一株野生粗毛纖孔菌的分類鑒定及其發酵上清液的抗腫瘤活性

唐少軍 陳定安 邵晨霞 許雋 楊祎 靳磊 吳勝蓮

摘要：【目的】對一株野生粗毛纖孔菌進行分類學鑒定，并分析其發酵上清液抗腫瘤活性，為粗毛纖孔菌的開發利用及抗腫瘤活性機制研究提供理論依據。【方法】通過形態特性觀察、ITS序列分析及系統發育進化樹構建等方法對一株野生粗毛纖孔菌（簡稱IH3菌株）進行分類學鑒定，并利用B16、Hep-3B、Hela、MCF-7、HCT-116和4T1 6種腫瘤細胞及正常細胞HUVEC分析該菌株發酵上清液的抗腫瘤譜。從石油醚、乙酸乙酯和正丁醇中篩選出萃取抗腫瘤活性物質的最佳有機溶劑，利用液相色譜分離技術分離抗腫瘤活性組分，并利用MTT（四唑鹽）法分析活性組分對不同腫瘤細胞的半致死濃度（IC50）。【結果】IH3菌株的形態特性與粗毛纖孔菌相似，且其ITS序列與粗毛纖孔菌（MF183947.1）的相似度最高，為98%，鑒定為粗毛纖孔菌。系統發育進化樹分析結果也顯示，IH3菌株屬于纖層孔菌屬類群，與3個粗毛纖孔菌菌株的親緣關系較近。IH3菌株的發酵上清液對不同腫瘤細胞的抑制活性排序為：B16>Hep-3B>Hela>MCF-7>4T1=HCT-116。正丁醇萃取的IH3菌株發酵上清液抗腫瘤活性組分對B16腫瘤細胞的抑制率最高，達80%，說明正丁醇對發酵上清液中抗腫瘤活性組分的萃取效果最佳。利用液相色譜分離方法可有效獲得純度較高的單一抗腫瘤活性組分（WIH3），該活性組分對B16、Hep-3B、Hela和MCF-7腫瘤細胞的半致死濃度（IC50）分別為29.322、37.387、47.029和58.009 μg/mL。【結論】IH3菌株被鑒定為粗毛纖孔菌，與已發表的粗毛纖孔菌菌株存在遺傳差異，可能為粗毛纖孔菌的新亞種，其發酵上清液具有廣譜的抗腫瘤活性。

關鍵詞： 粗毛纖孔菌;鑒定;抗腫瘤活性;液相色譜分離;半致死濃度（IC50）

中圖分類號： S718.81? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）08-1671-09

Classification and identification of a wild Inonotus hispidus and the antitumor activity of the fermentation supernatant

TANG Shao-jun1， CHEN Ding-an2， SHAO Chen-xia1， XU Jun1， YANG Yi1，

JIN Lei1， WU Sheng-lian1*

（1Hunan Microbiology Institute， Changsha? 410009， China; 2 Agricultural Science Research Institute of Dingcheng District， Changde， Hunan? 415102， China）

Abstract：【Objective】The wild Inonotus hispidus was classified and identified，and the antitumor activity of its fermentation supernatant was analyzed，which provided a basis for the development and utilization of this strain as well as research of antitumor activity mechanism. 【Method】A wild I. hispidus（IH3 fungi） was classified and identified through the morphology observation，ITS sequence and phylogenetic tree. The antitumor spectrum of the fermentation supernatant was analyzed by six kinds of tumor cells including B16， Hep-3B， Hela， MCF-7， HCT-116 and 4T1 and normal cell HUVEC. The optimal organic reagent was selected from petroleum ether，? acetic ether and normal butanol. The antitumor active component was isolated by liquid chromatography， and medial lethal concentration（IC50） of different tumor cells was ana-lyzed by MTT（tetrazolium salt）. 【Result】IH3 fungi was similar to I. hispidus in morphology，its ITS sequence was the closest to the I. hispidus strain MF183947.1 with the similarity of 98%. It was preliminarily identified as I. hispidus.The phylogenetic tree analysis indicated that IH3 fungi belonged to Inonotus， and had close relationship with three I. hispidus strains. Inhibition activity of IH3 fungi fermentation supernatant to the tumor cells was： B16>Hep-3B>Hela>MCF-7>4T1=HCT-116. The inhibition rate of antitumor active component of IH3 strain fermentation supernatant extracted from normal butanol to B16 tumoe cell was the highest（80%），indicating that normal butanol had the best extraction effect on antitumor active substances in fermentation supernatant. A single antitumor active component（WIH3） with high purity was obtained by liquid chromatography. Its IC50 to tumor cells B16，Hep-3B，Hela and MCF-7 were 29.322，37.387，47.029，58.009 μg/mL， respectively. 【Conclusion】The IH3 strain was identified as I. hispidus，which is different from the published I. hispidus strains genetically，it may be a new subspecies of I. hispidus，and its fermentation supernatant has a broad spectrum of antitumor activity.

