RIPK3抑制對錳致大鼠腦星形膠質細胞活化及多巴胺能神經元障礙的影響

何蓮瑜 劉丹丹 郭忠信 劉勝生 莫偉堅 鄧祥發

摘要：目的：研究RIPK3抑制劑GSK’872對錳致大鼠腦星形膠質細胞活化及多巴胺能神經元障礙的影響方法：將32只SD大鼠隨機分為對照組、GSK’872對照組、錳中毒組、GSK'872干預組，每組8只。采用腹腔注射法對錳中毒組及GSK'872干預組的動物染錳，建立亞急性錳中毒模型，同時干預組給予小腦延髓池注射GSK’872。動物取材時取海馬及黑質組織，采用Western blot和RT-qPCR法檢測GFAP及TH蛋白表達及RIP3基因表達的變化。結果：與對照組比較，GFAP的蛋白表達量明顯升高;黑質TH蛋白表達量降低; RIP3基因的表達明顯升高（P<0.05）;與錳中毒組比較，GSK’872干預組GFAP蛋白表達量明顯下降，黑質TH蛋白表達升高;RIP3基因的表達明顯降低（P<0.05）。結論：GSK’872干預可降低染錳大鼠腦內星形膠質細胞早期激活以及改善黑質多巴胺能神經細胞的功能障礙，其機制可能與GSK’872能抑制神經組織細胞壞死樣凋亡的發生有關。

前言

錳（Mn）是維持生理過程所必需的微量元素之一，但中樞神經系統（CNS）中錳的過度沉積可導致神經異常，產生多種類似于帕金森?。≒D）的精神、認知和運動障礙的中毒癥狀[1]。己知錳中毒時星形膠質細胞通過反應性增生和神經炎癥促進周圍組織的血運重建，對CNS的變化具有適應性保護作用，但過度的活化可引發神經遞質的興奮性毒性、增強組織的氧化應激及過度的炎癥反應等損害作用[2]。當過量的錳通過血腦屏障進入CNS時，腦內的錳優先沉積在星形膠質細胞（Astrocyte，AS）中，尤其在細胞的線粒體內，胞液中錳的整體濃度比神經元高出50-60倍[3]，因此AS是錳神經毒性的初始靶細胞[3]。已知錳中毒可同時誘發神經組織細胞發生凋亡和壞死 [4]。近二十年研究不斷證實細胞壞死的發生在許多條件下也存在著程序性調控的機制，包括Necroptosis（壞死性凋亡），pyroptosis（細胞焦亡）、ferroptosis、Netosis（細胞鐵壞死）等調節性壞死的亞類相繼被發現和論證[5]。RIP3已然被確認為調節依賴于RIP1介導的細胞死亡在凋亡與壞死間發生轉換的關鍵因子[6]。相繼發現的RIP1和RIP3的特異性抑制劑、包括Necrostatin-1、GSK'843和GSK'872[7]等為研究Necroptosis的相關機制提供了有效而關鍵的分子工具。

在早前的實驗中我們觀察到：錳暴露可誘導大鼠海馬、黑質等腦區神經細胞發生凋亡和壞死，星形膠質細胞明顯活化[8]。RIP1特異性抑制劑Necrostatin-1可以降低體外培養染錳多巴胺能SK-N-SH細胞的壞死率、提高其存活度[9]，提示Necroptosis的調節機制可能參與了錳的神經毒性。本研究擬通過大鼠體內實驗，應用RIP3的特異性抑制劑GSK'872干預錳致大鼠腦早期星形膠質細胞活化及多巴胺能神經元障礙的影響，進一步闡述錳誘導神經組織細胞發生壞死的分子機制，并探討通過抑制細胞壞死發生來拮抗錳暴露對CNS的損傷作用的可行性。

