藏藥多刺綠絨蒿種子萌發特性研究

袁芳 宋凱杰 蔡熙彤 蘭小中

摘 要： 多刺綠絨蒿（Meconopsis horridula ）為罌粟科綠絨蒿屬一年生草本植物，是一種極具觀賞價值和藥用價值的高山植物，目前處于瀕危狀態，因此研究多刺綠絨蒿種子的萌發特性對其種子育苗及人工栽培具有重要意義。為了提高多刺綠絨蒿的種子發芽率，該研究以多刺綠絨蒿的種子為材料，分析了不同消毒劑、浸種時間、溫度和外源植物激素對種子萌發特性的影響。結果表明：（1）最適消毒方法為75%乙醇1 min + 3% H2O2 ?5 min，最適浸種時間為24 h，最適溫度和光照條件為20 ℃/10 ℃（光照12 h/黑暗12 h），用無菌水浸種后的種子發芽率為49.67%。（2）GA3 100 ～ 600 mg·L-1和NAA 5 ～ 30 mg·L-1可以提高種子的發芽率、發芽勢和發芽指數，縮短發芽啟動時間和發芽持續時間，對種子的萌發有促進作用。（3）6-BA 5 mg·L-1和10 mg·L-1對種子的萌發有一定的促進作用，但不顯著，6-BA濃度≥15 mg·L-1則抑制種子的萌發。（4）用GA3 500 mg·L-1浸種后的種子發芽指標最好，發芽率、發芽勢和發芽指數分別為69.67%、33.00%、4.51，種子的發芽起始時間和發芽持續時間分別為10.67 d、11.67 d。

關鍵詞： 多刺綠絨蒿， 種子， 萌發， 消毒劑， 浸種時間， 溫度， 外源植物激素

中圖分類號： Q945.35，R282.2 ?文獻標識碼： A ?文章編號： 1000-3142（2019）07-0902-08

Abstract： Meconopsis horridula is an endangered annual herb belonging to family Papaveraceae. M. horridula is a rare alpine flower， and is a kind of traditional Tibetan medicine. In order to provide a scientific reference for the seed bree-ding and artificial cultivation of M. horridula， the germination characteristics of seeds were studied under the different conditions of disinfector， soaking time， temperature and exogenous plant hormone. The results were as follows： （1） The optimum conditions of seed disinfection method， soaking time， temperature and illumination were 75% ethanol 1 min + 3% H2O2 5 min， 24 h and 20 ℃/10 ℃ （illumination 12 h/darkness 12 h）， respectively， and the germination rate of disinfected seeds after soaked in sterile water 24 h was 49.67%. （2） Both GA3 100-600 mg·L-1 and NAA 5-30 mg·L-1 had effects on promotion the germination of seeds， mainly by improving seed germination rate， germination potential and germination index， and shortening germination start time and germination duration time. （3） 6-BA 5 mg·L-1 and 10 mg·L-1 both could promote the germination of seeds， but the effects were not significant， and when the 6-BA concentration higher than 15 mg·L-1， the germination of seeds were inhibited. （4） The germination data of M. horridula seeds soaked with GA3 500 mg·L-1 were the best. The germination rate， germination energy and germination index of seeds were 69.67%， 33.00% and 4.51， respectively， and the germination start time and germination duration time of seeds were 10.67 d and 11.67 d， respectively.

Key words： Meconopsis horridula， seed， germination， disinfector， soaking time， temperature， exogenous plant hormone

綠絨蒿屬（Meconopsis Vig.）是罌粟科綠絨蒿屬植物的總稱，全世界共有54種，中國有43種。本屬植物共有18種入藥，其中多刺綠絨蒿（Meconopsis horridula ）是本屬最具代表性的常用藏藥材（趙鳳等，2017）。多刺綠絨蒿為一年生草本植物，生長于海拔3 600～5 100 m的草坡或石坡上，在中國主要分布于西藏（廣泛分布）、甘肅西部、青海東部至南部、四川西部（中國植物志編委會，1999）。多刺綠絨蒿是享譽海內外的珍稀高山花卉，被稱作“喜馬拉雅藍罌粟”，以全草或地上部分入藥，藏語名為“刺爾恩”（趙鳳等，2017）。《晶珠本草》中記載，“刺爾恩”味苦，功效清熱，具有接骨、活血化瘀、止痛的作用，為治頭創傷最有療效之藥，藏醫多用于治療頭傷、骨折、跌打損傷等，臨床上多以復方形式入藥（帝瑪爾·丹增彭措，2012;中國科學院西北高原生物研究所，1991）?！吨腥A人民共和國衛生部藥品標準》收載了十余種含有多刺綠絨蒿的藏藥成方制劑（中華人民共和國衛生部藥典委員會，1995）。目前，已從多刺綠絨蒿中分離得到生物堿類、黃酮類、萜類、甾體類等化合物，現代藥理學研究多圍繞抗癌、抗病毒、心臟保護等方面（趙鳳等，2017;Guo et al.，2016;Fan et al.，2015）。

