細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法研究進(jìn)展

王婭寧 高龍

摘 ? 要：細(xì)菌內(nèi)毒素廣泛存在于人們的生活中，可引起人體發(fā)熱、白細(xì)胞減少、微循環(huán)障礙、內(nèi)毒素休克、彌散性血管內(nèi)凝血等癥狀，在藥品生產(chǎn)過程中不可避免地會(huì)引入細(xì)菌內(nèi)毒素，所以藥品質(zhì)量控制中對(duì)內(nèi)毒素的檢測(cè)尤為重要。目前，細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測(cè)方法有家兔熱原試驗(yàn)法、鱟試劑法、微量凝膠法、重組C因子法、酶聯(lián)免疫法等檢測(cè)方法。文章對(duì)這幾種檢測(cè)方法進(jìn)行綜述，比較各自的優(yōu)缺點(diǎn)，以期為內(nèi)毒素的檢測(cè)提供更合理有效的方法。

關(guān)鍵詞：細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法;鱟試劑;微量凝膠法;重組C因子法

細(xì)菌內(nèi)毒素是革蘭陰性菌細(xì)胞壁上的脂多糖，在極微量（1～5 ng/kg體重）的情況下便可引起人體發(fā)熱、白細(xì)胞減少、微循環(huán)障礙、全身炎癥反應(yīng)及多器官功能衰竭等嚴(yán)重不良反應(yīng)，所以在藥物生產(chǎn)中，尤其是注射劑的生產(chǎn)中，細(xì)菌內(nèi)毒素的控制與檢測(cè)非常重要，關(guān)乎人們的生命安全。

細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測(cè)方法：家兔熱原試驗(yàn)法、鱟試劑法、微量凝膠法、重組C因子法、酶聯(lián)免疫法等檢測(cè)方法。《中華人民共和國藥典》（2015版）規(guī)定細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測(cè)采用鱟試劑檢測(cè)法。鱟試劑是由美洲鱟或東方鱟的血液中變形細(xì)胞的溶解物提取而成。我國每年對(duì)鱟試劑的需求為1 000萬支，使我國鱟資源面臨著巨大壓力[1]。由于近些年淺海環(huán)境的惡化，人們肆意地捕食，我國的鱟資源急劇減少，所以，尋找細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的替代方法和補(bǔ)充方法已經(jīng)迫在眉睫[2]。

1 ? ?細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法分析

1.1 ?家兔法

由于家兔對(duì)熱原的反應(yīng)與人基本相似，所以，采用家兔耳緣靜脈注射的方式，監(jiān)測(cè)家兔體溫，用來定性檢測(cè)熱原。但是家兔法存在很多缺點(diǎn)，如：不能定量檢測(cè)熱原、使用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、檢測(cè)周期長、靈敏度低等，因此家兔法正在逐步被取代。

1.2 ?鱟試劑法

鱟試劑法是目前檢查細(xì)菌內(nèi)毒素的常用標(biāo)準(zhǔn)，鱟試劑主要含有：C因子、B因子、G因子、凝固蛋白酶原等物質(zhì)，其反應(yīng)原理是：首先C因子與細(xì)菌內(nèi)毒素結(jié)合被激活為酶活性形式，然后活化的C因子將B因子活化，活化的B因子將凝固蛋白酶原活化為凝固蛋白酶，凝固蛋白酶將凝固蛋白原轉(zhuǎn)化為凝固蛋白形成凝膠[3]。鱟試劑法具有操作簡單、高靈敏度、易于推廣等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于藥品檢測(cè)，但鱟試劑法在檢測(cè)某些復(fù)雜成分的藥品時(shí)，需要排除很多干擾因素，給檢驗(yàn)工作增加了負(fù)擔(dān)，同時(shí)由于鱟資源逐漸枯竭，尋找鱟試劑法的替代方法也是最近幾年的研究重點(diǎn)。

1.3 ?微量凝膠法

微量凝膠法是采用微量鱟試劑與微量供試品反應(yīng)的一種檢測(cè)方法，在無菌環(huán)境下加樣品10 μL，和鱟試劑平鋪在無熱原的平板上進(jìn)行反應(yīng)，使用含2%亞甲基藍(lán)的70%乙醇溶液為染料，滴在凝膠樣本上，若形成堅(jiān)實(shí)凝膠，染料會(huì)順著凝膠滑落，記錄為陽性;若未形成凝膠，樣本將被染色，記錄為陰性。裴宇盛等[4]選取了74個(gè)品種的232批次的樣品，分別采用凝膠法和微量凝膠法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果判斷相同的為221批，占95.2%，根據(jù)數(shù)據(jù)分析，微量法的陰性結(jié)果可靠，更加靈敏，但假陽性率相對(duì)較高。《歐洲藥典》7.0版已收錄了微量凝膠法且已使用多年，但微量凝膠法在我國的實(shí)際應(yīng)用中還存在著一些問題，如：（1）有部分廠家生產(chǎn)的鱟試劑只能使用自己生產(chǎn)的檢查用水才能判斷檢查結(jié)果。裴宇盛等[4]的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)個(gè)別廠家在使用微量凝膠法時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)難以區(qū)分陽性和陰性的問題，但用鱟試劑廠家提供的檢查用水時(shí)，有助于解決該問題，這是因?yàn)槲覈c試劑廠家在生產(chǎn)工藝上存在著差別，這種差別所帶來的影響在微量法中被放大了。（2）目前，我國還未制定微量凝膠法的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，試驗(yàn)結(jié)果的判定存在一定的主觀性。（3）含有表面活性劑的樣品不適合使用微量法，如果樣品中含有表面活性劑，會(huì)使液體攤散在酶標(biāo)板上，進(jìn)而在水浴孵育時(shí)使液體蒸發(fā)，導(dǎo)致無法觀察結(jié)果。（4）微量法使用的染色劑中含有高濃度乙醇，乙醇揮發(fā)會(huì)導(dǎo)致凝膠融化，使結(jié)果全部為陰性，因此在染色結(jié)束后應(yīng)馬上觀察結(jié)果。所以，微量凝膠法優(yōu)缺點(diǎn)比較明顯，陰性結(jié)果可靠，假陽性率太高，可以利用微量凝膠法進(jìn)行大批量樣品篩查，其不確定結(jié)果可以使用凝膠法進(jìn)行驗(yàn)證或者仲裁。微量凝膠法在未來經(jīng)過經(jīng)驗(yàn)的積累，制定統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)之后，有望收錄進(jìn)我國藥典。

