鐵皮石斛多糖對人臍靜脈內皮細胞基因表達譜的影響研究

王瑞君 謝蘭 馮娟 趙文龍 郭志方 喬連生 宋維芳

摘 要 目的：探討鐵皮石斛多糖對人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）基因表達譜的影響。方法：以HUVEC為對象，采用MTS法檢測不同劑量鐵皮石斛多糖（50、100、200、400、800 μg/mL）對HUVEC細胞增殖活性的影響，并計算30%細胞生長抑制濃度（IC30）以篩選后續試驗劑量；采用基因表達譜芯片技術檢測鐵皮石斛多糖作用24 h后HUVEC細胞基因表達譜的變化情況，篩選差異表達基因；利用DAVID生物信息學資源數據庫對差異表達前5位的基因進行GO富集分析和KEGG通路富集分析；以免疫相關差異表達基因為對象，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應法（qRT-PCR）對芯片檢測結果進行驗證。結果：經100、200、400、800 μg/mL鐵皮石斛多糖作用后，HUVEC細胞的存活率均顯著降低（P<0.05或P<0.01）；IC30值為408 μg/mL。經400 μg/mL（據IC30值確定）鐵皮石斛多糖作用后，HUVEC細胞中共有差異表達基因91個，其中表達上調的有84個、表達下調的有7個。上、下調表達差異前5位的基因分別為SELE、CCL2、CXCL6、IL8、ICAM1以及VWCE、CPT1A、CLU、CCL14、CINS4，主要與免疫調節、炎癥反應等有關。HUVEC細胞中的差異表達基因主要分布于胞外區域，富集于細胞因子的產生及反應、刺激反應等生物學過程，發揮趨化因子及其受體活性等分子功能；其中上調表達基因SELE、ICAM1、CXCL2等主要富集于腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、甲型H1N1流感、單純皰疹病毒感染等通路，下調表達基因CCL14主要富集于趨化因子信號通路。qRT-PCR驗證結果顯示，ICAM1基因的相對表達量顯著升高，CCL14基因的相對表達量顯著降低（P<0.05），與芯片檢測結果一致。結論：經鐵皮石斛多糖處理后，HUVEC細胞共有91個基因表達差異明顯，且以表達上調為主。表達差異基因可能通過TNF信號通路、甲型H1N1流感、單純皰疹病毒感染等通路參與機體免疫調節。

關鍵詞 鐵皮石斛多糖；人臍靜脈內皮細胞；基因表達譜；免疫調節

Effects of Dendrobium officinale Polysaccharides on Gene Expression Profile of HUVEC

WANG Ruijun1，XIE Lan2，3，FENG Juan2，3，ZHAO Wenlong2，3，GUO Zhifang2，3，QIAO Liansheng2，3，SONG Weifang1[1. Dept. of Pathophysiology， Fenyang College， Shanxi Medical University， Shanxi Fenyang 032200， China； 2. Medical System Biology Research Center， Tsinghua University School of Medicine， Beijing 100084， China； 3. National Engineering Research Center for Beijing Biochip Technology（CapitalBio）， Beijing 102206， China]

ABSTRACT OBJECTIVE： To investigate the effects of Dendrobium officinale polysaccharides on gene expression profile of HUVEC. METHODS： HUVEC was selected as objects. MTS method was used to detect the effects of different doses of D. officinale polysaccharides （50， 100， 200， 400， 800 μg/mL） on the proliferation activity of HUVEC. The growth inhibitory concentration of 30% cells （IC30） was calculated to screen the dose of follow-up tests. cDNA microarray assay was used to detect the changes of gene expression profile for HUVEC after treated with D. officinale polysaccharides for 24 h， so as to screen differentially expressed genes. GO enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis were performed for top 5 differentially expressed genes by using DAVID bioinformatics resource database. Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction （qRT-PCR） was used to validate the results of microarray detection with immunity-related differentially expressed genes as objects. RESULTS： After treated with 100， 200， 400， 800 μg/mL D. officinale polysaccharides， survival rate of HUVEC were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）. IC30 value was 408 μg/mL. After treated with 400 μg/mL （by IC30） D. officinale polysaccharides， there were 91 differentially expressed genes in HUVEC cells， of which 84 were up-regulated and 7 were down-regulated. Top 5 genes of up-regulated and down- regulated expression were SELE， CCL2， CXCL6， IL8， ICAM1 as well as VWCE， CPT1A， CLU， CCL14， CINS4， which may be mainly associated with immune conditions and inflammatory responses. The differentially expressed genes mainly distributed in extracellular domain， and were enriched in biological processes such as production and response of cytokines and stimulus response， and played molecular functions such as chemokine and its receptor activity. The up-regulated genes as SELE， ICAM1 and CXCL2 were mainly enriched in TNF signaling pathway， influenza A （H1N1）， herpes simplex virus infection and other pathways. The down-regulated gene CCL14 was mainly enriched in chemokine signaling pathway. Results of qRT-PCR validation tests showed that relative expression of ICAM1 was increased significantly， while that of CCL14 was decreased significantly （P<0.05）， which was in agreement with microarray detection results. CONCLUSIONS： After treated with D. officinale polysaccharides， the expression of 91 genes in HUVEC cells are different significantly， mainly being up-regulated. The differentially expressed genes may participate in immune regulation through TNF signaling pathway， influenza A （H1N1） and herpes simplex virus infection.