多刺綠絨蒿的生境特殊，儲量有限，加之引種馴化困難，商品多刺綠絨蒿主要以野生為主，導致其野生資源急劇減少。在2005年，多刺綠絨蒿被列為西藏自治區Ⅲ級瀕危藏藥材。盧杰等根據西藏自治區（中）藏藥資源的調查數據，建議將其列入Ⅰ級瀕危藏藥材名錄（盧杰等，2011;盧杰和蘭小中，2013a，2013b）。保護綠絨蒿野生資源并解決市場資源緊缺問題，最重要的是發展人工栽培（索南仁欠，2017）。種子繁殖方式既能保證后代種群的遺傳多樣性，又能增強幼苗的抗逆性和生長潛力，是植物人工栽培最易成功的一種繁殖方式（屈燕和區智，2012）。對于長年生長于高寒山區，生態幅度較小的綠絨篙引種時，以種子進行繁殖比移植效果更好（董曉東等，1995）。

多刺綠絨蒿種子休眠為PY+PD（物理休眠和生理休眠）型復合休眠，且自然狀態下發芽率低，給人工栽培帶來了一定的困難（達清璟等，2018），所以打破休眠提高種子發芽率，是開展多刺綠絨蒿人工栽培的首要任務，但是目前有關此方面的研究報道甚少。因此，本研究以多刺綠絨蒿種子為材料，運用發芽試驗方法，探討不同消毒劑、不同浸種時間與萌發溫度及外源植物激素對多刺綠絨蒿種子萌發的影響，以期提高多刺綠絨蒿種子發芽率，為這一珍貴觀賞與藥用植物資源的保護、栽培和引種馴化等提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

多刺綠絨蒿種子于2015年9月采自西藏自治區那曲市嘉黎縣。種子自然干燥后于4 ℃低溫貯藏6個月。種子千粒重為（0.096 2±0.008 5）g。

1.2 方法

1.2.1 種子消毒處理 將種子先用流水沖洗10 min，然后轉入超凈工作臺進行消毒處理。先用將種子75%乙醇消毒1 min，無菌水沖洗3次，再分別用0.1% HgCl2、2% NaClO和3% H2O2消毒5 min或10 min，無菌水沖洗3次。接種前，用無菌水浸泡種子12 h。共6個消毒處理，每個處理設3次重復，每個重復1個培養皿，每個培養皿接種100粒種子，在培養箱中于20 ℃、12 h光照/12 h黑暗交替下培養。

1.2.2 浸種時間與萌發溫度處理 浸種時間設置為不浸種、浸種12 h、18 h和24 h共4個處理。參考西藏自治區氣溫變化資料（杜軍等，2016;楊春艷等，2014），萌發溫度設置為15 ℃、20 ℃、20 ℃/10 ℃（光照/黑暗）、25 ℃和25 ℃/15 ℃（光照/黑暗）共5個處理。光照條件為12 h光照/12 h黑暗交替。根據1.2.1的試驗結果，種子用最適消毒方法（75%乙醇1 min + 3% H2O2 5 min）消毒后，先用無菌水經不同時間的浸種，然后將種子置于設置有不同萌發溫度的培養箱中培養。每個處理設3次重復，每個重復1個培養皿，每個培養皿接種100粒種子。

1.2.3 外源植物激素處理 根據本課題組前期研究，選用赤霉素（GA3）、6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）和萘乙酸（NAA）三種植物激素，質量濃度分別設置為GA3（100、200、300、400、500、600 mg·L-1）、6-BA（5、10、15、20、25、30 mg·L-1）、NAA（5、10、15、20、25、30 mg·L-1）。經過消毒處理的種子，用無菌水（對照）和不同質量濃度的GA3、6-BA、NAA分別浸種24 h后，無菌水沖洗3次。每個處理設3次重復，每個重復1個培養皿，每個培養皿接種100粒種子。在培養箱中20 ℃/10 ℃（光照/黑暗）、12 h光照/12 h黑暗交替下培養。浸種時間24 h與萌發溫度20 ℃/10 ℃從1.2.2的試驗結果獲得。

