鴉膽子素D聯合紫杉醇對胰腺癌Capan—2細胞增殖的抑制作用及機制研究

黃玉玉 饒明君 譚筆琴 王慧銘 林能明

摘 要 目的：探討鴉膽子素D（BD）聯合紫杉醇（Taxol）對人胰腺癌Capan-2細胞增殖的抑制作用及可能機制。方法：以Capan-2細胞為對象，采用磺酰羅丹明B法檢測不同劑量BD（5、10、15、20 μmol/L）、Taxol（10、20、30、40 nmol/L）、BD+Taxol（5 μmol/L+10 nmol/L、10 μmol/L+20 nmol/L、15 μmol/L+30 nmol/L、20 μmol/L+40 nmol/L）作用48 h后的細胞增殖情況，并計算細胞存活率和藥物合用指數（CI）。采用克隆形成試驗檢測BD（20 μmol/L，下同）、Taxol（40 nmol/L，下同）、BD+Taxol（20 μmol/L+40 nmol/L，下同）作用24 h后的細胞克隆集落形成情況，并計算克隆形成率；采用DAPI染色法觀察BD、Taxol、BD+Taxol作用24 h后的細胞凋亡情況，采用Western blotting法檢測的BD、Taxol、BD+Taxol作用后凋亡相關蛋白[Bcl-2、多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶（PARP）、胱天蛋白酶3（Caspase-3）、切割胱天蛋白酶3（Cleaved-caspase-3）；藥物作用48 h]以及c-Jun氨基末端激酶（JNK）、磷酸化c-Jun氨基末端激酶（p-JNK）蛋白（藥物作用4、6、12 h）的表達情況。結果：經10、15、20 μmol/L BD，20、30、40 nmol/L Taxol以及兩藥上述劑量聯合作用48 h后，細胞的存活率均顯著降低，且聯用組顯著低于BD、Taxol同劑量單藥組（P<0.05），各聯用組（BD 5 μmol/L+Taxol 10 nmol/L、BD 10 μmol/L+Taxol 20 nmol/L、BD 15 μmol/L+Taxol 30 nmol/L、BD 20 μmol/L+Taxol 40 nmol/L）的CI值分別為0.63±0.04、0.68±0.08、0.89±0.12、0.84±0.05。經20 μmol/L BD、40 nmol/L Taxol以及兩藥上述劑量聯合作用后，細胞的克隆集落形成有所減少，并伴有不同程度的染色質濃聚和細胞核皺縮，細胞的克隆形成率（24 h）以及Bcl-2（48 h）、RAPR（48 h）、Caspase-3（48 h）、JNK（4、6 h，Taxol單藥組除外）的相對表達量均顯著降低，Cleaved-caspase-3（48 h）、p-JNK（4、6、12 h）的相對表達量均顯著升高，且BD+Taxol聯用組均顯著優于同時間點BD、Taxol同劑量單藥組[JNK（4、6、12 h）、p-JNK（4 h）除外]（P<0.05或P<0.01）。結論：BD、Taxol均可抑制人胰腺癌Capan-2細胞的增殖并促進其凋亡，且兩者聯合具有一定的協同作用，效果優于任一藥物單用。上述作用可能與激活Caspase通路以及JNK磷酸化等途徑有關。

關鍵詞 鴉膽子素D；紫杉醇；人胰腺癌；Capan-2細胞；增殖；凋亡；胱天蛋白酶；c-Jun氨基末端激酶

Study on Inhibitory Effects and Mechanism of Bruceanine D Combined with Taxol on the Proliferation of Human Pancreatic Cancer Capan-2 Cells