Key words： Inonotus hispidus; identification; antitumor activity; liquid chromatography; medial lethal concentration

0 引言

【研究意義】粗毛纖孔菌（Inonotus hispidus）主要生長在水曲柳、桑樹、榆樹、楊樹和日本槐等樹種的活立木上，偶爾生長在其倒木上（王婷等，2016;Markakis et al.，2017）。該菌是一種重要的藥用真菌，在我國東北地區常用于治療消化不良等胃病，新疆南部等地區常用于治療癌癥、糖尿病等疑難疾病（崔寶凱等，2009;甄占萱等，2013），但其菌種資源較少，主要采集野生的子實體入藥。因此，豐富粗毛纖孔菌的菌種資源，篩選分離出藥效成分含量高、活性強的新菌株，對粗毛纖孔菌的開發利用具有重要意義。【前人研究進展】目前，有關粗毛纖孔菌的研究主要集中在藥用價值方面（Awadh et al.，2003;Gründemann et al.，2016;Liu et al.，2019a）。陳志娜等（2018）研究發現，粗毛纖孔菌甲醇提取物中的總多酚和總黃酮含量最高，抗氧化活性和抑菌活性最強，是天然抗氧化劑的良好來源。Liu等（2019b）研究發現，粗毛纖孔菌子實體和菌絲體中的多糖成分能顯著延長小鼠的醉酒時間及縮短醒酒時間，并減緩由酒精引起的肝指數、谷丙轉氨酶（ALT）活性、谷草轉氨酶（AST）活性和丙二醛（MDA）含量的升高，提高乙醇脫氫酶（ADH）、過氧化氫酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）活性，對急性酒精肝損傷小鼠具有一定的保護作用。此外，粗毛纖孔菌子實體中含有多種抗腫瘤活性成分，如inonotusin A對人乳腺癌細胞MCF-7、inoscavin C對肝癌細胞HepG-2和卵巢癌細胞skov3均具有一定的抑制作用（Zan et al.，2011;昝立峰等，2013）;子實體多糖成分具有抗腫瘤活性，可抑制H22荷瘤小鼠的腫瘤生長（張媛和包海鷹，2014）;丁炔二醇丙氧基化合物（BMP）對HepG2肝癌細胞有明顯的抑制作用，且誘導腫瘤細胞凋亡（楊樹東等，2019）;HDE[（4S，5S）-4-羥基-3，5-二甲氧基環己烯-2-烯酮]可通過增強caspase-3和caspase-8蛋白的表達而抑制小鼠肝癌細胞H22增長（Yang et al.，2019）;Hispolon可通過阻礙細胞形成NF-κβ復合體而抑制腫瘤生長（Paul et al.，2019）。【本研究切入點】雖然已有大量研究證實粗毛纖孔菌子實體具有良好的抗氧化、抗病毒和提高免疫力的作用，應用潛力巨大，但其菌種資源匱乏，鮮見鑒定野生粗毛纖孔菌菌株并測定其發酵液抗腫瘤活性的研究報道。【擬解決的關鍵問題】通過形態特性觀察、ITS序列分析及系統發育進化樹構建等方法對一株野生粗毛纖孔菌進行分類學鑒定;利用B16、Hep-3B、Hela、MCF-7、HCT-116和4T1 6種腫瘤細胞及正常細胞HUVEC分析該菌株發酵上清液的抗腫瘤譜;利用液相色譜分離技術分離抗腫瘤活性組分;利用MTT（四唑鹽）法分析活性組分的半致死濃度（IC50），通過體外細胞實驗分析活性組分的藥用價值，為粗毛纖孔菌的藥用開發提供重要理論依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

