山桃外植體的安全消毒方法研究

張雪冰 王鴻 張帆 陳建軍 李寬瑩

摘要：以甘肅山桃為材料，采用 75% 的乙醇、0.1% 的氯化汞（HgCl2）、消毒片（有效氯500 mg/片）、新型植物組織培養防污染殺菌劑植培靈和益培隆，對材料莖段消毒效果行進比較，以篩選出合理有效的消毒方法來替代氯化汞消毒。結果表明：采用 0.1% 的氯化汞（HgCl2）與75%乙醇組合使用的消毒效果要明顯好于消毒片，植培靈和益培隆的污染率均為0%，其中益培隆的死亡率高于植培靈。綜合考慮污染率、死亡率、對植物生長的影響以及廢液對環境的影響等因素，植培靈為替代傳統氯化汞（HgCl2）消毒的最佳選擇。

關鍵詞：山桃;外植體;消毒方法;組織培養

中圖分類號：S662.1? ? ? ? ?文獻標志碼：A? ? ? ? ?文章編號：1001-1463（2019）06-0029-04

Abstract：In this paper， the influence of genetic factors and environmental factors on seed vigor of corn were summarized. The determination methods of seed vigor of corn were expounded. The research direction of seed vigor of corn was also forecasted.

Key words：Corn; Seed vigor; Environmental factors; Genetic factors; Research

核果類果樹是我國果樹栽培的重要種類。隨著科學技術的發展和人民生活水品的提高，現有的果品品種已經滿足不了人們的需求，當務之急選育出優良品種十分重要，而組培快繁技術為果樹的遺傳育種開辟了新道路[1 ]。桃是薔薇科桃屬核果類果樹，現利用組培快繁技術，能夠有效的縮短苗木繁育周期，提高種苗的繁育系數，同時也促進了桃的產業化發展[2 ]。果樹是一種高度雜合體， 實生苗間差異很大， 常常影響試驗結果。莖尖無性繁殖可以獲得大量苗木，能為這類試驗提供整齊一致的理想試驗材料[3 - 4 ]。然而，外植物污染是植物組織培養的三大難題之一，污染的主要原因之一就是外植體帶菌[5 ]。首先是外植體的選取，其中包括選取部位和選取時間;其次是外植體消毒方法的選擇，一般外植體的表面和內部都會攜帶一些菌，而這些菌直接影響到組培苗的生? ? ?長[6 ]。為了減少外植體的污染率，應該盡可能選取帶菌少并且不攜帶內生菌的材料作為外植體，選擇消毒效果顯著且對環境污染小的滅菌劑，有助于建立起綠色環保又有效的滅菌培養體系[7 ]。

1? ?材料與方法

1.1? ?試驗材料

6月初選取山桃[Amygdalus davidiana? （Carrière） de Vos ex Henry]1年生嫩枝作為試驗材料，采自甘肅省農業科學院林果花卉研究所蘭州實驗基地，以中上部分帶芽莖段為外植體。

1.2? ?試驗方法

預處理：將田間采回的試驗材料用自來水沖洗30 min，剪成2～3 cm帶芽莖段。在超凈工作臺上將剪好的莖段用無菌水漂洗1遍。

試驗分4個處理。處理①：75% 乙醇+ 0.1%的氯化汞（HgCl2）作消毒試劑，在 75% 的乙醇中浸泡30 s 后，再用 0.1% HgCl2浸泡相應的處理時間，用無菌水把殘留物沖洗干凈后接入培養基中，觀察培養結果。0.1% HgCl2浸泡相應的處理時間分別是30 s、1 min、2 min、3 min、4 min、5 min、6 min、7 min。處理②：75% 的乙醇+消毒片（有效氯500 mg/片）作消毒試劑，在 75% 的乙醇中浸泡30 s后，再用消毒片（有效氯500 mg/片）浸泡相應的處理時間，最后用無菌水把殘留物沖洗干凈后接入培養基中，觀察培養結果。消毒片（有效氯500 mg/片）浸泡相應的處理時間分別是30 s、1 min、2 min、3 min、4 min、5 min、6 min、7 min。處理③：新型植物組織培養防污染殺菌劑植培靈作消毒試劑，配置添加了不同濃度殺菌劑植培靈的培養基，然后將在超凈工作臺上處理好的莖段接入添加好不同濃度植培靈的培養基中并觀察培養結果。植培靈的處理濃度分別是，0.5 mL/L、1 mL/L、2 mL/L、3 mL/L、4 mL/L、5 mL/L、6 mL/L、7 mL/L。處理④：新型植物組織培養防污染殺菌劑益培隆作消毒試劑，配置添加了不同濃度殺菌劑益培隆的培養基，然后將在超凈工作臺上處理好的莖段接入添加好不同濃度益培隆的培養基中并觀察培養結果。處理濃度分別是A 0.1 mL/L +B 5 mg/L、A 0.2 mL/L +B 10 mg/L、A 0.3 mL/L +B 15 mg/L、A 0.4 mL/L +B 20 mg/ L、A 0.5 mL/L +B 25 mg/L、A 0.6 mL/L +B 30 mg/L、A 0.7 mL/L +B 35 mg/L、A 0.8 mL/L +B 40 mg/L、A 0.9 mL/L +B 45 mg/L、A 1.0 mL/L +? B 50 mg/L（根據使用說明，益培隆分A瓶、B瓶，消毒時需配合使用）。

