白及醇提物中5種主要活性成分的在體腸吸收特征研究

孫慧園 陳浩 梅朝葉 鄭林 鞏仔鵬 李月婷 李勇軍 黃勇

摘 要 目的：考察白及醇提物中主要活性成分4-（葡萄糖氧基）-肉桂酸葡萄糖氧基芐酯（A1）、2-異丁基蘋果酸（A2）、1，4-二[4-（葡萄糖氧）芐基]-2-異丁基蘋果酸酯（A3）、二氫菲1（A4）、1，4-二[4-（葡萄糖氧）芐基]-2-異丁基蘋果酸酯-2-（4-O-肉桂?；?6-O-乙?；┢咸烟擒眨ˋ5）在大鼠腸道中的吸收動力學特征。方法：以葛根素為內標，采用超高效液相色譜-串聯質譜法（UPLC-MS/MS）檢測腸循環液中A1～A5的質量濃度。色譜柱為Acquity UPLC BEH C18，流動相為乙腈（含0.1%甲酸）-水（含0.1%甲酸）（梯度洗脫），流速為0.35 mL/min，柱溫為45 ℃，進樣量為3 μL；采用電噴霧離子源，以多反應監測模式進行正、負離子掃描，用于定量分析的離子對分別為m/z 593.2→431.1（A1）、m/z 189.0→129.0（A2）、m/z 725.3→457.2（A3）、m/z 347.1→332.1（A4）、m/z 1 059.3→793.1（A5）、m/z 417.0→267.0（內標）。采用大鼠在體腸循環灌流模型，以累計吸收轉化率（A）和吸收轉化速率常數（Ka）為指標，考察不同劑量白及醇提物（低、中、高劑量分別為166、333、667 μg/mL）、膽汁、P-糖蛋白（P-gp）抑制劑（維拉帕米）、不同腸段對上述5種成分腸吸收的影響。結果：A1、A2、A3、A4、A5檢測質量濃度的線性范圍分別為0.22～14.00、0.34～21.75、1.99～127.16、0.15～9.75、0.16～10.00 μg/mL（r>0.99），定量下限分別為0.22、0.34、1.99、0.15、0.16 μg/mL，最低檢測限分別為0.028、0.085、0.251、0.035、0.010 μg/mL，日內、日間RSD均小于10%，方法回收率為83.60%～106.91%，基質效應不影響待測物的測定。白及醇提物低、中劑量組A1的A、Ka值均顯著高于高劑量組，低劑量組A3的A值顯著高于中、高劑量組（P<0.05或P<0.01）。不結扎組A1、A3的A、Ka值均顯著低于對照組，而A4的A、Ka值均顯著高于對照組（P<0.05或P<0.01）；P-gp抑制劑組A1、A3的A、Ka值均顯著低于對照組（P<0.05或P<0.01）。空腸組、回腸組、結腸組A1的A值以及結腸組A1的Ka值，結腸組A2的A、Ka值，回腸組A3的A值，回腸組、結腸組A4的A、Ka值，空腸組、回腸組A5的A值以及空腸組A5的Ka值均顯著低于十二指腸組；而空腸組、回腸組、結腸組A3的Ka值均顯著高于十二指腸組（P<0.05或P<0.01）。結論：本研究建立的UPLC-MS/MS法專屬性強、靈敏度高、操作簡便，可用于A1～A5的定量分析及藥動學研究。白及醇提物中5種活性成分均為全腸道吸收，且吸收腸段各有不同；A1、A3在腸道中的吸收較多，可能已達飽和；膽汁可抑制A1、A2的腸吸收，但可促進A4的腸吸收；A1～A5可能均不是P-gp的底物。

關鍵詞 白及醇提物；活性化合物；在體腸循環灌流模型；超高效液相色譜-串聯質譜法；腸吸收特征

Study on Intestinal Absorption Characteristics of 5 Active Components in Ethanol Extract from Bletilla striata

SUN Huiyuan1，2，CHEN Hao2，MEI Chaoye2，ZHENG Lin1，GONG Zipeng1，LI Yueting1， LI Yongjun3，HUANG Yong1 [1. Guizhou Provincial Key Laboratory of Pharmaceutics/State Key Laboratory of Functions and Applications of Medicinal Plants， Guizhou Medical University， Guiyang 550004， China； 2. School of Pharmacy， Guizhou Medical University， Guiyang 550004， China； 3. Engineering Research Center for the Development and Application of Ethnic Medicine and TCM （Ministry of Education）， Guizhou Medical University， Guiyang 550004， China]