小鼠黑色素瘤細胞B16、肝癌腫瘤細胞Hep-3B、人宮頸癌腫瘤細胞Hela、人乳腺癌腫瘤細胞MCF-7、小鼠乳腺癌腫瘤細胞4T1、人結腸癌腫瘤細胞HCT-116和人臍靜脈血管內皮正常細胞HUVEC均購自中國典型培養物保藏中心（CCTCC）。供試的野生粗毛纖孔菌采摘于湖南省桑植縣的活楊樹主干上，由湖南省微生物研究院實驗室保藏（保藏編號IH3，NCBI登錄號MK583675.1），以下簡稱為IH3菌株。rTaq DNA聚合酶、T載體和連接酶均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。色譜甲醇購自美國FISHER公司，其他試劑均為國產分析純，購自北京化工廠。胎牛血清（FBS）購自杭州四季青生物工程有限公司。

主要儀器設備：N-1000v-W型旋轉蒸發儀（瑞士Büchi公司）、XDS-3型倒置生物顯微鏡（意大利Optika公司）、C18反相色譜柱、酶標儀（美國Bio-Rad公司）和Agilent 1260高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 菌株分離純化 將采集的子實體用75%酒精消毒表面，以無菌手術刀縱切，從縱切面的中心位置切取黃豆大小的菌塊，置于PDA固體培養基表面，26 ℃培養箱正置培養，待菌絲萌發后，挑取菌絲至新的PDA培養基，反復3次后，將菌絲轉接至PDA斜面培養基進行留種。

1. 2. 2 形態學鑒定 采用插片法觀察分離菌株的菌絲形態：將純化菌絲接種于PDA固體培養基，在離接種點2 cm處45o斜插蓋玻片，26 ℃培養7 d后，取出布有菌絲的蓋玻片，置于載玻片上，在XDS-3型倒置生物顯微鏡下觀察菌絲形態。

1. 2. 3 ITS序列擴增 供試菌株接種至PDA固體培養基上，待菌絲長滿后取適量菌絲，利用真菌基因組提取試劑盒提取其DNA，參照吳勝蓮等（2018）的方法，采用ITS1和ITS4通用引物PCR擴增其ITS序列，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，并送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1. 2. 4 系統發育進化樹構建 將ITS序列測序結果提交至NCBI數據庫進行BLAST比對，從中獲取與供試菌株親源關系較近的模式菌株ITS序列，并選取在分類上易與粗毛纖孔菌混淆的桑黃菌屬和針層孔菌屬的ITS序列，運用ClustalX 1.81進行多重序列比對。最后，利用MEGA 3.1的鄰接法（N-J）構建系統發育進化樹（Replications=1000，Bootstrap值取百分比）。

1. 2. 5 菌株發酵上清液的抗腫瘤譜分析 將PDA固體培養基上的菌絲用打孔法接種到PDA液體培養基中，每100 mL液體培養基接種4個菌絲塊，置于26 ℃搖床培養箱（130 r/min）中培養10 d，用無菌紗布過濾出菌絲球后即可獲得發酵上清液。將發酵上清液用2 μm濾膜過濾除菌后4 ℃保存。用含10% FBS的RPMI-1640培養基培養腫瘤細胞，在96孔板中接種B16、Hep-3B、Hela、MCF-7、HCT-116和4T1腫瘤細胞及正常細胞HVUEC，每孔1×103 cells/100 μL，置于5% CO2培養箱中，37 ℃培養12 h，分別加入5、10、15、20、30和35 μL發酵上清液作為藥物組，以加入同體積的無菌水作為對照，調零組只加細胞培養基不加細胞和樣品，以上均設4個重復。培養48 h后，觀察細胞形態變化，每孔加5 mg/mL MTT 10 μL，培養3 h后，吸除MTT和培養基，每孔加入100 μL Formazan溶解液，振蕩15 min后，490 nm波長下測定OD，從而計算出發酵上清液對腫瘤細胞的抑制率：細胞抑制率（%）=（藥物組-對照組）/（調零組-對照組）×100（張連茹等，2010）。