HUANG Yuyu1，2，RAO Mingjun1，2，TAN Biqin1，3，WANG Huiming2，LIN Nengming1，2，3（1. No. 4 Clinical Medical School， Zhejiang University of TCM， Hangzhou 310006， China； 2. College of Pharmacology， Zhejiang University of TCM， Hangzhou 310053， China； 3. Dept. of Clinical Pharmacology， the Affiliated Hangzhou First People’s Hospital， Zhejiang University School of Medicine， Hangzhou 310006， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To investigate the inhibitory effect and potential mechanism of Brucein D （BD） combined with Taxol on the proliferation of human pancreatic cancer Capan-2 cells. METHODS： Using Capan-2 cells as object， the proliferations after treated with BD （5， 10， 15， 20 μmol/L）， Taxol （10， 20， 30， 40 nmol/L） and BD+Taxol （5 μmol/L+10 nmol/L， 10 μmol/L+20 nmol/L， 15 μmol/L+30 nmol/L， 20 μmol/L+40 nmol/L） for 48 h were determined by sulfonyl rhodamine B method. Survival rate of cells and combination index （CI） were calculated. The clone formation assay was performed to detect the formation of clonal colonies after treated with BD （20 μmol/L，hereinafter）， Taxol （40 nmol/L，hereinafter）、BD+Taxol （20 μmol/L+40 nmol/L，hereinafter） for 24 h. The rate of clone formation was calculated. DAPI method was used to observe the apoptosis of cells after treated with BD， Taxol and BD+Taxol for 24 h. Western blotting was used to detect the expression of apoptosis-related protein （Bcl-2， PARP， Caspase-3， Cleaved-caspase-3） after treated by BD， Taxol， BD+Taxol for 48 h and the expression of JNK and p-JNK after treated by BD， Taxol， BD+Taxol for 4， 6， 12 h. RESULTS： After treated with 10， 15 and 20 μmol/L BD， 20， 30 and 40 nmol/L Taxol or two-drug combination for 48 h， survival rates of cells were decreased significantly； the survival rate of drug combination group was significantly lower than the same dose of BD group and Taxol group （P<0.05）. CI values of drug combination groups （BD 5 μmol/L+Taxol 10 nmol/L， BD 10 μmol/L+Taxol 20 nmol/L， BD 15 μmol/L+Taxol 30 nmol/L， BD 20 μmol/L+Taxol 40 nmol/L） were 0.63±0.04， 0.68±0.08， 0.89±0.12 and 0.84±0.05. After treated with 20 μmol/L BD， 40 nmol/L Taxol and two-drug combination， the formation of clonal colonies was decreased with different degrees of chromatin concentration and nuclear shrinkage； the rate of clone formation （24 h）， the expression of Bcl-2 （48 h）， PARP （48 h）， Caspase-3 （48 h） and JNK （4， 6 h， except for Taxol group） were decreased significantly， while the relative expression of Cleaved-caspase-3 （48 h） and p-JNK （4， 6， 12 h） were increased significantly. Those of BD+Taxol group were significantly better than those of BD group and Taxol group [except for JNK （4， 6， 12 h）， p-JNK （4 h）] （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： Both BD and Taxol can inhibit the proliferation and promote apoptosis of human pancreatic cancer Capan-2 cells， and the combination have a certain synergistic effect， which is better than any single drug. It may be associated with activating Caspase pathway and JNK phosphorylation.

KEYWORDS Brucerin D； Taxol； Human pancreatic cancer； Capan-2 cells； Proliferation； Apoptosis； Caspase； JNK

胰腺癌為常見惡性腫瘤，是所有實體瘤中患者生存率較低的類型之一[1]。胰腺癌前期起病隱匿，不易察覺，約80%的患者在確診時已經失去了手術機會，故放化療是胰腺癌治療不可替代的重要手段之一，但預后不良、易復發等缺點嚴重影響了治療的效果[2-3]。目前，臨床多以白蛋白結合型紫杉醇（Albuminbound taxol）聯合吉西他濱作為一線方案來治療胰腺癌，但療效不佳，且備選藥物有限[4]。紫杉醇（Taxol）作為治療胰腺癌的一線用藥，具有較強的腫瘤細胞生長抑制作用，但因其具有較大的肝毒性及免疫抑制作用，該藥的臨床應用受到了一定的限制[5-6]。有研究表明，Taxol與中藥的聯合應用可通過多種途徑增強抗腫瘤效果，并有助于減輕毒副作用[7-8]。Newman DJ等[9]研究指出，全世界經批準上市的抗腫瘤藥物中有73%不是化學合成藥物，且大部分都是從天然產物中獲得或直接由天然化合物衍生而成的。我國中藥資源豐富，多種中藥活性成分正處于開發階段，因此聯合應用中藥活性成分對于提高化療藥物抗腫瘤活性具有重要的意義。

