艾煙對SAMP8小鼠嗅球形態和嗅球內谷氨酸、γ-氨基丁酸和乙酰膽堿酯酶的影響

左瀅竹 林瑤 趙百孝

摘要 目的：觀察艾煙干預對快速老化SAMP8小鼠嗅球形態和嗅球內谷氨酸（Glu）、γ-氨基丁酸（GaBa）和乙酰膽堿酯酶（AChE）表達的影響，探討艾煙的可能效應途徑。方法：選取6月齡雄性快速老化模型SAMP8小鼠48只并隨機分為艾煙組、模型組、嗅覺障礙組和嗅覺障礙艾煙組，以12只SAMR1作為空白對照組對照。3-甲基吲哚（3-MI）腹腔注射制作嗅覺障礙模型。艾煙組和嗅覺障礙艾煙組每日予以艾煙吸嗅30 min，其余組正常空氣吸嗅。干預6周后通過蘇木精-伊紅（HE）染色觀察各組嗅球形態，并利用酶聯免疫吸附試驗法比較嗅球內Glu、GaBa及AChE表達情況。結果：各組嗅球結構未見明顯差異，艾煙組顆粒細胞密度略高于模型組、嗅覺障礙組和嗅障艾煙組。艾煙組Glu、AChE較模型組顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05），且AChE含量低于嗅覺障礙組，差異有統計學意義（P<0.05）。嗅障艾煙組Glu含量介于模型組和艾煙組之間，3組差異有統計學意義（P<0.05）。結論：一定濃度的艾煙干預可以良性調節嗅球內神經遞質含量，并通過嗅覺通路的神經投射干預腦內神經遞質的表達，改善氧化應激。

關鍵詞 艾煙;嗅球;神經遞質;嗅覺通路;谷氨酸;γ-氨基丁酸;乙酰膽堿酯酶

Abstract Objective：To observe the effects of moxa smoke on the olfactory bulb morphology and the expression of glutamate acid （Glu），gamma-aminobutyric acid （GaBa） and acetylcholinesterase （AChE） in the olfactory bulb of aging SAMP8 mice，in order to explore the possible pathway of moxa smoke effect.Methods：A total of 48 six-month-old male SAMP8 mice were randomly divided into 3 groups：a moxa smoke group，a model group，a dysosmia group and a dysosmia model treated with moxa smoke group.12 SAMR1 mice were used as control group.3-methylindole （3-MI） was injected intraperitoneally to produce an olfactory dysfunction model.The moxa smoke group and dysosmia model treated with moxa smoke group inhaled moxa smoke for 30 min every day.Other groups inhaled normal air.After 6 weeks′ intervention，the morphology of olfactory bulb was observed by HE staining，and the contents of Glu，GaBa and AChE in olfactory bulb were tested by ELISA.Results：There was no significant difference in olfactory bulb structure among the 5 groups.The density of granular cells in the inner plexus layer of the moxa smoke group was slightly higher than that of the model group，the dysosmia group and the dysosmia treated with moxa smoke group.Contents of Glu and AChE in moxa smoke group were significantly lower than those in model group （P<0.01，P<0.05），and its AChE content was lower than that in the dysosmia group （P<0.05）.The content of Glu in dysosmia treated with moxa smoke group was between the model group and the moxa smoke group，and there was significant difference among the 3 groups （P<0.05）.Conclusion：With certain concentration，moxa smoke intervention can benignly regulate the content of neurotransmitters in the olfactory bulb.Through the neural projection of the olfactory pathway，the expression of neurotransmitters in the brain can be interfered and the oxidative stress could be improved.

Key Words Moxa smoke; Olfactory bulb; Neurotransmitter; Olfactory pathway; Glutamate acid; Gamma-aminobutyric; Acetylcholinesterase