ABSTRACT OBJECTIVE： To investigate absorption kinetic characteristics of main active components as 4-（glucoseoxy）- glucoseoxybenzyl cinnamate （A1）， 2-isobutyl malic acid （A2）， 1，4-bis [4-（glucoxy） benzyl]-2-isobutyl malic acid ester （A3）， dihydrophenanthrenes 1 （A4） and 1，4-bis [4-（glucosoxy） benzyl]-2-isobutyl malic acid ester-2-（4-O-cinnamoyl-6-O-acetyl） glucoside （A5） from ethanol extract of Bletilla striata in the intestines of rats. METHODS： Using puerarin as internal standard， UPLC-MS/MS was used to determined the concentration of A1-A5 in intestinal circulation fluid. The determination was performed on Acquity UPLC BEH C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile （containing 0.1% formic acid）-water （containing 0.1% formic acid） （gradient elution） at the flow rate of 0.35 mL/min. The column temperature was 45 ℃， and sample size was 3 μL. The positive ion and negative ion scanning were carried out in the multiple reaction monitoring mode by electrospray ion source. The ion pairs for quantitative analysis were m/z 593.2→431.1 （A1）， m/z 189.0→129.0 （A2）， m/z 725.3→457.2 （A3）， m/z 347.1→332.1 （A4）， m/z 1 059.3→793.1 （A5）， m/z 417.0→267.0 （internal standard）. In the in vivo intestinal circulation perfusion model， using accumulative absorption transfer rate （A） and absorption and transformation rate constant （Ka） as indexes， the effects of different doses of ethanol extract from B. striata （low-， medium-， high-dose were 166， 333，667 μg/mL，respectively）， bile， P-glycoprotein （P-gp） inhibitors （verapamil） and different intestinal segments on the absorption of above 5 components were investigated. RESULTS： The linear range of A1， A2， A3， A4 and A5 were 0.22-14.00， 0.34-21.75， 1.99-127.16， 0.15-9.75， 0.16-10.00 μg/mL（r>0.99）. The limits of quantitation were 0.22， 0.34， 1.99， 0.15， 0.16 μg/mL， respectively. The lowest detection limits were 0.028， 0.085， 0.251， 0.035 and 0.010 μg/mL. RSDs of inter-day and intra-day were all lower than 10%. The recoveries ranged 83.60%-106.91%. Matrix effect did not affect the determination of the substance to be measured. A and Ka values of A1 in B. striata ethanol extract low-dose and medium-dose groups were significantly higher than high-dose group； A value of A3 in low-dose group was significantly higher than medium-dose and high-dose groups （P<0.05 or P<0.01）. A and Ka values of A1 and A3 in non-ligation group were significantly lower than control group， while A and Ka values of A4 were significantly higher than control group （P<0.05 or P<0.01）. A and Ka values of A1 and A3 in P-gp inhibitor group were significantly lower than control group （P<0.05 or P<0.01）. A values of A1 in jejunum group， ileum group and colon group， Ka value of A1 in colon group， A and Ka values of A2 in colon group， A value of A3 in ileum group， A and Ka values of A4 in ileum group and colon group， A values of A5 in jejunum group and ileum group as well as Ka value of A5 in jejunum group were all significantly lower than duodenum group. Ka values of A3 in jejunum group， ileum group and colon group were significantly higher than duodenum group （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： Established UPLC-MS/MS method is specific， sensitive and simple， and it can be used for quantitative analysis and pharmacokinetic study of A1-A5. The 5 active components in B. striata ethanol extract are absorbed by the whole intestine， and the intestinal segments are different. A1 and A3 are absorbed more in intestinal tract and may be saturated. Bile can inhibit intestinal absorption of A1 and A2， but promoted intestinal absorption of A4. A1-A5 may not be the substrate of P-gp.

KEYWORDS Bletilla striata ethanol extract； Active compound； in vivo intestinal circulation perfusion model； UPLC-MS/MS； Intestinal absorption characteristics

