艾煙對SAMP8小鼠嗅球形態(tài)和嗅球內(nèi)谷氨酸、γ-氨基丁酸和乙酰膽堿酯酶的影響

左瀅竹 林瑤 趙百孝

摘要 目的：觀察艾煙干預(yù)對快速老化SAMP8小鼠嗅球形態(tài)和嗅球內(nèi)谷氨酸（Glu）、γ-氨基丁酸（GaBa）和乙酰膽堿酯酶（AChE）表達(dá)的影響，探討艾煙的可能效應(yīng)途徑。方法：選取6月齡雄性快速老化模型SAMP8小鼠48只并隨機(jī)分為艾煙組、模型組、嗅覺障礙組和嗅覺障礙艾煙組，以12只SAMR1作為空白對照組對照。3-甲基吲哚（3-MI）腹腔注射制作嗅覺障礙模型。艾煙組和嗅覺障礙艾煙組每日予以艾煙吸嗅30 min，其余組正常空氣吸嗅。干預(yù)6周后通過蘇木精-伊紅（HE）染色觀察各組嗅球形態(tài)，并利用酶聯(lián)免疫吸附試驗法比較嗅球內(nèi)Glu、GaBa及AChE表達(dá)情況。結(jié)果：各組嗅球結(jié)構(gòu)未見明顯差異，艾煙組顆粒細(xì)胞密度略高于模型組、嗅覺障礙組和嗅障艾煙組。艾煙組Glu、AChE較模型組顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），且AChE含量低于嗅覺障礙組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。嗅障艾煙組Glu含量介于模型組和艾煙組之間，3組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：一定濃度的艾煙干預(yù)可以良性調(diào)節(jié)嗅球內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)含量，并通過嗅覺通路的神經(jīng)投射干預(yù)腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的表達(dá)，改善氧化應(yīng)激。

關(guān)鍵詞 艾煙;嗅球;神經(jīng)遞質(zhì);嗅覺通路;谷氨酸;γ-氨基丁酸;乙酰膽堿酯酶

Abstract Objective：To observe the effects of moxa smoke on the olfactory bulb morphology and the expression of glutamate acid （Glu），gamma-aminobutyric acid （GaBa） and acetylcholinesterase （AChE） in the olfactory bulb of aging SAMP8 mice，in order to explore the possible pathway of moxa smoke effect.Methods：A total of 48 six-month-old male SAMP8 mice were randomly divided into 3 groups：a moxa smoke group，a model group，a dysosmia group and a dysosmia model treated with moxa smoke group.12 SAMR1 mice were used as control group.3-methylindole （3-MI） was injected intraperitoneally to produce an olfactory dysfunction model.The moxa smoke group and dysosmia model treated with moxa smoke group inhaled moxa smoke for 30 min every day.Other groups inhaled normal air.After 6 weeks′ intervention，the morphology of olfactory bulb was observed by HE staining，and the contents of Glu，GaBa and AChE in olfactory bulb were tested by ELISA.Results：There was no significant difference in olfactory bulb structure among the 5 groups.The density of granular cells in the inner plexus layer of the moxa smoke group was slightly higher than that of the model group，the dysosmia group and the dysosmia treated with moxa smoke group.Contents of Glu and AChE in moxa smoke group were significantly lower than those in model group （P<0.01，P<0.05），and its AChE content was lower than that in the dysosmia group （P<0.05）.The content of Glu in dysosmia treated with moxa smoke group was between the model group and the moxa smoke group，and there was significant difference among the 3 groups （P<0.05）.Conclusion：With certain concentration，moxa smoke intervention can benignly regulate the content of neurotransmitters in the olfactory bulb.Through the neural projection of the olfactory pathway，the expression of neurotransmitters in the brain can be interfered and the oxidative stress could be improved.

Key Words Moxa smoke; Olfactory bulb; Neurotransmitter; Olfactory pathway; Glutamate acid; Gamma-aminobutyric; Acetylcholinesterase

中圖分類號：R242文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.05.017

艾葉作為傳統(tǒng)灸材，其燃燒產(chǎn)生的煙霧不但在艾灸過程中發(fā)揮重要作用，更可單獨應(yīng)用治療多種疾病，自古以來便備受推崇。早在《五十二病方》中就記載了以干艾、柳蕈熏燃外治的病案;《肘后備急方》有“以干艾斛許，揉團(tuán)納瓦甑中，并獨留一目，以痛處著甑目而燒艾熏之”的煙熏操作法;《本草綱目》中亦有“熟艾燒煙薰之……治風(fēng)蟲牙痛”的闡述。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，艾葉燃燒生成的艾煙含有多種具有抗氧化、抗炎、鎮(zhèn)靜作用的芳香物質(zhì)[1]，其中許多成分亦常見見于的芳香開竅藥物或精油[2]。部分已被證實是通過嗅覺通路發(fā)揮保護(hù)腦神經(jīng)功能[3]，改善學(xué)習(xí)記憶的作用[4]。本前期研究發(fā)現(xiàn)，單純艾煙干預(yù)可以治療性提高ApoE-/-及SAMP8小鼠腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量，減輕氧化應(yīng)激，延緩腦組織衰老[5-6]。但艾煙究竟通過何種途徑發(fā)揮作用至今尚不明確，可能是通過血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，也可能經(jīng)嗅神經(jīng)傳導(dǎo)通路起效。