鴉膽子別名老鴉膽、苦參子，為苦木科植物鴉膽子[Brucea javanica （L.） Merr.]的干燥成熟果實。鴉膽子素D（BD）是從鴉膽子果實中提取的一種水溶性三環四萜類化合物，研究表明其可以誘導多種腫瘤細胞發生凋亡，具有一定的抗腫瘤活性[10]。雖然BD單體對胰腺癌細胞具有一定的抑制活性[11-12]，但尚未見其與一線藥物聯合應用及其機制研究的相關報道。為此，本研究觀察了BD聯合Taxol對人胰腺癌細胞株Capan-2的抑制作用，并初步探討了其可能機制，以期為胰腺癌的臨床治療提供新的思路。

1 材料

1.1 儀器

SpactraMax i3x型全波長多功能酶標儀（美國Molecular Devices公司）；FACSCanto Ⅱ型流式細胞儀（美國BD公司）；5418R型高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；IX71型倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）；Friendensplatz 3型熒光顯微鏡（德國Leica公司）；ChemiDoc XRS+型凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司）；QB-8001型搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；DHG-9053A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）；3111型細胞培養箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

1.2 藥品與試劑

BD對照品（上海盛中醫藥化工有限公司，批號：PRF9041122，純度：≥98%）；紫杉醇注射液（Hospira Australia Pty Ltd.，批號：E036853AA，規格：5 mL ∶ 30 mg）；胎牛血清（批號：10270-106）、青霉素鏈霉素雙抗（批號：1953098）、0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）消化液（批號：25200-056）、RPMI 1640培養基（批號：AD17321266）均購自美國Gibco公司；磷酸鹽緩沖液（PBS，pH為7.3～7.5，美國Hyclone公司，批號：ABC212871）；4′，6-聯脒-2-苯基吲哚（DAPI）染色液（批號：061518181024）、乙基苯基聚乙二醇（NP-40）裂解液（批號：070918181105）、超敏ECL化學發光試劑盒（BeyoECL Plus）（批號：111717171122）、二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒（批號：070618181008）均購自碧云天生物技術研究所；0.4%磺酰羅丹明B（SRB）染色液（美國Sigma-Aldrich公司，批號：1002459715）；三羥甲基氨基甲烷（Tris）[生工生物工程（上海）股份有限公司，批號：E802BA0003；使用前用水稀釋，得pH為10.5的10 mmol/L Tris堿性緩沖溶液]；兔c-Jun氨基末端激酶（JNK）單克隆抗體（批號：ab179461）、兔磷酸化c-Jun氨基末端激酶（p-JNK）單克隆抗體（批號：ab76572）、兔Bcl-2單克隆抗體（批號：ab32124）、鼠β-肌動蛋白（β-actin）單克隆抗體（內參，批號：ab8226）均購自美國Abcam公司；兔多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶（PARP）單克隆抗體（批號：9532S）、兔胱天蛋白酶3（Caspase-3）單克隆抗體（批號：9662S）、兔切割胱天蛋白酶3（Cleaved-caspase-3）單克隆抗體（批號：9664S）均購自美國CTS公司；山羊抗大鼠辣根過氧化酶（HRP）標記二抗（批號：9300003001）、山羊抗兔HRP標記二抗（批號：9300014001）均購自武漢艾博泰克生物科技有限公司；三氯乙酸（TCA）、乙酸等試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 細胞

人胰腺癌細胞株Capan-2由上海富衡生物科技有限公司提供。

2 方法

2.1 細胞培養

將Capan-2細胞置于含10%胎牛血清、1%青霉素鏈霉素雙抗的RPMI 1640培養基中，置于37 ℃、5%CO2（下同）培養箱中進行培養，每2～3天更換1次培養基，用胰蛋白酶-EDTA消化液消化傳代。