白及為蘭科植物白及[Bletilla striata（Thunb.）Reichb. f. ]的干燥塊莖，是《中國藥典》（一部）收載的常用藥材，其味苦、甘、澀，性微寒，歸肺、肝、胃經，具有收斂止血、消腫生肌等作用，常用于咯血、外傷出血等病癥的治療[1-2]。白及的化學成分主要包括聯芐類、二氫菲類、聯芐葡萄糖苷類、聯菲類、菲類等非多糖類物質[3-4]?，F代藥理研究表明，白及藥用功能廣泛、藥用價值高，具有止血、抗菌、抗腫瘤及促進血管內皮細胞生長等多種藥理活性[3，5]，且有研究指出白及已逐漸成為我國現代醫藥工業的重要原材料[6]。但目前有關白及的文獻仍集中在化學成分的分離、鑒定以及對各種粗提物療效物質的初步探索階段[7-11]，尚未見白及體內吸收及其影響因素分析的相關報道。本課題組前期對白及進行了大量研究，確定了其醇提物中含量較高且具凝血活性的5種成分{4-（葡萄糖氧基）-肉桂酸葡萄糖氧基芐酯（A1）、2-異丁基蘋果酸（A2）、1，4-二[4-（葡萄糖氧）芐基]-2-異丁基蘋果酸酯（A3）、二氫菲1（A4）、1，4-二[4-（葡萄糖氧）芐基]-2-異丁基蘋果酸酯-2-（4-O-肉桂酰基-6-O-乙酰基）葡萄糖苷（A5）}。在此基礎上，本研究采用大鼠在體腸循環灌流模型，在保證其內分泌輸入以及腸道神經完整的前提下，借助超高效液相色譜-串聯質譜技術（UPLC-MS/MS），從在體角度分析白及醇提物中上述5種主要活性成分的腸吸收行為，并考察不同因素[醇提物劑量、膽汁、P-糖蛋白（P-gp）抑制劑和不同腸段[12-13]]對其腸吸收的影響，初步探討白及醇提物在大鼠腸道中的吸收動力學特征，以期為后續白及醇提物口服給藥研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Acquity UPLC型超高壓液相-三重四級桿質譜聯用儀，配備AcquityTM UPLC-TQD系統（自動進樣器、二元梯高壓梯度泵、柱溫箱、真空脫氣機等）、Masslynx 4.1質譜工作站（美國Waters公司）；HL-2S型蠕動泵（上海青浦滬西儀器廠）；ZH-2型渦旋混合器（天津藥典標準儀器廠）；DK-98-ⅡA型恒溫水浴鍋（天津泰斯特儀器有限公司）；Allegra 64R型低溫高速離心機（美國Beckman Coulter公司）；CQ 250A-TS型超聲波清洗機（上海躍進醫用光學器械廠）；EL204型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；MTN-2800D型氮吹儀（天津奧特塞恩斯儀器有限公司）。

1.2 藥材與試劑

白及藥材（批號：20160510）采摘自貴州省正安縣，由貴州醫科大學藥學院生藥學與藥用植物學教研室龍慶德副教授鑒定為蘭科植物白及[B. striata（Thunb.）Reichb. f.]的干燥塊莖。

A1、A2、A3、A4、A5對照品均為本實驗室自制（純度：≥95%）；鹽酸維拉帕米對照品（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號：29940，純度：99%）；葛根素對照品（內標，中國食品藥品檢定研究院，批號：110752-201512，純度：≥98%）；D101大孔吸附樹脂（30～60目，上海源葉生物科技有限公司，批號：H13J8L39806）；烏來糖（上海伊卡生物技術有限公司，批號：20130609，純度：≥99%）；葡萄糖（天津市科密歐化學試劑有限公司，批號：20100110，純度：雜質含量≤0.005%）；甲酸、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 動物

SPF級健康SD大鼠，雌雄各半，2～3月齡，體質量（250±20）g，由陸軍軍醫大學實驗動物中心提供[動物生產許可證號：SCXK（渝）2017-0002]。

2 方法與結果

2.1 白及醇提物的制備

參照文獻[14]方法，稱取白及藥材10 kg，用4倍量（kg/L）95%乙醇回流提取3次，每次2 h，濾過，合并濾液，濃縮至浸膏，浸膏用水溶解，經D101大孔吸附樹脂柱色譜，分別以水、80%乙醇洗脫，收集80%乙醇洗脫液，減壓濃縮并真空干燥，得白及醇提物680 g，提取率為6.8%（每1 g醇提物相當于14.7 g白及藥材）。經UPLC-MS/MS法測定，醇提物中A1、A2、A3、A4、A5的含量分別為2.64%、2.36%、26.37%、0.86%、2.09%。

2.2 溶液的配制

2.2.1 Krebs-Ringer’s（K-R）營養液[12] 精密稱取葡萄糖1.4 g、氯化鈣0.37 g、氯化鎂0.02 g、氯化鈉7.8 g、氯化鉀0.35 g、碳酸氫鈉1.37 g、磷酸二氫鈉0.32 g，用水溶解并定容至1 L，即得。