本實驗選用快速老化模型小鼠，通過3-甲基吲哚腹腔注射毀損嗅黏膜造模[7]，旨在保持嗅覺中樞完整性的情況下，觀察單純艾煙干預(yù)對小鼠嗅球形態(tài)以及嗅球內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響，初步探討艾煙起效途徑與嗅覺通路相關(guān)性，為進(jìn)一步探索艾煙在艾灸整體效應(yīng)機(jī)制中的意義奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選取SPF級6個月齡雄性SAM小鼠60只，其中SAMP8系48只，同品系正常老化小鼠SAMR1系12只，平均體質(zhì)量（30±2.3）g，購自中科澤晟科技有限公司[SCXK（京）2014-0011]。采用標(biāo)準(zhǔn)動物飼料喂養(yǎng)，自由飲水;飼養(yǎng)環(huán)境溫度（22±2）℃，濕度50%～60%。采用人工控制室內(nèi)照明，12/12 h光暗環(huán)境交替循環(huán)。

1.1.2 藥物

特制細(xì)艾條（Φ0.5 cm×20 cm，河南南陽漢醫(yī)艾絨有限公司）;玉米油（上海源葉生物科技有限公司）。

1.1.3 試劑及儀器 3-甲基吲哚（3-MI，99%，北京銀河天虹化工有限公司）;自制艾煙干預(yù)箱（75 cm×45 cm×60 cm）;P5L2C光散射式數(shù)字粉塵測試儀（北京賓達(dá)綠創(chuàng)科技有限公司）;磷酸緩沖鹽溶液（PBS）（Coolaber，北京華菁美達(dá)科技有限公司）;4%多聚甲醛（Coolaber，北京華菁美達(dá)科技有限公司）;石蠟包埋機(jī)（EG1150，德國Leica公司）;石蠟切片機(jī)（RM2235，德國Leica公司）;谷氨酸（Glu）、γ-氨基丁酸（GaBa）和乙酰膽堿酯酶（AChE）試劑盒均購于上海酶聯(lián)生物研究所;Multiskan MK3標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀（Thermo Scientific）。

1.2 方法

1.2.1 分組及模型制備 選取48只SAMP8小鼠并用隨機(jī)數(shù)字表法分為艾煙組，嗅覺障礙+艾煙組（嗅障艾煙組），嗅覺障礙組，模型組，每組12只。12只SAMR1雄性小鼠作為空白對照組對照。適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后進(jìn)行造模。將3-MI與玉米油混合溶解，制成30 mg/mL的溶液，按照300 mg/kg劑量對嗅障艾煙組及嗅覺障礙組小鼠進(jìn)行腹腔注射。其余組依據(jù)體質(zhì)量注射同等劑量玉米油。

給藥24 h后行埋藏食物小球?qū)嶒灒˙uried Food Pellet Test，BFPT）。小鼠從測試的前24 h開始限食（2.4 g/d），自由飲水，測試時將嗅覺行為測試盒內(nèi)鋪入潔凈的玉米墊料，厚度約4 cm。將1 g重的食物小球埋藏在墊料下約2 cm深處，每次測試時將小鼠從相同位置放入測試盒中。從小鼠放入測試盒中開始計時，小鼠前爪或牙齒抓住食物小球時停止計時，將這段時間定義為小鼠找到食物小球的時間。小鼠找到的食料允許其在測試中吃完。每日同一時間重復(fù)實驗，連續(xù)3 d。以BFPT實驗300 s（3次測試的平均值）內(nèi)未找到飼料作為嗅覺障礙造模成功。

1.2.2 干預(yù)方法 根據(jù)前期實驗以及臨床診室測量數(shù)據(jù)，本實驗中干預(yù)用艾煙干預(yù)條件定為5.0～15.0 mg/m3，以模擬臨床診室中艾煙濃度。實驗開始前將光散射式數(shù)字粉塵測試儀置于箱體下部，細(xì)艾條點燃插入底座并固定于艾煙吸嗅箱隔板中部，箱壁及隔板均分布通氣孔，可保證煙氣的充分彌散。艾條于箱內(nèi)點燃1 min后，將小鼠逐一放入箱內(nèi)，每只小鼠由隔板隔開，避免互相干擾。艾煙干預(yù)過程中，每5 min記錄一次濃度值，若數(shù)值高于15 mg/m3，可移動上方插板調(diào)整通氣口。實驗過程中艾煙濃度基本維持在10.5～12.8 mg/m3。艾煙組和嗅障艾煙組小鼠每日接受艾煙干預(yù)30 min，共6周。嗅覺障礙組、模型組及空白對照組不特殊處理，給予正常空氣吸嗅。