KEYWORDS Dendrobium officinale polysaccharides； HUVEC； Gene expression profile； Immune regulation

鐵皮石斛是蘭科植物鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）的干燥莖，是珍貴的藥用植物，素有“藥中黃金”之稱。據2015年版《中國藥典》（一部）記載，鐵皮石斛具有益胃生津、滋陰清熱、明目強身等功效[1]。多糖是鐵皮石斛的主要活性成分之一，其不僅能改善免疫系統功能，而且還具有較好的抗癌、抗炎、抗氧化等生物活性，同時在降糖方面也有一定的效果[2]。有研究表明，鐵皮石斛多糖可通過調節白細胞介素6（IL-6）編碼基因的表達來激活機體免疫系統[3]，可通過調控腫瘤壞死因子（TNF）信號通路來抑制細胞凋亡[4]，同時還可通過核因子κB（NF-κB）通路來調節炎癥反應[5]等。以往對鐵皮石斛多糖藥理作用的研究多局限于某一種疾病或某一條通路的數個基因，難以從基因層面全面了解其整體作用機制，而基因芯片技術的出現和發展打破了這種局限。其中，基因表達譜芯片的應用最為廣泛，技術也相對成熟。該技術是將cDNA或者寡核苷酸探針固定在芯片上，通過與樣品中帶熒光分子標記的mRNA雜交來檢測樣品中成千上萬個基因表達水平的變化情況，可高效、快速、高通量地分析相關生物學信息，從而實現對差異表達基因的大規模綜合分析[6]。本研究應用基因表達譜芯片技術檢測經鐵皮石斛多糖處理后免疫相關細胞人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）基因表達譜的變化情況 ，全面分析差異表達基因，揭示鐵皮石斛多糖免疫調節作用的潛在靶點，以期為進一步研究其藥理作用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

BJ-500A型粉碎機（德清拜杰電器有限公司）；RE-52AA型旋蒸濃縮儀（上海亞榮生化儀器廠）；Plus384型酶聯免疫檢測儀（美國Molecular Devices公司）；Nanodrop-2000型超微量分光光度計（美國Thermo Fisher Scientific公司）；BioMixer Ⅱ型芯片雜交儀、LuxScanTM 10KA型芯片掃描儀（北京博奧晶典生物技術有限公司）；7900型實時熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）儀（美國ABI公司）；MCO-15AC型CO2培養箱（日本Sanyo公司）。

1.2 藥材與試劑

鐵皮石斛飲片購自河北安國藥材市場，由安國市昌達中藥材飲片有限公司藥材檢驗室鑒定為蘭科植物鐵皮石斛（D. officinale Kimura et Migo）的干燥莖。

人類全基因組寡核苷酸微陣列芯片V2.0（北京博奧晶典生物技術有限公司，批號：CP.409060）；Cy5-dCTP、Cy3-dCTP溶液（美國GE Healthcare公司，批號分別為9662845、9553232）；ECM培養基（美國ScienCell公司，批號：1001）；胰酶、磷酸緩沖鹽溶液（PBS，pH為7.2～7.4）（美國HyClone公司，批號分別為150011、202904）；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTS）試劑盒（美國Promega公司，批號：0000065769）；Trizol RNA抽提試劑盒（美國Life Technologies公司，批號：15596018）；逆轉錄合成cDNA試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司，批號：303761）；DEPC水（北京鼎國昌盛生物技術有限公司，批號：54100140）；SYBR Green Master Mix（美國Kapa Biosystems公司，批號：4928）；其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 細胞

