），120 h內對硝氮去除率可達49.2%，去除效率處于較高水平。劉小英等（2016）篩選的約氏不動桿菌在120 h內對硝氮去除率為56.9%，表明約氏不動桿菌有較強的硝化去氮能力，本研究結果與其相吻合。

3. 2 關于菌株ZF7反硝化特性

本研究結果表明，不同接種量下細菌濃度OD600在培養48 h后均可達0.70以上，4個接種量在培養48 h后脫氮率均在80.0%以上，初始接種量對于脫氮率的影響不明顯，由此可得出菌株ZF7在OD600大于0.70后對脫氮率的影響不顯著。顏薇芝等（2017）對1株不動桿菌的脫氮性能研究中也得到類似結果，在不同碳源情況下，當OD600大于1.00以上時，OD600的增加并未使脫氮效率提高。

3. 3 關于篩選菌株應用于氮素凈化

已有學者通過構建小型盆栽人工濕地（陳朋，2009）或利用工業廢水（趙志嵐，2013）對實驗室條件下篩選得到的硝化細菌或反硝化細菌的氮素凈化效果進行相關研究，但目前國內外對于將篩選得到的硝化細菌或反硝化細菌應用于大型人工濕地凈化效果的研究仍較少。本研究通過對復合垂直潛流人工濕地運行期間的pH和溫度進行連續監測，pH變化范圍基本在6.0～8.0，溫度范圍為19～33 ℃。菌株ZF7在該pH和溫度范圍內有很好的生長狀態，OD600可達1.00以上，脫氮率在80.0%以上;菌株ZX2硝化速率在50.0～60.0 mg/（L·d）范圍內波動。表明復合垂直潛流人工濕地運行期間，在pH和溫度的適宜波動范圍內篩選獲得的反硝化細菌和硝化細菌能發揮其氮素凈化效果，但具體效果仍需通過進一步的實際應用來檢驗。

4 結論

本研究從復合垂直潛流人工濕地運行過程中篩選得到氮素去除效果較好的硝化細菌和反硝化細菌，經鑒定硝化細菌屬于不動桿菌屬，反硝化細菌屬于假單胞菌屬。在pH 7.0、溫度30 ℃、亞硝酸鈉濃度0.8 g/L條件下硝化菌株ZX2的硝化能力最強;在pH 7.0、溫度35 ℃，接種量6%條件下反硝化菌株ZF7的反硝化能力最強，即可為下一步強化人工濕地氮素凈化功能提供備用菌株。

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（責任編輯 羅 麗）