中圖分類號：R242文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.05.017

艾葉作為傳統灸材，其燃燒產生的煙霧不但在艾灸過程中發揮重要作用，更可單獨應用治療多種疾病，自古以來便備受推崇。早在《五十二病方》中就記載了以干艾、柳蕈熏燃外治的病案;《肘后備急方》有“以干艾斛許，揉團納瓦甑中，并獨留一目，以痛處著甑目而燒艾熏之”的煙熏操作法;《本草綱目》中亦有“熟艾燒煙薰之……治風蟲牙痛”的闡述。現代藥理學研究發現，艾葉燃燒生成的艾煙含有多種具有抗氧化、抗炎、鎮靜作用的芳香物質[1]，其中許多成分亦常見見于的芳香開竅藥物或精油[2]。部分已被證實是通過嗅覺通路發揮保護腦神經功能[3]，改善學習記憶的作用[4]。本前期研究發現，單純艾煙干預可以治療性提高ApoE-/-及SAMP8小鼠腦內單胺類神經遞質含量，減輕氧化應激，延緩腦組織衰老[5-6]。但艾煙究竟通過何種途徑發揮作用至今尚不明確，可能是通過血腦屏障進入中樞神經系統，也可能經嗅神經傳導通路起效。

本實驗選用快速老化模型小鼠，通過3-甲基吲哚腹腔注射毀損嗅黏膜造模[7]，旨在保持嗅覺中樞完整性的情況下，觀察單純艾煙干預對小鼠嗅球形態以及嗅球內神經遞質含量的影響，初步探討艾煙起效途徑與嗅覺通路相關性，為進一步探索艾煙在艾灸整體效應機制中的意義奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選取SPF級6個月齡雄性SAM小鼠60只，其中SAMP8系48只，同品系正常老化小鼠SAMR1系12只，平均體質量（30±2.3）g，購自中科澤晟科技有限公司[SCXK（京）2014-0011]。采用標準動物飼料喂養，自由飲水;飼養環境溫度（22±2）℃，濕度50%～60%。采用人工控制室內照明，12/12 h光暗環境交替循環。

1.1.2 藥物

特制細艾條（Φ0.5 cm×20 cm，河南南陽漢醫艾絨有限公司）;玉米油（上海源葉生物科技有限公司）。

1.1.3 試劑及儀器 3-甲基吲哚（3-MI，99%，北京銀河天虹化工有限公司）;自制艾煙干預箱（75 cm×45 cm×60 cm）;P5L2C光散射式數字粉塵測試儀（北京賓達綠創科技有限公司）;磷酸緩沖鹽溶液（PBS）（Coolaber，北京華菁美達科技有限公司）;4%多聚甲醛（Coolaber，北京華菁美達科技有限公司）;石蠟包埋機（EG1150，德國Leica公司）;石蠟切片機（RM2235，德國Leica公司）;谷氨酸（Glu）、γ-氨基丁酸（GaBa）和乙酰膽堿酯酶（AChE）試劑盒均購于上海酶聯生物研究所;Multiskan MK3標準規格酶標儀（Thermo Scientific）。

1.2 方法

1.2.1 分組及模型制備 選取48只SAMP8小鼠并用隨機數字表法分為艾煙組，嗅覺障礙+艾煙組（嗅障艾煙組），嗅覺障礙組，模型組，每組12只。12只SAMR1雄性小鼠作為空白對照組對照。適應性飼養2周后進行造模。將3-MI與玉米油混合溶解，制成30 mg/mL的溶液，按照300 mg/kg劑量對嗅障艾煙組及嗅覺障礙組小鼠進行腹腔注射。其余組依據體質量注射同等劑量玉米油。

給藥24 h后行埋藏食物小球實驗（Buried Food Pellet Test，BFPT）。小鼠從測試的前24 h開始限食（2.4 g/d），自由飲水，測試時將嗅覺行為測試盒內鋪入潔凈的玉米墊料，厚度約4 cm。將1 g重的食物小球埋藏在墊料下約2 cm深處，每次測試時將小鼠從相同位置放入測試盒中。從小鼠放入測試盒中開始計時，小鼠前爪或牙齒抓住食物小球時停止計時，將這段時間定義為小鼠找到食物小球的時間。小鼠找到的食料允許其在測試中吃完。每日同一時間重復實驗，連續3 d。以BFPT實驗300 s（3次測試的平均值）內未找到飼料作為嗅覺障礙造模成功。