2.2.2 標準溶液 精密稱取A1、A2、A3、A4、A5對照品各適量，分別用甲醇溶解，搖勻，得質量濃度分別為1.4、2.9、1.5、1.3、2.0 mg/mL的單一成分貯備液；取上述貯備液各適量，混合，于37 ℃下以氮氣流吹干，用“2.2.1”項下K-R營養液溶解并逐級稀釋至所需質量濃度，即得系列混合標準溶液，置-20 ℃冰箱中保存，備用。

2.2.3 內標溶液 精密稱取內標對照品10.12 mg，用甲醇溶解并定容至25 mL，得質量濃度為0.405 mg/mL的內標貯備液；取上述內標貯備液適量，用甲醇稀釋，得質量濃度為20 μg/mL的內標溶液，置-20 ℃冰箱中保存，備用。

2.2.4 空白腸循環液 取37 ℃ K-R營養液60 mL，置于量筒中，進行在體腸灌流實驗，循環3 h，即得。

2.2.5 白及醇提取物供試液 精密稱定“2.1”項下白及醇提物0.25、0.5、1 g，分別用無水乙醇15 mL溶解，取上述溶液各1 mL逐滴加入到10%聚山梨酯80溶液5 mL中，混勻，用K-R營養液稀釋并定容至100 mL，超聲（功率：240 W，頻率：40 kHz）10 min，5 000 r/min離心10 min，取上清液，得質量濃度分別為167、333、667 μg/mL（按醇提物質量計，下同）的白及醇提物供試液。

2.3 色譜與質譜條件

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Acquity UPLC BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相：乙腈（含0.1甲酸，A）-水（含0.1%甲酸，B），梯度洗脫（0～1.0 min，10%A→30%A；1.1～2.0 min，30%A→35%A；2.1～3.0 min，35%A→38%A；3.1～4.0 min，38%A→90%A；4.1～5.0 min，90%A→10%A）；流速：0.35 mL/min；柱溫：45 ℃；進樣量：3 μL。

2.3.2 質譜條件 采用電噴霧離子源（ESI），多反應監測（MRM）模式進行正、負離子同時掃描。離子源溫度：120 ℃；毛細管電壓：3 kV；去溶劑氣溫度：350 ℃；去溶劑氣（氮氣）流速：650 L/h；碰撞氣（氬氣）流速：0.18 mL/min；用于定量分析的離子對分別為m/z 593.2→431.1（A1）、m/z 189.0→129.0（A2）、m/z 725.3→457.2（A3）、m/z 347.1→332.1（A4）、m/z 1 059.3→793.1（A5）、m/z 417.0→267.0（內標）；碰撞能量分別為15、15、20、25、25、30 eV；錐孔電壓分別為35、30、40、50、45、40 V。

2.4 樣品處理方法

取待測樣品100 μL，置于1.5 mL離心管中，加入1%甲酸溶液100 μL，混勻后，用正丁醇萃取3次，每次200 μL，合并正丁醇萃取液，于37 ℃下以氮氣流吹干，殘渣加入20 μg/mL內標溶液40 μL后，用50%甲醇260 μL溶解并稀釋，渦旋振蕩1 min，15 000 r/min離心5 min，取上清液，進行UPLC-MS/MS分析。

2.5 方法學考察

2.5.1 專屬性 取空白腸循環液、空白腸循環液+待測物以及大鼠灌流白及醇提物供試液（質量濃度為333 μg/mL）后60 min時的回腸灌流液樣品各適量，按“2.4”項下方法處理（空白腸循環液不加內標）后，再按“2.3”項下色譜與質譜條件進樣分析，記錄色譜圖，詳見圖1。由圖1可見，內標及A1等6種待測物的保留時間（RT）分別為1.30、1.49、1.56、1.81、2.98、3.11 min，各待測成分的分離度良好，且空白腸循環液中的內源性物質對各成分無干擾，表明本方法的專屬性強。

2.5.2 標準曲線的繪制與定量下限（LLOQ）、最低檢測限（LLOD）的考察 取“2.2.2”項下系列混合標準溶液（A1質量濃度分別為0.22、0.88、1.75、3.50、7.00、14.00 μg/mL，A2質量濃度分別為0.34、1.36、2.72、5.44、10.88、21.75 μg/mL，A3質量濃度分別為1.99、7.95、15.89、31.79、63.58、127.16 μg/mL，A4質量濃度分別為0.15、0.61、1.22、2.44、4.88、9.75 μg/mL，A5質量濃度分別為0.16、0.63、1.25、2.50、5.00、10.00 μg/mL）各適量，按“2.4”項下方法處理后，再按“2.3”項下色譜與質譜條件進樣分析，記錄峰面積。以待測物與內標峰面積的比值（y）為縱坐標、各待測物質量濃度（x，μg/mL）為橫坐標進行線性回歸，并考察LLOQ（信噪比為10 ∶ 1）和LLOD（信噪比為 3 ∶ 1），結果見表1。由表1可見，5種待測物的質量濃度在其線性范圍內與峰面積的線性關系良好（r均大于0.99），LLOQ分別為0.22、0.34、1.99、0.15、0.16 μg/mL，LLOD分別為0.028、0.085、0.251、0.035、0.010 μg/mL。