1. 2. 6 抗腫瘤活性成分萃取分離 收集6 L菌株發酵上清液，用旋轉蒸發儀濃縮體積至600 mL，再分裝成3份，各200 mL，分別用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇3種有機溶劑對發酵上清液進行萃取（體積比為有機溶劑∶發酵上清液=3∶1），分別萃取3次，用旋轉蒸發儀去除有機溶劑后，分別用10 mL無菌水復溶。在96孔板中接種B16腫瘤細胞，分別加入30 μL的萃取樣品，培養48 h后計算發酵上清液對腫瘤細胞的抑制率，跟蹤檢測活性成分，以篩選出萃取抗腫瘤活性物質的最佳有機溶劑。

1. 2. 7 液相色譜分離 首先對正丁醇萃取的抗腫瘤活性成分進行分子篩色譜分離（色譜柱Sephadex LH-20，流動相0.08 mol/L NaH2PO4溶液，流速1.0 mL/min，檢出波長250 nm，洗脫時間30 min），收集色譜主峰洗脫液，對其進行抗腫瘤活性檢測，檢出活性峰。然后對收集的活性峰進行反相色譜分離（C18反相色譜柱，流動相A為無菌水，流動相B為乙腈，流速0.5 mL/min，5%～95%無菌水進行梯度洗脫，洗脫時間25 min，檢出波長250 nm），收集每個峰洗脫液，用旋轉蒸發儀去除有機溶劑后，用10 mL無菌水復溶，對其進行抗腫瘤活性檢測，檢出活性峰。

1. 2. 8 MTT法分析活性組分 將液相色譜分離得到的活性組分配制成不同濃度梯度溶液（10、20、30、40、50、60、70和80 μg/mL）。在96孔板中接種B16、Hela、Hep-3B和MCF-7腫瘤細胞及正常細胞HUVEC，每孔1×103 cells/100 μL，分別加入30 μL不同濃度梯度的活性組分溶液，以30 μL無菌水為對照，5% CO2培養箱中分別培養24、48和60 h后，每孔加5 mg/mL MTT 10 μL，培養3 h后，吸除MTT和培養基，每孔加入100 μL Formanzan溶解液，振蕩15 min，490 nm波長下測定OD，計算活性組分對腫瘤細胞的抑制率及半致死濃度（IC50）。

1. 3 數據分析

腫瘤細胞的抑制率采用GraphPad Prism 5進行分析并制圖，IC50采用SPSS 13.0進行分析并制圖。

2 結果與分析

2. 1 IH3菌株的形態學鑒定結果

IH3菌株的子實體呈平伏狀，木栓質，長13 cm，寬8 cm，厚3 cm，上部分為青色褶皺狀，無粗毛，邊緣有褐色粗毛，下部分為金黃色并生長有粗毛，粗毛間有孔隙（圖1-A）。該菌株菌絲在PDA固體培養基上以接種塊為中心呈輻射狀擴張生長，呈絨毛狀，生長前期為白色，后期變為金黃色，在棉藍試劑中不變色，在PDA液體培養基中菌絲呈黃色球型，可貼壁生長，菌絲直徑約5 μm，極少分枝，有不明顯的分隔（圖1-B、圖1-C和圖1-D）。擔孢子呈橢圓形，表面光滑，平均長度為8.8 μm，寬6.1 μm，形態特征與《中國真菌志》（張小青和戴玉成，2005）粗毛纖孔菌相似。

2. 2 IH3菌株的分子生物學鑒定結果

對IH3菌株ITS序列的PCR產物雙向測序后，將測序結果進行拼接，發現ITS序列的長度為810 bp，將其提交至NCBI數據庫中進行BLAST比對，結果發現，其與粗毛纖孔菌（MF183947.1）ITS序列的相似度為98%。結合該菌株的形態學特征，最終確定IH3菌株為粗毛纖孔菌（I. hispidus）。