2.2 SRB法檢測BD和Taxol聯用對Capan-2細胞增殖的影響

取對數生長期Capan-2細胞，經胰蛋白酶-EDTA消化液消化后計數，按2×103個/孔接種至96孔板中（每孔100 μL），培養至細胞貼壁后，將其隨機分為空白組（不含細胞和藥物）、對照組（含細胞但不含藥物）以及BD單藥組（5、10、15、20 μmol/L，劑量設置參考本課題組前期試驗結果）、Taxol單藥組（10、20、30、40 nmol/L，劑量設置參考本課題組前期試驗結果）、BD+Taxol聯用組（BD 5 μmol/L+Taxol 10 nmol/L、BD 10 μmol/L+Taxol 20 nmol/L、BD 15 μmol/L+Taxol 30 nmol/L、BD 20 μmol/L+Taxol 40 nmol/L，劑量設置參考本課題組前期試驗結果），每組設置3個復孔。空白組和對照組均加入RPMI 1640培養基100 μL，各給藥組加入含相應藥物的RPMI 1640培養基100 μL，培養48 h后，加入10%TCA溶液，于4 ℃固定1 h，棄去上清液，用水清洗，置于干燥箱中烘干；隨后加入0.4%SRB染色液染色30 min，用1%乙酸溶液清洗后，置于干燥箱中烘干；隨后加入10 mmol/L Tris堿性緩沖溶液，用全波長多功能酶標儀于570 nm波長處檢測各孔的光密度（OD）值，并計算細胞存活率[細胞存活率=（各試驗組平均OD值-空白組平均OD值）/（對照組平均OD值-空白組平均OD值）×100%]，并使用CompuSyn 1.0.1軟件計算藥物合用指數（CI）[CI=DA/DXA+DB/DXB。式中，DA、DB分別為兩藥聯用產生某（X）效應時所需的濃度，DXA、DXB分別為兩藥單用產生某（X）效應時所需的濃度]。當CI<1時，表示兩藥聯合有協同作用；當CI=1時，表示兩藥聯合有相加作用；當CI>1時，表示兩藥聯合有拮抗作用[13-14]。上述試驗重復3次（下同）。

2.3 克隆形成試驗檢測BD和Taxol聯用對Capan-2細胞克隆形成能力的影響

取對數生長期Capan-2細胞，經胰蛋白酶-EDTA消化液消化后計數，按1 500個/孔接種于6孔板中（每孔2 mL），培養24 h后，將細胞隨機分為空白對照組以及BD單藥組（20 μmol/L，劑量設置參考“2.2”項下試驗結果）、Taxol單藥組（40 nmol/L，劑量設置參考“2.2”項下試驗結果）、BD+Taxol聯用組（20 μmol/L+40 nmol/L，劑量設置參考“2.2”項下試驗結果），每組設置3個復孔。空白對照組加入RPMI 1640培養基2 mL，各給藥組加入含相應藥物的RPMI 1640培養基2 mL，培養24 h后，棄去培養基，加入含10%胎牛血清和1%青霉素鏈霉素雙抗的RPMI 1640培養基適量，按上述條件繼續培養，每3～4天更換1次培養基。2周后，棄去培養基，用PBS清洗后，加入0.1%結晶紫染色液染色1 h，用水清洗，置于干燥箱中烘干，使用倒置相差顯微鏡觀察細胞克隆集落形成情況，并計算克隆形成率[克隆形成率=（克隆集落形成數/細胞接種總數）×100%]。

2.4 DAPI染色法檢測BD和Taxol聯用對Capan-2細胞凋亡的影響

取對數生長期Capan-2細胞，經胰蛋白酶-EDTA消化液消化后計數，按8×104個/孔接種于6孔板中（每孔2 mL），培養24 h后，按“2.3”項下方法分組，每組設置3個復孔。空白對照組加入RPMI 1640培養基2 mL，各給藥組加入含相應藥物的RPMI 1640培養基2 mL，培養24 h后，棄去培養基，用PBS清洗，每孔加入4%多聚甲醛1 mL，避光固定20 min，再用PBS清洗，隨后每孔加入DAPI染色液500 μL，避光染色30 min，培養20 min，棄去染色液，加入PBS 1 mL，置于搖床中以100 r/min振搖5 min，棄去上清液，使用熒光顯微鏡觀察細胞核形態并拍照（凋亡細胞經DAPI染色呈現藍白色熒光：其中，早期凋亡細胞呈現核濃縮，染色加深，或核染色質呈現新月牙形；晚期凋亡細胞核破碎成大小不等的圓形小體，并被細胞膜包圍）。