1.4 ?重組C因子法

重組C因子是由東方鱟或者美洲鱟的基因克隆而成，具有與C因子一樣的生理活性。目前，我國已成功開發(fā)重組C因子試劑盒且已上市[5]，其原理是使用單一的蛋白質(zhì)C因子作為活性成分參與反應(yīng)，被內(nèi)毒素活化的C因子將人工合成的三肽鏈熒光底物裂解，產(chǎn)生熒光復(fù)合物，通過定量檢測(cè)熒光復(fù)合物來量化細(xì)菌內(nèi)毒素。其優(yōu)點(diǎn)是因?yàn)闆]有B因子的存在，從而有效地避免了因G因子的旁路干擾而產(chǎn)生的假陽性。裴宇盛等[6]選用了我國生產(chǎn)的抗生素、中藥注射液、生化藥品、重組技術(shù)產(chǎn)品、病毒疫苗和單克隆抗體6個(gè)具有代表性的品種進(jìn)行干擾試驗(yàn)。結(jié)果回收率均在50%～200%范圍內(nèi)，表明該6個(gè)品種在我國均可用重組C因子法進(jìn)行檢測(cè)。近些年來，雖然我國關(guān)于重組C因子的制備研究增多[7-8]，但是有關(guān)重組C因子的應(yīng)用研究比較少[9-10]，能提供的試驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)很少，重組C因子法在我國還沒有取得法定地位。根據(jù)文獻(xiàn)提供的數(shù)據(jù)支持，仍需要大力推廣重組C因子法，獲得更多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，為重組C因子法收錄進(jìn)我國藥典作鋪墊。

2 ? ?發(fā)展趨勢(shì)

微量凝膠法與重組鱟C因子法目前已經(jīng)具備了全面推廣的條件，在推廣使用中可以收集到大量的應(yīng)用數(shù)據(jù)，逐步形成一套標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)方法，然后便可收錄進(jìn)我國藥典，同時(shí)還應(yīng)該探索靈敏度更高、適應(yīng)性更強(qiáng)的方法。如Grallert H等[11]制備了一種對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素核心保守區(qū)域具有高度特異性和選擇性的噬菌體蛋白，實(shí)現(xiàn)了對(duì)內(nèi)毒素的特異性捕捉。該方法是重組C因子法和ELISA法的結(jié)合，其具體步驟為將樣品吸附到預(yù)先包被的酶標(biāo)板上，然后將樣品基質(zhì)洗脫，加入重組C因子，重組C因子被內(nèi)毒素活化，活化的C因子與熒光底物反應(yīng)，產(chǎn)生熒光。該方法檢測(cè)范圍為0.05～500 EU/mL，用15種不同菌株的內(nèi)毒素，同時(shí)用這種方法與細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法測(cè)定，結(jié)果數(shù)值呈線性相關(guān)（R2=0.91）[11]。該方法具有明顯的優(yōu)勢(shì)，如：假陽性、假陰性結(jié)果更少，靈敏度更高，檢測(cè)范圍更廣，適用性更強(qiáng)。我國也有關(guān)于ELISA法檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)毒素的研究，但并未使用重組C因子法檢測(cè)。張夢(mèng)等[12]采用分子印跡法，以多巴胺為功能單體，內(nèi)毒素為模板分子，在酶標(biāo)板形成包被抗體MIP，用于吸附內(nèi)毒素，MIP的吸附性與多巴胺的聚合時(shí)間有關(guān)，多巴胺膜越厚吸附能力越強(qiáng)。周卓晟[13]采用多粘菌素B作為酶標(biāo)板的包被材料，作為內(nèi)毒素的吸附劑。分子印跡法產(chǎn)生的MIP與多粘菌素B都具有價(jià)格低廉、易于制備的優(yōu)點(diǎn)，可以大批量的生產(chǎn)制備，可以嘗試用這兩種材料來吸附細(xì)菌內(nèi)毒素。

3 ? ?結(jié)語

目前，我國東南沿海海域的中華鱟和圓尾鱟因?yàn)闂h(huán)境的破壞和大量捕食等原因數(shù)量急劇減少，甚至某些地區(qū)瀕臨滅絕。應(yīng)該積極地推廣和使用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的替代方法，減少鱟試劑的使用量，使鱟資源變成可持續(xù)發(fā)展的資源，長期地造福人類。

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