1.2.2 干預方法 根據前期實驗以及臨床診室測量數據，本實驗中干預用艾煙干預條件定為5.0～15.0 mg/m3，以模擬臨床診室中艾煙濃度。實驗開始前將光散射式數字粉塵測試儀置于箱體下部，細艾條點燃插入底座并固定于艾煙吸嗅箱隔板中部，箱壁及隔板均分布通氣孔，可保證煙氣的充分彌散。艾條于箱內點燃1 min后，將小鼠逐一放入箱內，每只小鼠由隔板隔開，避免互相干擾。艾煙干預過程中，每5 min記錄一次濃度值，若數值高于15 mg/m3，可移動上方插板調整通氣口。實驗過程中艾煙濃度基本維持在10.5～12.8 mg/m3。艾煙組和嗅障艾煙組小鼠每日接受艾煙干預30 min，共6周。嗅覺障礙組、模型組及空白對照組不特殊處理，給予正常空氣吸嗅。

實驗末次干預結束后，禁食不禁水12 h。每組隨機選取3～4只小鼠[艾煙組和模型組取3只（后期各脫落1只），其余組取4只]腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）進行麻醉，開胸暴露心臟，將灌流針頭經左心室插入主動脈，PBS快速沖洗并灌注4%多聚甲醛。斷頭開顱，參照小鼠解剖圖譜，取出嗅球，置于4%多聚甲醛中固定。其余小鼠處死后，于冰臺上快速取出嗅球組織，置于標記的2 mL凍存管中，液氮凍存數分鐘后移入-80 ℃冰箱待測。

1.2.3 檢測指標與方法 采用蘇木精-伊紅（HE）染色法觀察各組其余8只小鼠嗅球組織形態結構，小鼠嗅球固定7 d后常規石蠟包埋、切片，經烤片、梯度乙醇和二甲苯脫蠟至水、染色、脫水封片后，于光學顯微鏡下觀察嗅球形態，采集圖像并分析。采用酶聯免疫吸附試驗法檢測嗅球內Glu、GaBa、AChE含量，制備10%濃度的小鼠嗅球組織勻漿，檢測時嚴格按照試劑盒說明進行操作。

1.3 統計學方法

采用SPSS 20.0統計軟件分析數據。計量資料符合正態性分布且通過方差齊性檢驗，以均值±標準差（±s）表示，采用單因素方差分析，并用LSD法進行組間比較，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠嗅球HE染色結果比較

光鏡下可觀察到空白對照組小鼠嗅球結構清晰，呈同心圓狀規則排列，自內向外依次可觀察到顆粒細胞層、僧帽細胞層、外叢層、突觸小球層;空白對照組小鼠嗅球僧帽細胞胞質紅染，呈圓形或卵圓形，細胞核大，樹突明顯;顆粒細胞核仁清晰，胞核深染，呈串珠樣簇集。其余組小鼠嗅球細胞整體結構未見明顯差異，但僧帽細胞層神經元數量比較空白對照組略有減少;模型組、嗅覺障礙組及嗅障艾煙組顆粒細胞層細胞數量和密度稍有降低。艾煙組部分僧帽細胞楔形，突起明顯;且顆粒細胞層細胞數量及密度明顯高于模型組、嗅覺障礙組及嗅障艾煙組。見圖1。

2.2 各組小鼠嗅球內Glu、GaBa、AChE含量比較

空白對照組、艾煙組及嗅障艾煙組嗅球內Glu含量均低于模型組，差異有統計學意義（P<0.05），且艾煙組較嗅障艾煙組顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05）。嗅覺障礙組與模型組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。

嗅球內GaBa含量空白對照組顯著高于模型組，差異有統計學意義（P<0.05），其余各組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。

空白對照組與艾煙組嗅球AChE含量均顯著低于模型組，差異有統計學意義（P<0.05）。艾煙組AChE含量顯著低于嗅覺障礙組，差異有統計學意義（P<0.05）。但與嗅障艾煙比較，差異無統計學意義（P>0.05）。嗅覺障礙組、嗅障艾煙組與模型組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。

3 討論

嗅覺系統是感覺神經系統的重要組成部分，其發育和調控與整個機體的生長和發育有著緊密的聯系，對情緒、睡眠、記憶等大腦高級活動有重要影響。嗅覺通路由嗅上皮（OE）、嗅球（OB）和嗅覺皮層（OC）3級結構組成，通過逐級信號傳遞實現對氣味的識別和認知。嗅覺刺激可以不經丘腦中繼直接到達中樞，具有起效迅速且高度敏感的特點。同時由于嗅覺神經元對受體的特異性表達，氣味的識別和傳導具有高度特異性[8]。此外，嗅覺通路與神經退行性病變關系密切，且給藥生物利用率高，吸收快，不良反應小。因此近年來成為中樞系統疾病研究熱點之一。