HUVEC細胞購自美國ATCC公司。

2 方法

2.1 鐵皮石斛多糖的提取

取鐵皮石斛飲片適量，用粉碎機粉碎。取上述粉末適量，以水為溶劑按料液比1 ∶ 20（g/mL）回流提取2 h，提取液以4 000 r/min離心10 min后，取上清液，減壓濃縮至10 mL，加入乙醇40 mL（乙醇終濃度為80%），于4 ℃靜置24 h后，以4 000 r/min離心10 min，棄去上清液，沉淀以 95%乙醇25 mL洗滌，以4 000 r/min離心5 min后，棄去上清液，沉淀按上述條件重復處理1次，棄去上清液，沉淀經干燥后，即得鐵皮石斛多糖，得率為30.8%（即鐵皮石斛多糖質量與鐵皮石斛飲片粉末質量的百分比）。將上述多糖溶于適量PBS中，制得質量濃度為50 mg/mL（以多糖質量計）的貯備液，于4 ℃冰箱中保存，備用。

2.2 鐵皮石斛多糖劑量的篩選

采用MTS法檢測鐵皮石斛多糖對HUVEC細胞增殖活性的影響，并以此篩選后續研究的劑量。將HUVEC細胞置于ECM培養基中，于37 ℃、5%CO2條件下（下同）培養。取對數生長期HUVEC細胞適量，以0.25%胰酶消化、傳代至所需量，再以0.25%胰酶消化，收集細胞，用ECM培養基重懸，得密度為1×105個/mL的單細胞懸液，以100 μL/孔接種于96孔板中，培養過夜后，將細胞隨機分為對照組和鐵皮石斛不同劑量組（50、100、200、400、800 μg/mL，劑量設置參考文獻[7]），每組設置3個復孔。對照組加入PBS 1.6 μL，各給藥組分別加入“2.1”項下多糖貯備液0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 μL（各組總體積均為100 μL），培養24 h后，吸棄培養基，按照試劑盒說明書加入MTS試劑，用酶聯免疫檢測儀于490 nm波長處檢測每孔吸光度（A），并計算細胞存活率和30%細胞生長抑制濃度（IC30），細胞存活率=[（實驗組細胞平均A值-空白組細胞平均A值）/（對照組細胞平均A值-空白組細胞平均A值）]×100%（式中，“空白組”為不加細胞、不加藥的陰性對照）。上述試驗重復3次。

2.3 鐵皮石斛多糖對HUVEC細胞基因表達譜的影響

2.3.1 HUVEC細胞總RNA的提取 取對數生長期的HUVEC細胞，用ECM培養基重懸后，按6×105個/孔接種于6孔板中，培養過夜，待細胞貼壁后，將細胞隨機分為對照組和鐵皮石斛多糖組（400 μg/mL，劑量設置參考“2.2”項下IC30值），每組設置3個復孔。對照組加入PBS 8 μL，給藥組加入“2.1”項下多糖貯備液8 μL（各組總體積均為1 mL），培養24 h。收集細胞，使用Trizol RNA抽提試劑盒并按照其說明書提取各組細胞的總RNA，使用超微量分光光度計分別于230、260、280 nm處檢測各孔的A值（其中，A260 nm與核酸濃度相關，A280 nm與蛋白質或氨基酸濃度相關，A230 nm與碳水化合物濃度相關），計算RNA的濃度（RNA濃度與A260 nm/A280 nm呈正比）。

2.3.2 探針標記、芯片雜交與圖像采集、分析 取“2.3.1”項下各組細胞RNA適量，按照逆轉錄合成cDNA試劑盒說明書進行擴增、轉錄后，得cDNA，以Cy5- dCTP、Cy3-dCTP溶液分別標記對照組和給藥組，并設置熒光交換。將標記好的探針等量混勻后，置于預雜交好的基因芯片上，放至芯片雜交儀中，于42 ℃雜交過夜，取出，用水清洗2次，每次5 min，晾干后，使用芯片掃描儀對基因芯片進行掃描，采用LuxScanTM v3.0圖像分析軟件分析標記物Cy5、Cy3熒光強度，并對數據進行歸一化處理以校正系統誤差，將Cy3與Cy5熒光強度的比值（Ratio）大于2（上調）或小于0.5（下調）的基因判定為差異基因[8][基因名稱及其功能通過查詢NCBI數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/）予以確定]。

2.3.3 生物信息學分析 利用DAVID生物信息學資源數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/）對“2.3.2”項所得差異基因進行GO富集分析，獲知其潛在作用靶點的功能分布（細胞部位、生物學過程、分子功能）；同法進行KEGG通路富集分析，獲知其潛在作用靶點的通路分布。GO和KEGG詞條的富集程度均以P表示，P值越小，表明其生物學富集途徑越顯著（P<0.05為差異有統計學意義）。

