鋅指蛋白mA20突變體對內毒素性肺泡巨噬細胞的調控作用

左云龍 黨潤 彭紅艷 武志遠 楊鎰宇

[摘要]目的：探討鋅指蛋白mA20突變體對內毒素性肺泡巨噬細胞的調控作用;方法：分別設立A：NS對照組，B：空白脂質體處理組，C：脂質體+綠色熒光蛋白質粒處理組，D：脂質體+綠色熒光蛋白。鋅指蛋白mA20突變體質粒處理組;按文獻制備脂質體/GFP質粒復合物、脂質體/GFP-鋅指蛋白mA20質粒突變體復合物，分別處理C、D組;結果：4組的內毒素性肺泡巨噬細胞數及IL-1B相比差異具有顯著性（P>0.05）;將攜帶mA20基因的病毒載體轉染肺泡巨噬細胞（mA20過表達肺泡巨噬細胞），感染后，可在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光;結論：內毒素性ALI的難題與根本問題就是炎癥級聯效應，而改善此類患者的有效措施就是阻斷炎癥級聯效應的通路，鋅指蛋白mA20突變體在通路中具備較好的阻斷作用。

[關鍵詞]鋅指蛋白mA20突變體;內毒素性肺泡巨噬細胞;調控作用

[中圖分類號]R72 [文獻標識碼]A [文章編號]2096-5249（2019）05-016-02

急性肺損傷或急性呼吸窘迫綜合征（acute lung injury/acute respiratorydistress syndrome，ALI/ARDS）系指患者在承受各種病理性刺激反應在之后誘發急性炎癥，主要的臨床癥狀是缺氧及呼吸困難。鋅指蛋白mA20主要發揮炎癥調控的作用，是機體中非常重要的內源蛋白，能夠有效抑制NF-B，如此便能夠有效改善炎癥細胞因子的“瀑布樣”級聯癥狀。現今，分子生物學水平漸漸提升，本文基于此，深入探究鋅指蛋白mA20對內毒素性ALI時肺組織保護性機理，以期為ALl的防治奠定堅實的實驗及理論基礎。

1材料

1.1質粒的準備 ①依照《分子克隆》自制JMl09感受態;②GFP及mA20質粒的轉化測驗;③GFP及mA20質粒擴增、提取，瓊脂糖凝膠電泳鑒定;④憑借酶切及連接的手段，制備表達富含GFP-mA20突變體的融合蛋白，并且進行擴增，展開瓊脂糖凝膠電泳及測序鑒別。④內毒素選擇中劑量（2.5mg/kg）。

1.2支氣管肺泡灌洗 所有研究大鼠均展開肺泡灌洗，并且依照分離、純化、貼壁、分裝的次序進行培養。研究分組主要分成三組，分別是高劑量（5mg/kg）、中劑量（2.5mg/kg）、低劑量（0.5mg/kg），并且以分組的方式攻擊SD大鼠PAM;形成各個濃度范圍內的毒素性PAM細胞模型。

1.3純化、培養皿分裝培養 設置A：NS對照組，B：空白脂質體處理組，C：脂質體+綠色熒光蛋白質粒處理組，D：脂質體+綠色熒光蛋白-鋅指蛋白mA20突變體質粒處理組;依照相關研究自制脂質體/GFP-鋅指蛋白mA20質粒突變體復合物、脂質體/GFP質粒復合物，并針對C、D組分別采取處理。

1.4觀察指標 將PAM培養的上清液采集，ELISA針對Ⅱ-1及TNF-α的表達水平進行檢測;運用熒光顯微鏡測定采集的細胞，利用綠色熒光的特征性反應，區別質粒轉染的狀況;IL-1及TNF-α引物設計，憑借RT-PCR進行擴增進而得到目標片段，瓊脂糖凝膠電泳鑒定;憑借Tripure試劑獲得PAM總RNA，RT-PCR，擴增得到首條cDNA。

1.5質量控制 研究大鼠均選擇清潔型SD大鼠，并且由專業人士根據細胞培養與分子生物學的流程開展研究;為能夠有效提升基因轉染率，憑借新型陽離子脂質體介導基因進行AM的轉入操作;運用進口試劑進行測試，保障數據的準確性及可靠性;重復進行5-10次實驗，降低了結果誤差，測試重復性也較好。

1.6統計學處理 用均數±標準差表示數據，并且憑借spss軟件展開統計學分析，最終運用條形圖、線形圖、熒光顯微鏡圖片以及表格等展示測試結果。

2結果

4組的內毒素性肺泡巨噬細胞數相比差異具有顯著性（P<0.05），見表1.4組肺組織勻漿IL-1B測定結果相比差異具有顯著性（P<0.05），見表2.將攜帶mA20基因的病毒載體轉染肺泡巨噬細胞（mA20過表達肺泡巨噬細胞），圖分別為感染3h、6h、12h、24h后的情況。見圖。

將攜帶mA20基因的病毒載體轉染肺泡巨噬細胞（mA20過表達肺泡巨噬細胞）。感染后。可在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光。見下圖