從NCBI選取與IH3菌株同源性較高的3個粗毛纖孔菌菌株、纖孔菌屬5個模式菌種及在分類上易與粗毛纖孔菌混淆的針層孔菌屬和桑黃菌屬模式菌種的ITS序列，采用鄰接法構建系統發育進化樹，結果如圖2所示。系統發育進化樹明顯分為三大類群，Group 1為桑黃孔菌屬（Sanghuangporus），Group 2為針層孔菌屬（Phellinus），Group 3為纖層孔菌屬（Inonotus）。IH3菌株屬于Group 3（纖孔菌屬），與3個粗毛纖孔菌菌株的親緣關系較近，尤其是與粗毛纖孔菌（MF183947.1）的親緣關系最近，進一步證實IH3菌株為粗毛纖孔菌。但該菌株在系統發育進化樹上形成獨立分支，且與親緣關系最近的菌株ITS相似度僅為98%，說明IH3菌株與已發表的粗毛纖孔菌存在遺傳差異，可能是粗毛纖孔菌的新亞種。雖然粗毛纖孔菌的形態與桑黃菌屬和針層孔菌屬菌株類似，但三者分別屬于不同類群，存在明顯的遺傳差異。將IH3菌株的ITS序列提交NCBI數據庫，登錄號為MK583675.1。

2. 3 IH3菌株發酵上清液的抗腫瘤譜分析結果

由圖3可知，對照組的腫瘤細胞形態規則且致密貼壁生長，藥物組的腫瘤細胞明顯變形，細胞變圓稀疏，甚至漂浮。正常細胞HUVEC的對照組與藥物組幾乎沒有差別。由圖4可知，隨著發酵上清液體積的增加，B16、Hela、MCF-7和Hep-3B腫瘤細胞的抑制率明顯增加，但4T1和HCT腫瘤細胞及正常細胞HUVEC的抑制率增加不明顯;IH3菌株發酵上清液對不同腫瘤細胞的抑制活性排序為：B16>Hep-3B>Hela>MCF-7>4T1=HCT-116，說明IH3菌株的發酵上清液具有廣譜的抗腫瘤活性。

2. 4 發酵上清液中腫瘤活性成分的萃取分離結果

分別用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇對濃縮后的發酵上清液進行萃取，以篩選出萃取抗腫瘤活性物質的最佳有機試劑，結果如圖5所示。正丁醇萃取抗腫瘤活性成分對B16腫瘤細胞的抑制率最高，達80%，說明正丁醇對發酵上清液中抗腫瘤活性成分的萃取效果最佳。

2. 5 液相色譜分離活性物質

對正丁醇萃取的抗腫瘤活性成分進行分子篩色譜分離，結果如圖6-A所示。共得到3個色譜主峰，分別對3個主峰的收集液進行抗腫瘤活性檢測，結果發現19～23 min的色譜峰為活性峰。對分子篩收集到的活性峰進行反相色譜分離，結果如圖6-B所示。7.6 min的色譜峰為活性峰，收集該活性峰的洗脫液，蒸發濃縮后用10 mL無菌水復溶，再用C18反相色譜柱進行重復上樣檢測，結果如圖6-C所示。僅獲得單一活性峰，峰度較高，峰型對稱，純度達90%。可見，利用上述液相色譜分離方法可有效獲得純度較高的單一抗腫瘤活性組分，將該單一組分命名為WIH3。

2. 6 WIH3活性組分的IC50測定結果

將WIH3活性組分配制成不同濃度梯度的溶液，用于檢測其對不同腫瘤細胞的抑制活性，結果如圖7所示。隨著WIH3活性組分濃度的增加，對B16、Hep-3B、Hela和MCF-7腫瘤細胞的抑制率均逐漸增大，說明該活性組分對這4種腫瘤細胞具有較強的抑制活性;當WIH3活性組分濃度相同情況下，隨著作用時間的增加，腫瘤細胞的抑制率也相應增大。

利用SPSS 13.0統計分析WIH3活性組分對不同腫瘤細胞作用48 h的IC50，結果發現該活性組分對腫瘤細胞B16、Hep-3B、Hela和MCF-7的IC50分別為29.322、37.387、47.029和58.009 μg/mL（表1），說明WIH3活性組分具有廣譜高效的抗腫瘤活性。