嗅球是嗅覺通路的第一中轉站，在嗅覺的產生及嗅覺與高級活動的聯系中發揮至關重要的作用。嗅球的病理改變可引起學習記憶行為的改變和相關中樞神經生化活動的改變。近年來發現，帕金森病、阿爾茨海默病等神經退行性疾病多伴有嗅覺功能減退以及嗅覺系統病變[9]。阿爾茨海默患者在疾病早期即可出現嗅球病變，其改變甚至早于皮層[10]。此外，動物實驗發現單純損毀嗅球即可一定程度降低正常大鼠學習記憶力[11]。吳子建[12]發現艾煙和艾油的芳香氣味分子可以誘發嗅球動作電位。不同濃度艾煙還可以引起嗅球超微結構及c-Fos蛋白表達的改變[13]。因此推測嗅球結構與功能可能與艾煙改善SAMP8小鼠學習記憶的效應具有一定關聯性。本實驗結果顯示，各組小鼠嗅球整體結構并無明顯差異，3-MI誘導的嗅覺障礙模型嗅覺障礙僅局限于外周感受器，嗅球并未出現明顯病變，與相關報道一致[14]。嗅球在機體成年期依舊能持續不斷地生成以球周細胞和顆粒細胞為主的中間神經元。顆粒細胞是嗅球內最多的一種中間神經元，參與處理各種氣味信息。嗅覺剝奪的成鼠嗅球可觀察到顆粒細胞明顯減少[15]，而豐富的嗅覺經驗則有助于新生細胞的增加[16]。艾煙組顆粒細胞密度較模型組有所增加，而嗅障艾煙組未表現出相同變化，可能是由于艾煙的氣味刺激促進了新生神經細胞的成活和分化。

Glu和GaBa是嗅覺系統中最主要的2種神經遞質。Glu作為興奮性神經遞質，它不但參與學習記憶形成和信息貯存的過程，還與神經系統的突觸形成、重塑及退化密切相關。但腦內Glu的過度蓄積可引起神經細胞損傷[17]。GaBa是抑制性神經遞質，對神經干細胞的增殖、分化和神經元的定向遷移具有調節作用[18-19]。此外，乙酰膽堿也參與對嗅覺系統可塑性和感知力的調節[20]。AChE是乙酰膽堿的水解酶，可通過調節乙酰膽堿含量控制突觸間信息傳遞，對反映膽堿能神經元活性有重要意義。實驗結果顯示，模型組Glu和AChE顯著高于空白對照組，提示SAMP8嗅球內也存在興奮性神經遞質的過度蓄積和膽堿酯酶活性的升高。GaBa含量空白對照組顯著高于模型組，其余組各組無明顯差異，可能興奮性遞質在嗅覺活動中的作用較抑制性遞質更為重要，因此變化更加敏感。也可能艾煙干預對嗅球內GaBa遞質的合成和釋放影響較小，或受限于艾煙濃度、時間因素未對GaBa代謝產生作用。艾煙組Glu顯著低于模型組和嗅障艾煙組，AChE含量顯著低于模型組和嗅覺障礙組，說明單純艾煙干預可以下調嗅球內過高的谷氨酸和膽堿酯酶的異常代謝，改善氧化應激，且這種效應依賴于嗅覺通路的完整性。此外，嗅障艾煙組Glu較模型組也有明顯降低，考慮可能是艾煙通過黏膜、皮膚等途徑發揮的作用，或是艾煙的氣味刺激加快了嗅覺障礙的恢復從而產生一定效應。

綜上所述，艾煙治療作用的發揮與嗅覺通路具有一定相關性。基于對嗅覺系統結構和工作方式的理解，艾煙的芳香氣味刺激可能是通過調節嗅球內神經遞質，提高嗅覺系統神經興奮性，并借助神經聯系影響大腦各區域的神經遞質表達，改善腦內氧化應激狀態。

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