2.5.3 精密度與準確度試驗 按“2.5.2”項下方法配制各待測物低、中、高質量濃度（A1：0.44、1.75、7.00 μg/mL；A2：0.68、2.72、10.88 μg/mL；A3：3.98、15.89、63.58 μg/mL；A4：0.30、1.22、4.88 μg/mL；A5：0.32、1.25、5.00 μg/mL，下同）的混合質控（QC）樣品，每質量濃度平行配制5份，按“2.4”項下方法處理后，再按“2.3”項下色譜與質譜條件進樣分析，考察日內精密度；連續測定5 d，考察日間精密度。將實測質量濃度與理論質量濃度進行比較，以方法回收率考察準確度，結果見表2。由表2可見，各QC樣品的日內、日間RSD均小于10%，方法回收率為83.60%～106.91%（RSD<7%，n=5），符合生物樣品定量分析的相關要求[15]。

2.5.4 基質效應 取“2.2.4”項下空白腸循環液100 μL，按“2.4”項下方法處理后，加入按“2.2.2”項下方法配制的混合對照品溶液適量，配制成相應低、中、高質量濃度的樣品，按“2.3”項下色譜與質譜條件進樣分析，記錄峰面積（B1）；另取對應質量濃度的混合對照品溶液適量，于37 ℃下以氮氣流吹干，殘渣以50%甲醇溶解，按“2.4”項下方法處理后，再按“2.3”項下色譜與質譜條件進樣分析，記錄峰面積（B2）。基質效應=B1/B2×100%，結果見表2。由表2可見，各待測物的基質效應為81.78%～105.68%（RSD<7%，n=6），內標的基質效應為84.62%～106.50%（RSD<8%，n=5），表明基質效應不影響待測物的測定[15]。

2.5.5 穩定性 按“2.5.2”項下方法配制各待測物低、中、高質量濃度混合QC樣品，按“2.4”項下方法處理，分別于處理后的0、2、4、6、8、12 h（室溫）取樣，按“2.3”項下色譜與質譜條件進樣分析，記錄峰面積。結果，各待測物峰面積的RSD均小于10%（n=6），提示各樣品在12 h內穩定性良好。

2.6 醇提物中活性成分的在體腸吸收特征研究

2.6.1 大鼠在體循環灌流實驗 采用在體腸循環灌流法，具體步驟參照文獻[16]。所有均大鼠禁食、不禁水12 h，腹腔注射30%烏來糖（1.4 g/kg）進行麻醉后，固定于37 ℃恒溫手術臺上，剃去其腹部的毛發，沿腹部中線打開腹腔（切口約3～4 cm），結扎總膽管；在十二指腸前端剪一個小口并插入硅膠管，扎緊；然后通過盲腸找到回腸底端，在回腸底端同樣剪一個小口并插入硅膠管，扎緊；使兩者與蠕動泵形成一個回路。在灌流前，用37 ℃生理鹽水以1.0 mL/min的流速沖洗腸道，排空水分。隨后取“2.2.5”項下37 ℃、不同質量濃度的白及醇提物供試液各60 mL，以5.0 mL/min的流速循環平衡15 min后，將蠕動泵的流速調至2.5 mL/min，立刻讀出循環液的體積。在裝有循環液的量筒中取樣1 mL（作為白及醇提物灌流0 h時的樣品），隨后補充K-R營養液1 mL；于不同時間點（0.5、1、1.5、2、2.5、3 h）取樣，并同法補充K-R營養液。將上述各時間點的樣品按“2.4”項下方法處理后，再按“2.3”項下色譜與質譜條件進樣分析，計算樣品中各待測物的質量濃度。蠕動泵循環3 h后中止，待循環結束之后，用空氣排凈腸道內和管路內的液體，并量取其體積，即得腸道和管路的死體積。死體積加上各時間點的量筒讀數即為該時間點循環液體積，以此方法進行腸循環的體積校正，進而計算出各時間點的藥物量，即剩余藥量（Ptn，見公式①）；以剩余藥量計算出3 h時的累計吸收轉化率（A，見公式②）。采用GraphPad Prism 5.01軟件以剩余藥量的自然對數和取樣時間作圖，求出吸收轉化速率常數（Ka，即上述曲線的斜率）。采用SPSS 18.0軟件對數據進行統計分析。計量資料以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