3 討論

對大型真菌的鑒定主要依據形態特征，包括子實體、菌絲和孢子的形態。本研究結果表明，從野外采摘的IH3菌株在子實體形態上與粗毛纖孔菌和桑黃相似，但大型真菌子實體形態易受生長環境和生長時期等客觀因素的影響，且形態性狀的判斷易受主觀因素的影響，因此，僅從子實體形態無法對其進行準確鑒定。利用分子生物學手段如ITS序列分析等對大型真菌進行鑒定，準確度和靈敏度更高，且能更簡便、快速、客觀地揭示其遺傳關系（Li et al.，2008;Alaei et al.，2009）。因此，本研究對IH3菌株進行ITS序列分析，結果發現其與粗毛纖孔菌（MF183947.1）的ITS序列相似度最高，為98%，結合該菌株的形態學特征，最終確定IH3菌株為粗毛纖孔菌（I. hispidus）。但該菌株在系統發育進化樹上形成獨立分支，且與親緣關系最近的菌株相似度僅為98%，推測IH3菌株是粗毛纖孔菌的新亞種。

由于粗毛纖孔菌的子實體形態和生長環境與藥用真菌桑黃類似，在新疆南部等地區將其作為桑黃入藥（崔寶凱等，2009;甄占萱等，2013）。目前，仍有大量學者對粗毛纖孔菌和桑黃的分類學地位產生爭議。崔寶凱等（2009）研究認為，粗毛纖孔菌不是桑黃，二者子實體存在差異，粗毛纖孔菌較明顯的特征表現為子實體表面有大量褐色粗毛。Wu等（2012）通過研究分析桑黃的子實體形態和ITS序列得出桑黃為一個新種的結論，并命名為Inonotus sanghuang。Zhou等（2015）研究發現，針層孔菌屬中與桑黃相關種不屬于同一類群，將相關種類組合成新的屬——桑黃孔菌屬（Sanghuangporus），且粗毛纖孔菌不屬于該屬。包海鷹等（2017）從生長環境、形態特征和藥用功效等方面對現代藥用真菌粗毛纖孔菌和桑黃進行比較，結果發現，古代中藥所指的“桑黃”不是單一的一個物種，而是包括來自針層孔菌屬（Phellinus）、纖層孔菌屬（Inonotus）和嗜藍孢孔菌屬（Fomitiporia）等菌種的木腐菌子實體。綜上所述，更多的學者認為粗毛纖孔菌不是桑黃。本研究也發現，桑黃孔菌屬、針層孔菌屬和纖層孔菌屬分屬于不同的三大類群，IH3菌株屬于纖層孔菌屬類群，而不屬于桑黃孔菌屬類群。

粗毛纖孔菌是一種珍貴的藥用真菌，其子實體富含多種活性成分，主要為多糖和三萜類等抗腫瘤活性物質，應用潛力巨大，但野生粗毛纖孔菌資源缺乏，且受季節限制。已有研究發現，通過液體發酵可得到大量粗毛纖孔菌菌絲，菌絲體也同樣含抗腫瘤活性物質（李德海等，2018;劉鑫等，2018b）。且從發酵液中分離胞外次級代謝產物具有重復性好、樣本量大等優點，是發現抗腫瘤新藥前導分子的重要手段。本研究從IH3菌株的發酵上清液中萃取獲得抗腫瘤活性成分后，利用Sephadex LH-20色譜柱對其進行分子篩色譜分離，發現活性峰出現時間較晚，說明活性成分分子量偏小，再用C18反相色譜柱將收集到的活性峰洗脫液進行反相色譜分離，即可得到純度較高的單一組分WIH3，具有廣譜高效的抗腫瘤活性。劉鑫等（2018a）從粗毛纖孔菌的發酵液粗提物中檢測到2種新物質，其中一種活性物質為鳥苷，具有抗乳腺癌活性，與本研究發現WIH3活性組分能抑制人乳腺癌細胞MCF-7的結論相似。因此，后續應對WIH3活性組分進行結構鑒定及抗腫瘤機制分析。

4 結論

IH3菌株被鑒定為粗毛纖孔菌，與已發表的粗毛纖孔菌菌株存在遺傳差異，可能為粗毛纖孔菌的新亞種，其發酵上清液具有廣譜的抗腫瘤活性。

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（責任編輯 陳 燕）