上述處理中使用的不同消毒劑和植物激素均用無菌水配制，植物激素母液經抽濾滅菌。采用培養皿紙床發芽法，將兩層PhytoTC種子萌發紙（購自北京啟維益成科技有限公司）鋪在培養皿中高溫高壓滅菌后，將培養皿內的萌發紙用無菌水浸濕，種子均勻撒播在萌發紙上，并用Parafilm封口膜進行封口。

1.2.4 測定指標與計算 以胚根露出種孔2 mm為種子的萌發標志。從處理當天開始，每24 h記錄每皿中萌發的種子數，并移出已萌發的種子，連續7 d對照組和試驗組的種子萌發數不變時視為種子萌發進程結束。統計種子的污染率、發芽啟動時間、發芽持續時間、發芽率、發芽勢及發芽指數（鄭道君等，2017;郭秋菊等，2018）。（1）污染率=污染種子數/供試種子總數×100%;（2）發芽啟動時間，即萌發時滯，指從萌發試驗開始到第1粒種子開始萌發所持續的天數;（3）發芽持續時間，即種子開始萌發到最后1粒種子萌發的總天數;（4）發芽率=種子發芽總數/供試種子總數×100%;（5）發芽勢=日發芽種子最大時的發芽種子數/供試種子總數×100%;（6）發芽指數=∑（Gt/Dt），其中Gt為t日內的發芽數，Dt為相應的發芽日數。

1.3 數據處理

試驗數據采用Excel 2010進行整理和作圖，SPSS 19.0進行差異顯著性分析（P<0.05）。

2 結果與分析

2.1 不同消毒處理對多刺綠絨蒿種子消毒效果和萌發的影響

種子病蟲害直接影響種子發芽率。由表1可知，不同消毒處理對多刺綠絨蒿種子的消毒效果和萌發有顯著影響。75%乙醇1 min + 0.1% HgCl2 5 min、75%乙醇1 min + 0.1% HgCl2 10 min和75%乙醇1 min + 2% NaClO 10 min等3個處理的種子污染率均為0，其余3個處理的種子帶菌，但污染率均低于7%。0.1% HgCl2的消毒效果最好，其次為2% NaClO，3% H2O2的消毒效果較差。從種子的萌發情況來看，0.1% HgCl2對種子萌發的抑制作用最大，種子萌發率低于4%;其次為2% NaClO;3% H2O2對種子萌發的抑制作用最小。75%乙醇1 min + 3% H2O2 5 min消毒處理的種子，雖然污染率為6.67%，但是種子萌發最快（13.33 d），發芽持續時間較短（13.67 d），發芽率最高（26.67%）。

2.2 不同浸種時間與萌發溫度對多刺綠絨蒿種子發芽率的影響

由圖1可知，多刺綠絨蒿種子在不同浸種時間與萌發溫度的交互作用下， 發芽率呈現出不同的變化趨勢。在15 ℃和25 ℃時，隨著浸種時間的延長，發芽率呈現先升高后降低的趨勢。在20 ℃、20 ℃/10 ℃和25 ℃/15 ℃時，隨著浸種時間的延長，發芽率逐漸升高，且在相同溫度條件下，浸種18 h和24 h的發芽率顯著高于不浸種和浸種12 h的發芽率。在同一浸種時間下，變溫處理的發芽率顯著高于恒溫處理，在20 ℃/10 ℃時，浸種18 h的發芽率為46.00%，24 h的發芽率為49.67%。綜上所述，在浸種24 h、萌發溫度為20 ℃/10 ℃的條件下多刺綠絨蒿的種子發芽率最高，并將該條件作為不同濃度GA3、6-BA和NAA處理種子的試驗條件。

2.3 不同濃度外源植物激素對多刺綠絨蒿種子萌發的影響

2.3.1 不同濃度GA3對多刺綠絨蒿種子萌發的影響 由表2可知，不同濃度GA3顯著提高了種子發芽率，處理后的發芽率為51.33% ～ 69.67%，而對照（GA3 0 mg·L-1）的發芽率為48.00%。其中，500 mg·L-1處理下發芽率最高，比對照高21.67%;其次為 600 mg·L-1，發芽率比對照高19.33%;500 mg·L-1與600 mg·L-1處理間無顯著差異。同時，GA3處理也提高了發芽勢和發芽指數，各處理之間有明顯差異。發芽勢和發芽指數隨著GA3濃度的增大而逐漸升高，在500 mg·L-1處理下達到峰值，分別比對照高27.00%和2.17。當GA3濃度為600 mg·L-1時，發芽勢和發芽指數有所降低。另外，GA3 100 ～ 400 mg·L-1對縮短發芽啟動時間和發芽持續時間的作用不明顯。GA3 500 mg·L-1極顯著地縮短了種子發芽啟動時間和持續時間，比對照提前3 d萌發，從萌發開始到結束持續11.67 d，比對照縮短3.66 d。當GA3濃度為600 mg·L-1時，發芽啟動時間和持續時間呈增加趨勢。綜上所述，在試驗設定的不同濃度GA3處理中，用500 mg·L-1浸種最好。