Ptn=ctn×Vtn+1.0×[i=1][n-1][∑]cti…①

式中，tn為循環液灌注時間，ct1（i=1）為循環液中藥物（即待測物）的初始質量濃度，ctn（i=n）為tn時刻循環液中藥物的質量濃度，Vtn為tn時刻循環液體積，Ptn為tn時刻循環液中的剩余藥量。

A=[Pt0-Pt3

Pt0] ×100%…②

式中，Pt0為0 h時的剩余藥量，Pt3為3 h時的剩余藥量。

2.6.2 白及醇提物在37 ℃ K-R營養液中的穩定性考察 按“2.2.5”項下方法配制質量濃度為333 μg/mL白及醇提物供試液60 mL，置于37 ℃恒溫水浴中，分別于0、3 h取樣，按“2.4”項下方法處理后，再按“2.3”項下色譜與質譜條件進樣分析，分別記錄0、3 h時各待測物的峰面積（分別為C1、C2）。以C1與C2的比值來考察白及醇提物在K-R營養液中的穩定性。上述試驗重復操作4次。結果，兩者比值為94.90%～109.34%，表明A1等5種待測物在37 ℃ K-R營養液中放置3 h內穩定性良好，詳見表3。

2.6.3 白及醇提物在蠕動泵管路中的物理吸附作用考察 按“2.2.5”項下方法配制質量濃度為333 μg/mL白及醇提物供試液60 mL，置于37 ℃恒溫水浴中，按“2.6.1”項下方法操作，于體外空循環（即不連接大鼠腸道）3 h，分別于0、3 h取樣，按“2.4”項下方法處理后，再按“2.3”項下色譜與質譜條件進樣分析，分別記錄0、3 h時各待測物的峰面積（分別為C3、C4）。以C3與C4的比值來考察白及醇提物在管路中的吸附情況。上述試驗重復操作4次。結果，兩者比值為90.08%～108.90%，表明A1等5種待測物在蠕動泵管路中無明顯的物理吸附作用，詳見表3。

2.6.4 白及醇提物在空白腸循環液中的穩定性考察 以空白腸循環液為基質，配制白及醇提物溶液（質量濃度為333 μg/mL）適量，置于37 ℃恒溫水浴中，分別于0、3 h取樣，按“2.4”項下方法處理后，再按“2.3”項下色譜與質譜條件進樣分析，分別記錄0、3 h時各待測物的峰面積（分別為C5、C6）。以C5、C6的比值來考察白及醇提物在空白腸循環液中的穩定性。上述試驗重復操作4次。結果，兩者比值為96.15%～104.77%，表明A1等5種待測物在空白腸循環液中放置3 h內的穩定性良好，腸道中的酶對各待測物的穩定性影響較小或無影響，詳見表3。

2.6.5 白及醇提物劑量對活性成分腸吸收的影響 取禁食不禁水的SD大鼠12只，隨機分為3組，即白及醇提物低、中、高劑量組，每組4只。按“2.2.5”項下方法配制質量濃度分別為167、333、667 μg/mL白及醇提物供試液，各取60 mL置于37 ℃恒溫水浴中，按“2.6.1”項下方法操作，進行體外循環，并于0、0.5、1、1.5、2、2.5、3 h時取樣，按“2.4”項下方法處理后，再按“2.3”項下色譜與質譜條件進樣分析，計算樣品中各待測物的質量濃度，并計算A和Ka值，考察白及醇提物劑量對活性成分腸吸收的影響，結果見表4。

由表4可見，白及醇提物低、中劑量組活性成分A1的A、Ka值顯著高于高劑量組，白及醇提物低劑量組A3的A值顯著高于中、高劑量組，差異均有統計學意義（P<0.05或P<0.01）。

2.6.6 膽汁和P-gp抑制劑對活性成分腸吸收的影響 取禁食不禁水的SD大鼠12只，隨機分為3組，即對照組（結扎總膽管，不加P-gp抑制劑）、不結扎組（不結扎總膽管，不加P-gp抑制劑）；P-gp抑制劑組（結扎總膽管，加P-gp抑制劑鹽酸維拉帕米108 μg/L），每組4只。以白及醇提物溶液（質量濃度為333 μg/mL）60 mL作為腸循環液，其余按“2.6.1”項下方法操作，進行在體循環，并于0、0.5、1、1.5、2、2.5、3 h時取樣，按“2.4”項下方法處理后，再按“2.3”項下色譜與質譜條件進樣分析，計算樣品中各待測物的質量濃度，并計算A和Ka值，考察膽汁和P-gp抑制劑對活性成分腸吸收的影響，結果見表5。