1、材料與方法

1.1主要試劑與儀器MnCl2·4H2O（天津市博迪化工有限公司）;GSK'872（TargetMol，美國）;兔抗大鼠GFAP、β-actin單克隆抗體和二抗Goat Anti-Rabbit lgG H&L（HPR）（Abcam公司，英國）;紅外線熒光二抗Anti-rabbit IgG（H+L）（CST公司，美國）;TBGreenTM Premix Ex TaqTMII（TliRNaseH Plus）（Takara公司，日本）;Odyssey雙色紅外熒光掃描成像系統（LI-COR公司，美國）;熒光PCR儀StePonePlus（Applied Biosystems，美國）。

1.2實驗動物

SPF級雄性SD大鼠32只（大鼠8W齡，體重180±20g），購自廣西醫科大學實驗動物中心（動物許可證號：SCXK 20090002）。動物于通風良好，溫度22～28℃，濕度為40%～60%，12小時光照/暗光的室內條件下飼養。

1.3方法與步驟

購買的動物進行環境適應性飼養2周后，將其隨機分成對照組、GSK'872對照組、錳中毒組、GSK'872干預組、每組8只;錳中毒組、GSK'872干預組大鼠經腹腔注射（ip）MnCl2·4H20 （15mg/kg，每周5天，共4w）建立亞急性錳中毒模型。同時對照組、GSK'872對照組腹腔注射等容量生理鹽水。動物在進行腹腔染錳期間，GSK'872干組、GSK'872對照組于每周的第3日向小腦延髓池內緩慢注射GSK'872，每次10 ul（25 mM，每周1天，共3w），錳中毒組和對照組則向小腦延髓池內注射等量生理鹽水。最后剔除不合格的動物，對照組剩余8只、GSK'872對照組剩余7只、錳中毒組剩余6只，GSK'872干預組剩余7只。錳及小腦延髓池注射藥物期間每日觀察大鼠一般情況、每周稱重2～3次并根據體重上下調整染錳劑量。

1.4樣本取材

小腦延髓池及腹腔染錳給藥4w結束后繼續飼養3w。取材：每組動物取6只提取組織蛋白和RNA，動物在深度麻醉下采用頸椎脫臼法處死取腦，分離雙側的腦海馬及黑質組織，置于超低溫冰箱備用。

1.5樣本檢測

1.5.1Western blot檢測大鼠黑質TH及海馬組織GFAP表達的變化。

腦組織添加高效RIPA組織裂解液，提取總蛋白。BCA法測定蛋白質濃度，以計算上樣量。配制電泳凝膠進行蛋白電泳后將蛋白轉移到PVDF膜上，用1×TBST清洗后用5%脫脂奶粉37 ℃封閉2 h，置入一抗（GFAP 1：2 000，TH 1：2000 ，β-actin1：5 000）中室溫下孵育 4～6 h， 4 ℃過夜。次日1×TBST清洗后孵育二抗Anti-rabbit IgG（H+L）（1：30000）后，1×TBST清洗后在雙色紅外熒光掃描成像系統中掃描，進行免疫印跡觀察檢測，用Odyssey軟件進行數據分析，以β-actin作為內參計算各組GFAP、TH的相對表達量。

1.5.2 RT-qPCR法檢測海馬與黑質RIP3基因的表達

用RNA總試劑盒提取皮層和海馬組織樣品RNA，并檢測RNA濃度和純度合格后進行逆轉錄。然后進行RT-qPCR法檢測海馬與黑質RIP3基因的表達。重復3次以上實驗，最后用Stepone Software進行數據分析，各基因相對表達量采用2-△△Ct值表示。

2、統計學分析

數據資料采用SPSS23.0統計軟件進行分析。用x±s表示陽性細胞數及蛋白表達量和基因表達量。各組間的均數差異以方差分析的最小顯著差異法（LSD）檢驗，如方差不齊則選擇Tamhane’s T2 進行校正檢驗，檢驗水準設為α=0.05。

3、結果

3.1GSK'872對亞急性錳暴露大鼠海馬GFAP、黑質TH表達的影響

（1）由表3-1，圖A，B可見，與對照組比較，染錳組大鼠GFAP蛋白表達水平升高（P < 0.05），TH表達水平降低;與染錳組比較，GSK'872干預組GFAP蛋白表達水平均降低（P< 0.05），TH表達水平降升高（P < 0.05）。