2.3.2 不同濃度6-BA對多刺綠絨蒿種子萌發的影響 由表3可知，不同濃度6-BA對多刺綠絨蒿種子的萌發有著不同的影響。發芽啟動時間隨著6-BA濃度的增大而逐漸延長，在5 mg·L-1處理下發芽啟動時間比對照延長0.33 d，在30 mg·L-1處理下發芽啟動時間比對照延長11.33 d。發芽持續時間則隨著6-BA濃度的增大而逐漸縮短，在30 mg·L-1處理下，從種子萌發開始到結束持續5.33 d，比對照縮短10 d。隨著濃度的增大，發芽率、發芽勢和發芽指數呈先升高后降低的趨勢。當6-BA的濃度為 5 mg·L-1和10 mg·L-1時，發芽率、發芽勢和發芽指數均高于對照，但發芽率和發芽指數與對照無顯著差異。其中，5 mg·L-1處理下，發芽率、發芽勢和發芽指數最高，分別比對照高6.67%、1.00%和0.39。當6-BA濃度≥15 mg·L-1時，則對種子萌發表現為一定的抑制作用，且質量濃度越高抑制作用越明顯。綜上所述，在試驗設定的不同濃度的6-BA處理中，用 5 mg·L-1浸種最好。

2.3.3 不同濃度NAA對多刺綠絨蒿種子萌發的影響 由表4可知，一定質量濃度的NAA可以提高多刺綠絨蒿種子的發芽率、發芽勢、發芽指數，縮短種子發芽啟動時間和發芽持續時間。NAA 20、25 mg·L-1處理下種子發芽率、發芽勢、發芽指數顯著高于對照（NAA 0 mg·L-1）。20 mg·L-1處理下種子發芽勢（21.00%）和發芽指數（3.16）最高，分別比對照高15%和0.82。25 mg·L-1處理下發芽率（61.67%）最高，分別比對照和20 mg·L-1處理高13.67%和2.00%，但是發芽勢和發芽指數比20 mg·L-1處理降低了1.67%和0.25。另外，25 mg·L-1處理下，種子萌發最快，比對照提前2.67 d萌發，發芽持續時間比對照縮短5.33 d。當濃度為30 mg·L-1時，發芽率、發芽勢、發芽指數顯著降低，且發芽指數低于對照。綜上所述，在試驗設定的不同濃度的NAA處理中，用25 mg·L-1浸種最好。

2.3.4 GA3、6-BA和NAA最優處理的比較分析 對2.3.1 ～ 2.3.3分析中GA3、6-BA和NAA的最優處理進行比較分析的結果見圖2。由圖2可知，在發芽率方面，GA3 500 mg·L-1、6-BA 5 mg·L-1和NAA 25 mg·L-1處理下種子發芽率與對照差異顯著，發芽率均高于對照;其中GA3 500 mg·L-1處理的種子發芽率最高，為69.67%，比對照高21.67%。在發芽勢方面，三種試劑最優處理下種子發芽勢均高于對照;GA3 500 mg·L-1處理的種子發芽勢最高，為33.00%，比對照高27.00%;其次為NAA 25 mg·L-1處理下種子發芽勢比對照高13.33%;6-BA 5 mg·L-1處理下種子發芽勢與對照無顯著差異。在發芽指數方面，除了GA3 500 mg·L-1處理外，其他處理的發芽指數與對照均無顯著差異。在發芽啟動時間方面，除了6-BA 5 mg·L-1處理的種子發芽啟動時間與對照無顯著差異外，其他處理均可縮短發芽啟動時間，促進種子提前萌發;其中，GA3 500 mg·L-1處理的種子發芽最快，比對照提前3 d萌發。在發芽持續時間方面，三種試劑最優處理下種子發芽持續時間與對照差異顯著，發芽持續時間均低于對照，其中NAA 25 mg·L-1處理的種子10 d左右萌發結束，比對照縮短5.33 d。但是，NAA 25 mg·L-1處理下種子發芽率、發芽勢和發芽指數均低于GA3 500 mg·L-1處理。綜上所述，GA3 500 mg·L-1對多刺綠絨蒿種子萌發的促進作用最顯著。