由表5可見，與對照組比較，不結扎組活性成分A1及A3的A、Ka值均顯著降低，A4的A、Ka值均顯著升高，差異均有統計學意義（P<0.05或P<0.01）。與對照組比較，P-gp抑制劑組活性成分A1及A3的A、Ka值均顯著降低，差異均有統計學意義（P<0.05或P<0.01）?；钚猿煞諥2、A5的A、Ka值組間比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。

2.6.7 白及醇提物在不同腸段的吸收特征 取禁食不禁水的SD大鼠16只，隨機分為4組，即十二指腸組、空腸組、回腸組、結腸組，每組4只。分別對大鼠十二指腸、空腸、回腸、結腸進行結扎后，以白及醇提物溶液（質量濃度為333 μg/mL）60 mL作為腸循環液，其余按“2.6.1”項下方法操作，進行在體循環，并于0、0.5、1、1.5、2、2.5、3 h時取樣，按“2.4”項下方法處理后，再按“2.3”項下色譜與質譜條件進樣分析，計算樣品中各待測物的質量濃度，并計算A和Ka值，考察白及醇提物活性成分在不同腸段的吸收特征，結果見表6。

由表6可見，空腸組、回腸組、結腸組活性成分A1的A值以及結腸組A1的Ka值，結腸組A2的A、Ka值，回腸組A3的A值，回腸組、結腸組A4的A、Ka值，空腸組、回腸組A5的A值以及空腸組A5的Ka值均顯著低于十二指腸組；而空腸組、回腸組、結腸組A3的Ka值均顯著高于十二指腸組，差異均有統計學意義（P<0.05或P<0.01）。

3 討論

中藥化學成分復雜，口服是最常見的給藥方式，腸道是口服藥物的主要吸收場所。因此，研究藥物在腸道中的吸收情況、考察藥物腸吸收的影響因素可有助于藥物劑型的開發，改善其在生物體內的吸收，提高其生物利用度。目前關于藥物腸吸收研究的模型較多，如單向腸灌流法、外翻腸囊法、腸循環灌流法等。在體腸循環灌流法不切斷血管及神經，對動物的傷害較小，可保持胃腸道神經和內分泌輸入的完整性以及胃腸道內容物中酶的活性，也保證了血液及淋巴液的穩定供應，實驗條件接近動物體內的真實情況，能較為真實地反映藥物在腸道中的吸收情況[17-18]。因此，本研究采用在體腸循環灌流模型初步探討了白及醇提物主要活性成分（A1～A5）在腸道內的吸收行為與吸收動力學特征。

由于生物樣品中存在大量的蛋白質等內源性物質，會對其定量分析造成一定程度的干擾，因此需要通過高效、靈敏的檢測手段來保證樣品檢測結果的準確、可靠。本研究建立了同時測定白及醇提物中5個活性成分的UPLC-MS/MS法。方法學考察結果表明，該方法具有專屬性強、靈敏度高、分析效率高、操作簡便快速等特點，可用于大量樣本的檢測分析。

白及臨床上的用量為每次6～15 g[1]，根據醇提物的提取率（6.8%）換算得成人（60 kg）單次使用醇提物的劑量為0.4～1.0 g，換算得大鼠等效劑量[19]為41.1～102.8 mg/kg（按醇提物質量計）。本研究選擇所選大鼠體質量為（250±20）g，若每只大鼠灌流體積為60 mL，其用藥劑量范圍應為171.3～428.3 μg/mL。結合前期預試驗結果，本研究最終選擇333 μg/mL為中劑量，并將低劑量設為其1/2，高劑量設為其2倍；同時，以333 μg/mL白及醇提物供試液作對象，進行相關穩定性和物理吸附性考察，并探討醇提物劑量、膽汁、P-gp抑制劑對活性成分吸收的影響以及活性成分的腸吸收特征。