2? ?結果與分析

從表1可知，在處理① 中，0.1% HgCl2消毒7 min 時污染率最低，同時死亡率也最高，達到 13.33%。從污染率和死亡率綜合考慮，0.1% 氯化汞（HgCl2）消毒5 min時消毒效果最好，污染率 3.33%，死亡率 6.67%。在達到顯著消毒效果的同時對植物本身的傷害又相對最小。從表2中可以看出，處理②中消毒片（有效氯500 mg/片）和 處理①0.1% HgCl2的消毒效果相比較，消毒片（有效氯500 mg/片）的消毒效果明顯較弱。消毒時間在7 min 時效果最好，污染率和死亡率分別是 13.33%和 3.33%。

從表3、表4來看，新型殺菌劑植培靈和益培隆的消毒效果比傳統消毒藥劑的消毒效果顯著。植培靈在培養基中的濃度為4 mL/L 時，消毒效果最好且死亡率為 0，污染率 3.33%。益培隆的消毒效果不如植培靈，且相對植培靈死亡率較高，當益培隆在培養基中的濃度為A 0.5 mL/L +B 25 mg/L時消毒效果最好，其中污染率和死亡率分別是 10.00% 和 3.33%。

3? ?結論與討論

試驗結果表明，當傳統消毒藥劑 75% 的乙醇分別與 0.1%氯化汞、消毒片（有效氯500 mg/片）組合使用時，75%的乙醇消毒30 s 和 0.1% 氯化汞（HgCl2）消毒5 min組合消毒效果明顯最好，污染率和死亡率均低至 3.33%。新型殺菌劑植培靈的消毒效果與0.1%氯化汞（HgCl2）的消毒效果不相上下，植培靈在培養基中濃度為4 mL/L時消毒效果最好，污染率 3.33%，死亡率 0%。

在傳統消毒藥劑中，0.1% 氯化汞（HgCl2）的消毒效果最好，但殘留物最不易清除，且使用后的廢液會對環境造成污染，很難處理。我們篩選出的新型滅菌劑植培靈，由植物源提取，無毒無害，熱穩定性好，可高溫滅菌，不產生抗藥性，不影響植物生長，并且消毒效果明顯比氯化汞（HgCl2）要好，也不會造成環境污染造，可作為替代傳統氯化汞（HgCl2）消毒方法的最佳選擇。

參考文獻：

[1] 楊? ?寧，楊? ?紅，楊穎麗，等.? 核果類果樹組織培養及遺傳轉化的研究進展[J].? 西北師范大學學報（自然科學版），2005（1）：94-100.

[2] 尤? ?超，孫? ?錦.? 溫室油桃組織培養快繁技術研究進展[J].? 黑龍江農業科學，2015（4）：161-163.

[3] 吳延軍，徐昌杰，張上隆.? 桃組織培養和遺傳轉化研究現狀及展望[J].? 果樹學報，2002（2）：123-127.

[4] 周玉碧.? 桃高效微繁體系的建立與遺傳穩定性研究[D].? 蘭州：甘肅農業大學，2005.

[5] 高曉華.? 如何解決《植物組織培養》教學實驗中的污染問題[J].? 福建質量管理，2016（2）：256.

[6] 胡? ?凱，張立軍，白雪梅，等.? 植物組織培養污染原因分析及外植體的消毒[J].? 安徽農業科學，2007（3）：680-681.

[7] 方? ?慶，熊明國，決? ?超.? 桃組織培養外植體滅菌方法的篩選[J].? 中國園藝文摘，2015，

31（7）：36-37.

（本文責編：陳? ? 珩）