3 討論與結論

多刺綠絨蒿是一種極具觀賞價值和藥用價值的高山植物，提高其種子發芽率將有利于引種馴化工作的進一步開展。影響種子萌發的因素有很多，包括外部生態因素和內部生理因素，對不同植物來說，影響種子萌發的主要因子也有差異（徐恒恒等，2014;屈燕和區智，2012）。

種子萌發容易受到病害的影響，許多病害都是由帶菌種子引起的。本課題組在預試驗中發現不進行消毒處理的多刺綠絨蒿種子，其帶菌率為53.00%，發芽率僅為9.67%，且幼苗的長勢差。在本試驗中，采用75%乙醇1 min + 3% H2O2 5 min的方法對種子消毒，消毒效果較好，種子發芽率提高到26.67%，說明多刺綠絨蒿種子病害對種子的萌發具有一定的抑制作用，通過適當的消毒處理可提高種子的發芽率。另外，與0.1% HgCl2和2% NaClO相比較，3% H2O2在達到消毒效果的同時，還具有促進多刺綠絨蒿種子萌發的作用，可能是由于適當濃度的H2O2可輕度腐蝕種皮，提高種皮的通透性，為種子提供充足的氧氣而解除休眠（何士敏等，2008）。H2O2在促進種子萌發方面的另一個作用是刺激對解除種子休眠有重要作用的一條胚乳物質代謝途徑——磷酸戊糖途徑（徐是雄等，1987）。

種子萌發起始于水分吸脹（徐恒恒等，2014）。在種子萌發特性研究中，浸種是比較常用的破除休眠的物理方法。屈燕等（2018）研究了清水浸種不同時間對總狀綠絨蒿種子萌發的影響，結果顯示，浸種24 ～ 36 h，均可增加種子發芽率和發芽勢。達清璟等（2018）的研究顯示，多刺綠絨蒿種子在浸種18 h后達到最大吸水率97.80%，浸種20 h后吸水達到飽和，并趨于動態平衡。在本試驗中，在適宜的溫度條件下，分別浸種12 h、18 h和24 h均可顯著提高多刺綠絨蒿種子的發芽率，雖然浸種18 h和24 h的發芽率無顯著差異，但是浸種24 h的發芽率最高（49.67%），說明種皮對種子的萌發不造成透性障礙，這與達清璟等（2018）的研究結果一致。

溫度也是影響種子萌發的重要因子。本試驗研究了3個恒溫條件（15 ℃、20 ℃、25 ℃）和2個變溫條件（20 ℃/10 ℃、25 ℃/15 ℃）對多刺綠絨蒿種子發芽率的影響，結果表明20 ℃/10 ℃變溫處理更有利于多刺綠絨蒿種子的萌發，原因是多刺綠絨蒿生長在海拔3 600 ～ 5 100 m的地區，高海拔地區氣溫低，晝夜溫差大，本試驗設置的20 ℃/10 ℃溫度條件比較符合西藏高海拔地區春季氣溫的變化規律。

外源激素法是揭示種子休眠和萌發的激素調控機理的重要研究方法，已被廣泛應用于種子萌發特性研究（徐恒恒等，2014）。屈燕等（2018）將總狀綠絨蒿的種子用GA3 250 mg·L-1和NAA 10 mg·L-1浸種24 ～ 36 h后，均能達到較好的萌發效果;而6-BA處理抑制總狀綠絨蒿種子的萌發。在本試驗中，GA3 500 mg·L-1在打破多刺綠絨蒿種子休眠促進其萌發方面效果顯著，其次為NAA 25 mg·L-1處理;低濃度6-BA（<15 mg·L-1）雖然能夠促進多刺綠絨蒿種子的萌發，但影響不顯著，高濃度6-BA（≥15 mg·L-1）則會抑制多刺綠絨蒿種子的萌發，這與屈燕等（2018）對總狀綠絨蒿進行的相關研究結果相似。

綜合消毒劑、浸種時間、溫度和外源植物激素對多刺綠絨蒿種子萌發特性的影響，得出多刺綠絨蒿種子經75%乙醇1 min + 3% H2O2 5 min消毒后，用GA3 500 mg·L-1浸種24 h，在20 ℃/10 ℃（光照12 h/黑暗12 h）條件下，種子萌發最快，發芽率和發芽整齊度最高。由于本研究只比較了3種外源植物激素對多刺綠絨蒿種子萌發時期的影響，這3種外源植物激素對幼苗生長有何影響及是否存在能更好地促進多刺綠絨蒿種子萌發的其他外源植物激素還有待進一步研究。

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