在進行在體腸循環灌流實驗中，筆者發現小腸在吸收藥物的同時也吸收水分，導致循環液總體積減少，因此需要對循環體積進行校正，以減少藥物濃度檢測的誤差。筆者通過查閱文獻發現，目前主要的體積校正方法包括14C標記法、酚紅標記法和重量法[20]。其中，由于14C的放射性，14C標記法可能存在一定的安全性問題；酚紅會被腸道吸收，且容易對一些藥物的吸收和轉運產生干擾；重量法較前兩種方法簡單，但不能稱量腸段內液體的重量，可能會造成一定的檢測誤差。鑒于此，本研究采用了更為簡便的量筒法來校正循環體積，該法在灌流實驗中應用廣泛，具有操作簡單、可行性高的優點[12-13，16，21]。采用量筒法校正循環體積的關鍵是保證死體積維持不變。筆者經研究對比發現，當大鼠的體位始終高于量筒時，其死體積基本無變化；此外，在實驗前將大鼠腸道內的內容物充分沖洗干凈，避免腸道堵塞，也是保持死體積不變的方法之一。在上述條件下，本研究通過將各時間點量筒讀數與死體積相加來校正腸循環液體積。

為明確白及醇提物的吸收轉運機制和主要吸收部位，本研究首先考察了白及醇提物劑量對活性成分腸吸收的影響。結果顯示，白及醇提物低、中劑量組活性成分A1的A、Ka值顯著高于高劑量組，白及醇提物低劑量組A3的A值顯著高于中、高劑量組，差異均有統計學意義。這表明當給予大鼠中、高劑量的白及醇提物后，活性成分A1、A3的腸吸收明顯降低，其吸收可能已達飽和狀態，提示兩者在生物體內的吸收機制不僅是單純的被動吸收過程，可能還存在主動轉運[13]。由于膽汁可能會影響藥物的吸收[12，16，22]，故本研究考察了膽汁對白及醇提物活性成分吸收的影響。結果顯示，不結扎組活性成分A1及A3的A、Ka值均較對照組顯著降低，A4的A、Ka值均較對照組顯著升高，差異均有統計學意義。這提示膽汁會影響白及醇提物的吸收，可抑制活性成分A1、A3的腸吸收，促進A4的腸吸收。P-gp介導的外排作用可影響諸多藥物的吸收和生物利用度[23]，因此本研究考察了P-gp抑制劑對白及醇提物活性成分吸收的影響。結果顯示，P-gp抑制劑組活性成分A1及A3的A、Ka值均較對照組顯著降低，差異均有統計學意義；而其余成分A、Ka值與對照組比較，差異均無統計學意義。P-gp是一種能量依耐性的藥物外排泵，可與多種親脂性或兩性化合物結合，并促進其外排，降低其藥物濃度。P-gp抑制劑可抑制P-gp的外排功能，從而促進藥物的吸收[24-25]。而本研究結果顯示，加入P-gp抑制劑維拉帕米后，白及醇提物活性成分A1、A3的吸收并未增強，而其他成分的吸收亦無明顯改變，提示各活性成分可能均不是P-gp的底物，其吸收可能存在其他非特異性現象，有待后續研究予以驗證。白及醇提物在不同腸段的吸收研究特征表明，A1、A5的主要吸收部位為十二指腸，A2的主要吸收部位為十二指腸、回腸，A3的主要吸收部位為空腸、結腸，A4的主要吸收部位為十二指腸、空腸。這提示白及醇提物中5種活性成分在十二指腸、空腸、回腸及結腸中均有吸收，為全腸道吸收，且吸收趨勢均為小腸大于結腸（A1～A5在十二指腸、空腸、回腸的A值之和高于結腸）。

綜上所述，白及醇提物中5種成分為全腸道吸收，吸收趨勢均為小腸大于結腸；A1、A3在腸道中的吸收可能已達飽和狀態，為主動運轉；膽汁可影響各成分的吸收（抑制A1、A3的腸吸收，促進A4的腸吸收）；5種成分均不是P-gp的底物。本研究初步闡明了白及醇提物中5種活性成分在腸道的吸收特征，可為白及的臨床應用及其新劑型的研發提供一定的實驗參考。但本研究也具有一定的局限性：（1）在體腸循環灌流模型雖然操作較簡單，但其灌流時間較長，可能對腸黏膜造成損傷，從而導致腸吸收值與實際偏離；（2）在探討白及醇提物在各腸段吸收特征的過程中，分別結扎各腸段形成灌流通路，以等濃度的藥物灌流液進行灌流實驗。但在實際情況中，藥物經口服后，依次經過十二指腸、空腸、回腸和結腸，經過各腸段的藥物濃度可能是不相等的，因此可能會使研究結果發生偏倚。因此，本課題組后續將會運用其他研究方法和模型（如離體外翻腸囊法、Caco-2細胞等）對本研究結論進行驗證，進一步探討白及醇提物在腸道中的吸收特征。

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（收稿日期：2018-07-07 修回日期：2019-01-15）

（編輯：張元媛）