2.5 Western blotting法檢測BD和Taxol聯用對Capan-2細胞凋亡相關蛋白以及JNK、p-JNK表達的影響

取對數生長期Capan-2細胞，經胰蛋白酶-EDTA消化液消化后計數，按8×104個/孔接種于6孔板中（每孔2 mL），培養24 h后，按“2.3”項下方法分組，每組設置3個復孔。空白對照組加入RPMI 1640培養基2 mL，各給藥組加入含相應藥物的RPMI 1640培養基2 mL，培養，并于不同時間點[凋亡相關蛋白（48 h），JNK、p-JNK（4、6、12 h）]收集細胞。所得細胞經胰蛋白酶-EDTA消化液消化后，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基適量，終止消化，以1 200 r/min離心5 min，棄去上清液，沉淀經NP-40裂解液裂解后，采用BCA法測定其總蛋白的含量。以β-actin為內參進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳（電壓：330 V，時間：65 min），并于電泳結束后轉移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）膜上，用5%全脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入相應一抗[Bcl-2 （1 ∶ 5 000）、PARP（1 ∶ 1 000）、Caspase-3（1 ∶ 1 000）、Cleaved-caspase-3（1 ∶ 500）、JNK（1 ∶ 5 000）、p-JNK （1 ∶ 5 000）、β-actin（1 ∶ 1 000）]，于4 ℃孵育過夜；用TBST溶液清洗3次，每次10 min；加入相應二抗（內參：山羊抗大鼠HRP標記二抗，其余蛋白：山羊抗兔HRP標記二抗；加入量均為1 ∶ 5 000），于室溫孵育2 h，再用TBST溶液清洗3次，每次10 min。以BeyoECL Plus顯色后，置于凝膠成像系統上成像，并采用Image J 1.46r軟件進行分析。以目標蛋白條帶灰度值與內參β-actin條帶灰度值的比值表示目標蛋白的相對表達量。

2.6 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件對數據進行統計分析。計量資料以x±s表示，采用單因素方差分析或t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 BD和Taxol聯用對Capan-2細胞增殖的影響

藥物作用48 h后，BD、Taxol以及兩者聯用對Capan-2細胞的增殖均有不同程度的抑制作用：與對照組比較，BD 10、15、20 μmol/L組，Taxol 20、30、40 nmol/L組以及兩藥上述劑量聯用組細胞的存活率均顯著降低，且聯用組顯著低于BD、Taxol同劑量單藥組，差異均有統計學意義（P<0.05），詳見表1。

3.2 BD和Taxol聯用對Capan-2細胞克隆形成能力的影響

與空白對照組比較，BD單藥組、Taxol單藥組以及BD+Taxol聯用組細胞的克隆集落形成均有不同程度地減少，其克隆形成率均顯著降低，且BD+Taxol聯用組顯著低于BD、Taxol同劑量單藥組，差異均有統計學意義（P<0.05或P<0.01），詳見圖1、表2。

3.3 BD和Taxol聯用對Capan-2細胞凋亡的影響

空白對照組細胞形態飽滿，細胞膜和細胞核形態均較為完整，染色質均勻；BD單藥組細胞形態完整，染色質基本均勻；Taxol單藥組細胞可見細胞核染色質濃聚，部分細胞核皺縮呈月牙型；BD+Taxol聯用組細胞核皺縮愈明顯，染色質固縮，且凋亡的細胞數量也增加，詳見圖2（圖2C、2D中，“箭頭”表示皺縮的細胞核）。