2.3.4 差異表達基因的驗證 分別取“2.3.1”項下兩組細胞RNA 1 μg，使用逆轉錄合成cDNA試劑盒將其逆轉錄為cDNA（反應體系20 μL，反應條件：37 ℃反轉錄60 min，95 ℃變性5 min；嚴格按照其說明書操作）。引物設計采用Primer Premier 5.0軟件，引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）體系（總體積10 μL）：cDNA（經DEPC水稀釋10倍）3 μL，目的基因上、下游引物（5 μmol/L）各 1 μL，SYBR Green Master Mix 5 μL。反應條件：95 ℃ 預變性3 min，95 ℃ 變性3 s，60 ℃ 退火30 s，共40個循環。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）基因作為內參，根據各組樣品熒光信號到達設定域值所經歷的循環數（Ct值），運用2-ΔΔCt法[9]計算兩組細胞差異表達基因的相對表達量。

2.4 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件對數據進行統計分析。計量資料以x±s表示，兩組間比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 劑量篩選結果

與對照組比較，100、200、400、800 μg/mL鐵皮石斛多糖組細胞存活率均顯著降低，差異均有統計學意義（P<0.05或P<0.01），詳見表1。此外，鐵皮石斛多糖的IC30值為408 μg/mL，故最終選擇400 μg/mL的鐵皮石斛多糖進行后續試驗。

3.2 芯片雜交結果

經400 μg/mL鐵皮石斛多糖作用24 h后，HUVEC細胞中存在表達差異的基因共91個，其中表達上調（Ratio>2）的有84個、表達下調（Ratio<0.5）的有7個，見圖1。將Ratio值由大到小進行排序，分別選取上調和下調表達差異前5位的基因（上調表達基因：SELE、CCL2、CXCL6、IL8、ICAM1，下調表達基因：VWCE、CPT1A、CLU、CCL14、GINS4），其基因名稱及功能見表2。

3.3 差異表達基因的生物信息學分析結果

GO富集分析結果顯示，上調表達基因多集中在胞外部分區域，且主要通過細胞因子的產生及反應等生物學過程其發揮趨化因子受體等分子功能；下調表達基因主要集中在胞外區域，且主要通過刺激反應等生物學過程來發揮趨化因子受體等分子功能，詳見圖2。

KEGG通路富集分析顯示，經鐵皮石斛多糖作用后，HUVEC細胞上調表達基因主要富集于TNF信號通路、甲型H1N1流感、單純皰疹病毒感染、麻疹、趨化因子信號通路、類風濕性關節炎等通路上，包括SELE、CCL2、ICAM1、CXCL2、CXCL6等基因；而下調表達基因主要富集于趨化因子信號通路上，包括CCL14基因，詳見表3。

3.4 差異表達基因的qRT-PCR驗證

根據“3.3”項下結果，本研究從上調和下調表達基因中分別選取1個與免疫相關的代表性基因（即ICAM1、CCL14基因[10-11]）進行qRT-PCR驗證。ICAM1基因上游引物：5′-GTGGTCTGTTCCCTGGACG-3′，下游引物5′- GCACATTCACGGTCACCTC-3′；CCL14基因上游引物：5′-CCAAGCCCGGAATTGTCTTCA-3′，下游引物：5′-GGGTTGGTACAGACGGAATGG-3′；內參基因上游引物：5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′，下游引物：5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′。qRT-PCR分析結果顯示，與對照組比較，400 μg/mL鐵皮石斛多糖組ICAM1基因的相對表達量顯著升高，CCL14基因的相對表達量顯著降低，差異均有統計學意義（P<0.05），與芯片檢測結果一致，詳見表4。

4 討論

多糖是鐵皮石斛的主要成分之一，有研究表明鐵皮石斛多糖具有一定的免疫活性[12]。據相關文獻報道，鐵皮石斛多糖是一種可保護HUVEC細胞功能的藥物，在發生氧化應激損傷時，其可通過抑制炎癥因子的過表達來保護HUVEC細胞，對糖尿病血管病變的早期干預及保護具有一定的作用[13]。有研究從細胞水平探討了鐵皮石斛多糖對小鼠T淋巴細胞轉化功能、自然殺傷細胞活性以及巨噬細胞吞噬作用的影響，發現其可明顯提高S180荷瘤小鼠的上述功能，具有一定的免疫調節功能[14]。上述研究對鐵皮石斛多糖的藥理研究多局限于某幾個基因或某幾條通路，難以從整體的角度全面觀察藥物的作用機制。基因表達譜芯片技術可高效、快速地對相關生物學信息進行高通量分析，進而從全基因組層面尋找差異表達基因，以便更為全面地匯總藥物潛在作用靶點的通路信息[6]。目前，利用基因芯片等高通量技術對鐵皮石斛多糖的免疫調節作用進行全面研究的相關文獻較少，且有關其作用于HUVEC細胞（HUVEC細胞能產生多種免疫因子，是機體發揮免疫功能的重要細胞[15]）的報道更為鮮見。為此，本研究通過MTS試驗篩選鐵皮石斛多糖的試驗劑量，并利用基因表達譜芯片技術探討了經鐵皮石斛多糖處理后HUVEC細胞基因表達譜的變化情況。