實驗?zāi)┐胃深A(yù)結(jié)束后，禁食不禁水12 h。每組隨機(jī)選取3～4只小鼠[艾煙組和模型組取3只（后期各脫落1只），其余組取4只]腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）進(jìn)行麻醉，開胸暴露心臟，將灌流針頭經(jīng)左心室插入主動脈，PBS快速沖洗并灌注4%多聚甲醛。斷頭開顱，參照小鼠解剖圖譜，取出嗅球，置于4%多聚甲醛中固定。其余小鼠處死后，于冰臺上快速取出嗅球組織，置于標(biāo)記的2 mL凍存管中，液氮凍存數(shù)分鐘后移入-80 ℃冰箱待測。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法 采用蘇木精-伊紅（HE）染色法觀察各組其余8只小鼠嗅球組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，小鼠嗅球固定7 d后常規(guī)石蠟包埋、切片，經(jīng)烤片、梯度乙醇和二甲苯脫蠟至水、染色、脫水封片后，于光學(xué)顯微鏡下觀察嗅球形態(tài)，采集圖像并分析。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗法檢測嗅球內(nèi)Glu、GaBa、AChE含量，制備10%濃度的小鼠嗅球組織勻漿，檢測時嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料符合正態(tài)性分布且通過方差齊性檢驗，以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析，并用LSD法進(jìn)行組間比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠嗅球HE染色結(jié)果比較

光鏡下可觀察到空白對照組小鼠嗅球結(jié)構(gòu)清晰，呈同心圓狀規(guī)則排列，自內(nèi)向外依次可觀察到顆粒細(xì)胞層、僧帽細(xì)胞層、外叢層、突觸小球?qū)?空白對照組小鼠嗅球僧帽細(xì)胞胞質(zhì)紅染，呈圓形或卵圓形，細(xì)胞核大，樹突明顯;顆粒細(xì)胞核仁清晰，胞核深染，呈串珠樣簇集。其余組小鼠嗅球細(xì)胞整體結(jié)構(gòu)未見明顯差異，但僧帽細(xì)胞層神經(jīng)元數(shù)量比較空白對照組略有減少;模型組、嗅覺障礙組及嗅障艾煙組顆粒細(xì)胞層細(xì)胞數(shù)量和密度稍有降低。艾煙組部分僧帽細(xì)胞楔形，突起明顯;且顆粒細(xì)胞層細(xì)胞數(shù)量及密度明顯高于模型組、嗅覺障礙組及嗅障艾煙組。見圖1。

2.2 各組小鼠嗅球內(nèi)Glu、GaBa、AChE含量比較

空白對照組、艾煙組及嗅障艾煙組嗅球內(nèi)Glu含量均低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），且艾煙組較嗅障艾煙組顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。嗅覺障礙組與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

嗅球內(nèi)GaBa含量空白對照組顯著高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），其余各組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

空白對照組與艾煙組嗅球AChE含量均顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。艾煙組AChE含量顯著低于嗅覺障礙組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。但與嗅障艾煙比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。嗅覺障礙組、嗅障艾煙組與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

3 討論

嗅覺系統(tǒng)是感覺神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分，其發(fā)育和調(diào)控與整個機(jī)體的生長和發(fā)育有著緊密的聯(lián)系，對情緒、睡眠、記憶等大腦高級活動有重要影響。嗅覺通路由嗅上皮（OE）、嗅球（OB）和嗅覺皮層（OC）3級結(jié)構(gòu)組成，通過逐級信號傳遞實現(xiàn)對氣味的識別和認(rèn)知。嗅覺刺激可以不經(jīng)丘腦中繼直接到達(dá)中樞，具有起效迅速且高度敏感的特點。同時由于嗅覺神經(jīng)元對受體的特異性表達(dá)，氣味的識別和傳導(dǎo)具有高度特異性[8]。此外，嗅覺通路與神經(jīng)退行性病變關(guān)系密切，且給藥生物利用率高，吸收快，不良反應(yīng)小。因此近年來成為中樞系統(tǒng)疾病研究熱點之一。