3.2 GSK'872對亞急性錳暴露大鼠海馬RIP3基因表達的影響

由表3-2可見，與對照組比較，染錳組大鼠海馬、黑質RIP3表達水平均升高（P < 0.05）;與染錳中毒組比較，GSK'872干預組海馬RIP3表達水平均降低（P < 0.05）。

4、討論

星形膠質細胞（AS）在生理和病理條件下與神經元的相互作用對大腦結構和生理功能的維持均有著重要的影響作用，大腦錳最多富集于星形膠質細胞的線粒體內并干擾其功能，導致細胞能量代謝障礙[10，11]。反應性星形膠質細胞增多不僅與星形膠質細胞功能受損有關，還可增強組織的氧化應激及炎癥反應 [12]，損害多巴胺能等神經元的細胞代謝及功能。本研究的觀察到錳暴露后大鼠腦海馬的GFAP的表達隨即上調，黑質多巴胺神經元的神經遞質合成功能障礙，這與多個文獻報道的結果相似。將GSK’872注入染錳大鼠的小腦延髓池后，海馬組織內AS的反應水平下降，多巴胺神經元的TH表達明顯回升，同時染錳后海馬組織內表達升高的RIP3、基因表達也有明顯下調，提示GSK’872可能具有一定拮抗錳神經毒性的作用，其原因可能與GSK’872能特異性阻斷細胞的壞死樣凋亡的發生有關。

星形細胞與神經元的相互作用在腦內的生理平衡中十分重要，特別是通過神經遞質循環功能，如AS與神經元之間的Gln-Glu-GABA循環（GGG循環）。AS的功能受損與過度活化在錳的神經毒理機制中具有復雜多樣的作用。錳能誘導AS炎癥產物和信號轉導介質的表達，增加一氧化氮（NO）底物、L-精氨酸在AS中的轉運及誘導型一氧化氮合酶（iNOS）的合成[13];活化的AS還能增加水通道蛋白aquaporin-4（aqp4）的表達，與錳介導的細胞腫脹有關[14]。與此同時，錳和多巴胺在腦內的相互作用可增加多巴胺能細胞的受損程度。由于錳中毒誘導的細胞壞死可因細胞裂解釋放出胞內含物常引起炎癥反應，增強星形細胞與神經元之間異常的相互作用，故在分子水平抑制細胞壞死的發生，理論上具有一定拮抗錳神經毒性的作用，GSK’872在本實驗中表現出具有下調腦內AS異常的活化水平、提高多巴胺能神經元功能的作用。

近年來有關程序性細胞壞死機制在神經系統疾病中的作用不斷受到關注。Yang等[15]發現將GSK'872注入側腦室可減輕動脈瘤性蛛網膜下腔出血（SAH）模型動物的腦水腫、減少腦海馬神經細胞壞死的，并降低促炎蛋白HMGB1的表達;GSK'872可減輕MCAO模型大鼠腦神經細胞壞死的程度。應用Necrostatin-1，GSK'872或MLKL抑制劑necrosulfonamide（NSA）或相應基因的敲低能減輕連續機械應力誘導大鼠髓核細胞的發生壞死性凋亡[16]。

綜上所述，錳中毒的引起的星形膠質細胞早期的活化水平升高及黑質多巴胺能神經細胞的功能障礙與壞死樣凋亡確有可能存在相關的關系，GSK’872能特異性抑制神經組織細胞壞死樣凋亡，在一定程度上能減輕因細胞壞死引發神經組織的炎癥反應，降低組織的氧化應激水平，它與其衍生物可能是一類預防和治療錳中毒等神經系統疾病的潛在藥物。

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作者簡介：何蓮瑜（1991.3-），女，壯族，廣西憑祥人，廣西醫科大學碩士研究生，主要研究方向：神經毒理學。

通訊作者：鄧祥發。