3.4 BD和Taxol聯用對Capan-2細胞凋亡相關蛋白表達的影響

與空白對照組比較，BD單藥組、Taxol單藥組以及BD+Taxol聯用組細胞Bcl-2、PARP、Caspase-3蛋白的相對表達量均顯著降低，且BD+Taxol聯用組顯著低于BD、Taxol同劑量單藥組；Cleaved-caspase-3蛋白的相對表達量均顯著升高，且BD+Taxol聯用組顯著高于BD、Taxol同劑量單藥組，差異均有統計學意義（P<0.01），詳見圖3、表3。

3.5 BD和Taxol聯用對Capan-2細胞JNK、p-JNK蛋白表達的影響

與空白對照組比較，BD單藥組（4、6 h）以及BD+Taxol聯用組（4 h）細胞JNK蛋白的相對表達量均顯著降低，且BD+Taxol聯用組（4 h）顯著低于同時間點Taxol同劑量單藥組；BD單藥組、Taxol單藥組以及BD+Taxol聯用組（4、6、12 h）細胞p-JNK蛋白的相對表達量均顯著升高，且BD+Taxol聯用組（6、12 h）顯著高于同時間點BD、Taxol同劑量單藥組，差異均有統計學意義（P<0.05或P<0.01），詳見圖4、表4。

4 討論

鴉膽子首載于清代醫學家趙學敏的《本草綱目拾遺》，其果實已被廣泛應用于治療阿米巴痢疾、瘧疾和各種寄生蟲感染等疾病，并被用作中藥抗癌劑，用以治療食管癌、小細胞肺癌、胃癌等癥[15-17]。BD是從鴉膽子果實中提取的天然化合物，是鴉膽子發揮抗腫瘤活性的主要成分，雖然其對胰腺癌細胞株的抑制作用已有報道[17-18]，但關于其與一線抗癌藥物的協同抗腫瘤作用研究尚較為鮮見。為此，本研究初步考察了BD和Taxol聯用對人胰腺癌Capan-2細胞的體外抑制作用及其可能機制。

本研究采用SRB法評價了BD和Taxol聯用對Capan-2細胞增殖的影響。在前期預試驗中，本課題組設計了一系列劑量梯度（BD：0、5、10、15、20、25、30、35 μmol/L，Taxol：0、10、20、30、40、50、60、70 nmol/L），同時結合兩藥的半數抑制濃度[IC50；BD：（24.56±0.07）μmol/L，Taxol：（39.98±0.14）nmol/L]，最終將BD單用劑量確定為5、10、15、20 μmol/L，Taxol單用劑量確定為10、20、30、40 nmol/L，BD+Taxol聯用劑量確定為5 μmol/L+10 nmol/L、10 μmol/L+20 nmol/L、15 μmol/L+30 nmol/L、20 μmol/L+40 nmol/L。SRB試驗結果顯示，與對照組比較，BD 10、15、20 μmol/L組，Taxol 20、30、40 nmol/L組以及兩藥上述劑量聯用組細胞的存活率均顯著降低，且BD+Taxol聯用組顯著低于BD、Taxol同劑量單藥組，差異均有統計學意義；此外，BD 5 μmol/L+Taxol 10 nmol/L、BD 10 μmol/L+Taxol 20 nmol/L、BD 15 μmol/L+Taxol 30 nmol/L、BD 20 μmol/L+Taxol 40 nmol/L組的CI值分別為0.63±0.04、0.68±0.08、0.89±0.12、0.84±0.05。這提示BD、Taxol對Capan-2細胞的增殖均具有一定的抑制作用，且兩者聯用的抑制作用強于任一藥物單用，表明兩藥聯合具有一定的協同作用。

參考上述結果，本課題組分別考察了BD單藥（20 μmol/L）、Taxol單藥（40 nmol/L）、BD+Taxol聯用（20 μmol/L+40 nmol/L）對Capan-2細胞克隆形成和凋亡的影響。結果顯示，空白對照組細胞形態飽滿，細胞膜和細胞核形態均較為完整；與空白對照組比較，BD單藥組、Taxol單藥組以及BD+Taxol聯用組細胞均發生了不同程度的染色質濃聚、細胞核皺縮等形態學改變，各給藥組細胞克隆集落形成均有所減少，克隆形成率均顯著降低，且BD+Taxol聯用組顯著低于BD、Taxol同劑量單藥組，差異均有統計學意義。這提示BD、Taxol、BD+Taxol均可不同程度地促進Capan-2細胞凋亡，抑制其克隆形成，且兩藥聯用的效果明顯優于任一藥物單用。