結果顯示，經100、200、400、800 μg/mL鐵皮石斛多糖作用24 h后，HUVEC細胞的存活率均較對照組顯著降低，差異均有統計學意義，提示鐵皮石斛多糖對HUVEC細胞的增殖具有一定的抑制作用。此外，鐵皮石斛多糖的IC30值為408 μg/mL，故將400 μg/mL作為后續研究的劑量。

基因芯片結果顯示，經鐵皮石斛多糖處理后，HUVEC細胞中共有差異表達基因91個，其中表達上調的有84個、表達下調的有7個。Ratio值排序前5位的上調表達基因分別為SELE、CCL2、CXCL6、IL8、ICAM1，主要與免疫調節、炎癥反應等有關；Ratio值排序前5位的下調表達基因分別為VWCE、CPT1A、CLU、CCL14、CINS4，主要與腫瘤、免疫調節等有關。GO富集分析結果顯示，經鐵皮石斛多糖處理后，HUVEC細胞的差異表達基因主要分布于胞外區域，通過細胞因子的產生及反應、刺激反應等生物學過程來發揮趨化因子及其受體活性等分子功能。這提示鐵皮石斛多糖的免疫調節作用可能與促進HUVEC細胞表面免疫相關趨化因子及其受體等的表達有關。KEGG通路富集分析結果顯示，經鐵皮石斛多糖作用后，HUVEC細胞上調表達基因主要富集于TNF信號通路、甲型H1N1流感、單純皰疹病毒感染、麻疹、趨化因子信號通路、類風濕性關節炎等通路上，可見SELE、CCL2、ICAM1、CXCL2、CXCL6等基因；而下調表達基因主要富集于趨化因子信號通路上，如CCL14基因。

結合GO富集分析和KEGG通路富集結果，本研究選擇與免疫調節作用相關的代表性基因進行qRT-PCR驗證。其中，上調表達基因ICAM1編碼蛋白是免疫球蛋白超家族的成員之一，其表達與細胞內多種抗炎通路有關，上調ICAM1基因的表達可促進抗炎效果、修復機體炎癥損傷，是抗炎關鍵性分子之一[10]；此外，ICAM1介導的信號通路的激活可促進T細胞的生長與活化，并促進細胞因子的釋放，從而激活機體免疫系統、提高機體免疫力[16]。CCL14基因編碼蛋白又稱血漿過濾CC趨化因子，在免疫相關疾病中，可活化巨噬細胞，參與免疫調節，該基因表達的降低可抑制巨噬細胞的活化，并減輕機體炎癥反應[11]。本研究采用qRT-PCR法對ICAM1、CCL14基因的表達情況進行了驗證。結果顯示，經鐵皮石斛多糖處理后，HUVEC細胞中ICAM1基因的相對表達量較對照組顯著升高，CCL14基因的相對表達量較對照組顯著降低，差異均有統計學意義，與基因譜芯片檢測結果一致，進一步佐證了鐵皮石斛的免疫調節及抗炎作用。

綜上所述，經鐵皮石斛多糖處理后，HUVEC細胞共有91個基因表達差異明顯，且以表達上調為主；表達差異基因可能通過TNF信號通路、甲型H1N1流感、單純皰疹病毒感染等通路參與機體免疫調節。本研究通過分析鐵皮石斛多糖作用于HUVEC細胞后基因表達譜的變化以及差異表達基因的富集通路，可初步探索其在免疫調節過程中的分子機制，可為全面闡明其藥理作用機制提供參考。但是，目前關于上述基因與免疫相關疾病的研究有限，鐵皮石斛多糖如何通過調控靶基因的表達來增強機體免疫功能尚有待深入研究；此外，上述潛在靶基因及富集通路仍有待在體研究進一步驗證。

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（收稿日期：2018-09-16 修回日期：2019-01-12）

（編輯：張元媛）