3討論

3.1目前研究現狀和存在問題 目前防治內毒素性ALI的根本難題是不能有效的控制炎癥因子的“級聯放大”的瀑布樣反應，導致肺損傷加重，最終誘發或加重多臟器功能障礙綜合征（MODS）。當前國內外研究主要集中在如下幾方面：①常規用各種機械通氣的方法支持治療，但在沒解決感染的根本問題時，該方法的遠期效果不理想，而且還容易帶來高氧肺損傷的并發癥;②也有眾多學者采用抗免疫療法，雖取得了很大的進展，但由于治療時機、抗炎抑炎的平衡難以把握，抑炎措施單一，致使有相當部分效果不甚明顯，ALI/ARDS病死率仍無顯著改善;③雖然抗生素治療是有效的措施，但隨著藥物的濫用，出現了相當多的耐藥細菌。這使得抗生素的使用遇到很尷尬的境地;④外源性肺表面活性物質（PS）的替代療法是近來較為先進的治療措施，但由于劑型、給藥途徑不一，操作較煩瑣以及費用較為昂貴等原因，使得PS替代療法難以廣泛應用;⑤化痰藥、擴血管藥物的應用只能對癥支持，不能有效解決根本的炎癥問題;還常常會由于多數擴血管藥物缺乏對肺循環的選擇性作用而加重低氧血癥;⑥蛋白酶抑制劑的應用對ALI的治療效果仍有爭議。⑦臨床中多用的抗氧化治療也只是個輔助措施。

回顧以往的研究多集中在如何抗感染、保護肺功能、對癥支持以及輔助治療，多是很“被動”的措施，而對如何從根本上阻斷ALl炎癥反應通路的研究甚少。隨著分子生物學的發展，在分子水平上對炎癥反應進行合理調控成為當前熱點。

3.2鋅指蛋白mA20突變體是新型結構簡單的炎癥調控物質目前。社會各界非常注重免役源性因素，例如趨化因子、細胞因子、炎癥細胞在內毒素性ALI時炎癥反應階段中所發揮的調控作用，雖然能由基因層次有效調控炎癥反應，可是對內毒素性ALl炎癥反應階段中的特定位點運用某一內源性調控蛋白而開展的試驗及研究鮮少。已經有相關研究證實鋅指蛋白mA20是一種胞漿炎癥調控蛋白。并且根據有關報道可知鋅指蛋白mA20是胞液內的泛素修飾蛋白。能夠表現出負調控NF-B的效果，在負調控炎癥中尤為關鍵。針對mA20基因功能及結構進行深入的探究之后得知：mA20功能結構域共有兩個。分別是mA20的C末端半區（386-775）及N末端半區（1-385）;C半區是鋅指區，Cys2/Cys2型鋅指的數量有7個，并且結構均是重復的。設置了mA20突變體表達質粒并轉染炎癥細胞模型，得知mA20對NF-B活性抑制和C半區中ZnF存在較為密切的關聯性，并且若是突變體存在ZnF不少于4個，對NF-B活性所發揮的抑制效果幾乎等同于存在7個ZnF野生型mA20.可是根據相關報道可知mA20的N端卵巢腫瘤（OUT）域存在較強的去泛素化活性，并且此信號與NF-B信號的抑制效果并不存在關聯性，此外，這兩個信號可以證實mA20可以使得被多泛素化的RIPl有效消除，這也是在7NF介導過程中NF-B活化抑制效果的體現。另外，在轉染測試過程中野生型mA20會對RIPl產生促進作用，并且會因此出現穩定性顯著降低的結果。mA20與RIPl去泛素化、再泛素化之間存在較為密切的關聯性，如此便能抑制NF-B，表現出較強的抗炎效果。

3.3鋅指蛋白A20突變體防治內毒素性ALl的可能機制 肺巨噬細胞（PAM）是LPS攻擊進而誘發急性肺受損的一種重要效應細胞，由于PAM在LPS存在的條件下釋放IL-1、TNF-α、前列腺素（PG）、IL-8、IL-6、補體C3等炎癥介質，進而誘發嚴重的炎癥“級聯”瀑布樣效應。野生型mA20現今已經證明是NF-B的負調控胞內蛋白，進而導致下游轉錄而產生的各項炎癥因子水平降低，實現抗炎目標。但是mA20突變體是不是可以對內毒素誘導PAM活化階段過程中的級聯放大“瀑布樣”效應產生有效的阻隔作用，現在并沒有相關研究可以證實。

本組資料顯示，4組的內毒素性肺泡巨噬細胞數、肺組織勻漿IL-1B測定結果以及肺組織勻漿TNF alpha測定結果相比差異均具有顯著性（P<0.05）。簡而言之，內毒素性ALI的難題與根本問題就是炎癥級聯效應，而改善此類患者的有效措施就是阻斷炎癥級聯效應的通路，鋅指蛋白mA20突變體在通路中具備較好的阻斷作用。