有關研究發現，BD可通過誘導多種腫瘤細胞的凋亡來發揮抗腫瘤的作用[10-12]。細胞凋亡是細胞在一定的生理或病理條件下，受多種基因精確調控的主動的、程序化的死亡過程，是機體重要的自穩調節機制[19]。Bcl家族是線粒體凋亡通路的重要調節因子，其中Bak、Bax等蛋白可促進細胞凋亡，而Bcl-2、Mcl-1等蛋白則可抑制細胞凋亡[20]。Caspase家族是凋亡調控系統中備受關注的蛋白家族之一，在細胞凋亡的過程中發揮著極其關鍵作用，其引發的級聯反應是細胞凋亡的中心環節[21-22]。Caspase-3是Caspase家族的核心成員，位于級聯反應的下游，是誘導細胞凋亡的真正實施者；Cleaved-caspase-3是其活性形式，兩者均可作為衡量細胞凋亡的指標；PARP是Caspase-3的主要切割底物，其裂解片段的出現被認為是細胞凋亡的重要信號[23]。本研究結果顯示，與空白對照組比較，BD單藥組、Taxol單藥組以及BD+Taxol聯用組細胞Bcl-2、PARP、Caspase-3蛋白的相對表達量均顯著降低，且BD+Taxol聯用組顯著低于BD、Taxol同劑量單藥組；Cleaved-caspase-3蛋白的相對表達量均顯著升高，且BD+Taxol聯用組顯著高于BD、Taxol同劑量單藥組，差異均有統計學意義。這提示BD聯合Taxol可通過激活Caspase通路來誘導Capan-2細胞的凋亡。

除上述蛋白外，細胞凋亡還受多種因素的調節。近年來有學者發現，JNK信號通路介導了多種胞外刺激誘導的細胞凋亡，同時也參與了腫瘤細胞凋亡的發生過程[24]。JNK屬于促分裂原活化蛋白激酶（MAPKs）家族成員，當細胞受到外界刺激后，JNK通路會被激活，一部分活化的JNK會轉位至細胞核中，通過磷酸化修飾后形成p-JNK，后者可作用于Bcl家族中的促凋亡蛋白（Bax、Bak等），誘導細胞色素釋放至細胞質內，從而啟動細胞凋亡程序[25-27]。有研究指出，BD作用于人結腸癌HT29細胞后，細胞中JNK蛋白的表達會有所降低，而p-JNK的表達則會明顯升高[28]。本研究結果顯示，與空白對照組比較，BD單藥組（4、6 h）以及BD+Taxol聯用組（4 h）細胞JNK蛋白的相對表達量均顯著降低，且BD+Taxol聯用組（4 h）顯著低于同時間點Taxol同劑量單藥組；BD單藥組、Taxol單藥組以及BD+Taxol聯用組（4、6、12 h）細胞p-JNK蛋白的相對表達量均顯著升高，且BD+Taxol聯用組（6、12 h）顯著高于同時間點BD、Taxol同劑量單藥組，差異均有統計學意義，與上述研究[28]的結果基本一致。這提示BD聯合Taxol可通過激活JNK磷酸化來誘導Capan-2細胞的凋亡。

綜上所述，BD、Taxol均可抑制人胰腺癌Capan-2細胞的增殖并促進其凋亡，且兩者聯合具有一定的協同作用，效果優于任一藥物單用。上述作用可能與激活Caspase通路以及JNK磷酸化等途徑有關。但由于試驗條件的限制，本研究只初步探討了BD和Taxol聯用體外抗腫瘤的部分可能機制，后續還有待進一步明確JNK參與細胞凋亡的具體機制，并完善相應的在體研究。

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（收稿日期：2018-08-23 修回日期：2019-01-14）

（編輯：張元媛）