嗅球是嗅覺通路的第一中轉(zhuǎn)站，在嗅覺的產(chǎn)生及嗅覺與高級活動的聯(lián)系中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。嗅球的病理改變可引起學(xué)習(xí)記憶行為的改變和相關(guān)中樞神經(jīng)生化活動的改變。近年來發(fā)現(xiàn)，帕金森病、阿爾茨海默病等神經(jīng)退行性疾病多伴有嗅覺功能減退以及嗅覺系統(tǒng)病變[9]。阿爾茨海默患者在疾病早期即可出現(xiàn)嗅球病變，其改變甚至早于皮層[10]。此外，動物實驗發(fā)現(xiàn)單純損毀嗅球即可一定程度降低正常大鼠學(xué)習(xí)記憶力[11]。吳子建[12]發(fā)現(xiàn)艾煙和艾油的芳香氣味分子可以誘發(fā)嗅球動作電位。不同濃度艾煙還可以引起嗅球超微結(jié)構(gòu)及c-Fos蛋白表達(dá)的改變[13]。因此推測嗅球結(jié)構(gòu)與功能可能與艾煙改善SAMP8小鼠學(xué)習(xí)記憶的效應(yīng)具有一定關(guān)聯(lián)性。本實驗結(jié)果顯示，各組小鼠嗅球整體結(jié)構(gòu)并無明顯差異，3-MI誘導(dǎo)的嗅覺障礙模型嗅覺障礙僅局限于外周感受器，嗅球并未出現(xiàn)明顯病變，與相關(guān)報道一致[14]。嗅球在機(jī)體成年期依舊能持續(xù)不斷地生成以球周細(xì)胞和顆粒細(xì)胞為主的中間神經(jīng)元。顆粒細(xì)胞是嗅球內(nèi)最多的一種中間神經(jīng)元，參與處理各種氣味信息。嗅覺剝奪的成鼠嗅球可觀察到顆粒細(xì)胞明顯減少[15]，而豐富的嗅覺經(jīng)驗則有助于新生細(xì)胞的增加[16]。艾煙組顆粒細(xì)胞密度較模型組有所增加，而嗅障艾煙組未表現(xiàn)出相同變化，可能是由于艾煙的氣味刺激促進(jìn)了新生神經(jīng)細(xì)胞的成活和分化。

Glu和GaBa是嗅覺系統(tǒng)中最主要的2種神經(jīng)遞質(zhì)。Glu作為興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，它不但參與學(xué)習(xí)記憶形成和信息貯存的過程，還與神經(jīng)系統(tǒng)的突觸形成、重塑及退化密切相關(guān)。但腦內(nèi)Glu的過度蓄積可引起神經(jīng)細(xì)胞損傷[17]。GaBa是抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，對神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、分化和神經(jīng)元的定向遷移具有調(diào)節(jié)作用[18-19]。此外，乙酰膽堿也參與對嗅覺系統(tǒng)可塑性和感知力的調(diào)節(jié)[20]。AChE是乙酰膽堿的水解酶，可通過調(diào)節(jié)乙酰膽堿含量控制突觸間信息傳遞，對反映膽堿能神經(jīng)元活性有重要意義。實驗結(jié)果顯示，模型組Glu和AChE顯著高于空白對照組，提示SAMP8嗅球內(nèi)也存在興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的過度蓄積和膽堿酯酶活性的升高。GaBa含量空白對照組顯著高于模型組，其余組各組無明顯差異，可能興奮性遞質(zhì)在嗅覺活動中的作用較抑制性遞質(zhì)更為重要，因此變化更加敏感。也可能艾煙干預(yù)對嗅球內(nèi)GaBa遞質(zhì)的合成和釋放影響較小，或受限于艾煙濃度、時間因素未對GaBa代謝產(chǎn)生作用。艾煙組Glu顯著低于模型組和嗅障艾煙組，AChE含量顯著低于模型組和嗅覺障礙組，說明單純艾煙干預(yù)可以下調(diào)嗅球內(nèi)過高的谷氨酸和膽堿酯酶的異常代謝，改善氧化應(yīng)激，且這種效應(yīng)依賴于嗅覺通路的完整性。此外，嗅障艾煙組Glu較模型組也有明顯降低，考慮可能是艾煙通過黏膜、皮膚等途徑發(fā)揮的作用，或是艾煙的氣味刺激加快了嗅覺障礙的恢復(fù)從而產(chǎn)生一定效應(yīng)。

綜上所述，艾煙治療作用的發(fā)揮與嗅覺通路具有一定相關(guān)性。基于對嗅覺系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和工作方式的理解，艾煙的芳香氣味刺激可能是通過調(diào)節(jié)嗅球內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)，提高嗅覺系統(tǒng)神經(jīng)興奮性，并借助神經(jīng)聯(lián)系影響大腦各區(qū)域的神經(jīng)遞質(zhì)表達(dá)，改善腦內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)。

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