利用分子標記輔助選擇改良閩恢3301稻瘟病抗性

田大剛 楊小雙 陳子強 陳在杰 林艷 王鋒

摘要：【目的】改良三系雜交秈稻強勢恢復系閩恢3301的稻瘟病抗性，以提高其在生產中的應用價值?！痉椒ā恳?5-1-127和C101A51為稻瘟病主效基因Pi9和Pi2的供體親本，以閩恢3301為受體親本，通過雜交、多代回交和自交，結合分子標記輔助選擇和田間選擇的方法，將供體親本的Pi9和Pi2基因導入閩恢3301中，改良其稻瘟病抗性。利用21個福建近年流行的稻瘟菌菌株及其混合菌液對閩恢3301改良系進行人工接種抗性鑒定，并連續兩年在上杭茶地病圃進行田間自然誘發抗性鑒定。將閩恢3301改良系和閩恢3301分別與三系不育系薈豐A和廣8A及兩系不育系GRD-7S進行測配，考察其農藝性狀，以閩恢3301為父本的雜交組合為對照?！窘Y果】通過利用Pi2/9分子標記對抗病基因進行跟蹤選擇，最終獲得含Pi9和Pi2的閩恢3301改良系（閩恢3301-Pi9和閩恢3301-Pi2）各20份。除閩恢3301-Pi9對SH17004菌株表現為中感外，閩恢3301-Pi9對其他20個稻瘟病菌株及于2016和2017年在田間自然誘發鑒定中均表現出抗病，且閩恢3301-Pi2對21個稻瘟病菌株及于2016和2017年在田間自然誘發鑒定中均表現出抗病或高抗，二者抗性達到甚至超過兩供體親本75-1-127和C101A51的抗性水平，但閩恢3301對7個稻瘟病菌株表現感病，對1個菌株表現中感，對其他菌株則表現中抗或抗病，且田間自然誘發鑒定中均表現高感，說明閩恢3301-Pi9和閩恢3301-Pi2抗性水平得到有效提高。除RGD-7S×閩恢3301-Pi9和RGD-7S×閩恢3301-Pi2組合的單株產量分別極顯著（P<0.01）高于相應的對照組合外，其他以閩恢3301改良株系為父本的雜交組合在株高、穗長、分蘗數、千粒重、單株產量和結實率上無顯著差異（P>0.05），表明閩恢3301-Pi2和閩恢3301-Pi9在培育稻瘟病抗性雜交水稻組合上具有廣闊的應用前景?！窘Y論】閩恢3301-Pi9和閩恢3301-Pi2抗性得到有效提高的同時在農藝性狀和配合力等方面保持了閩恢3301及其組合的主要特性，說明利用Pi9和Pi2基因可有效改良閩恢3301的稻瘟病抗性，不僅拓寬了稻瘟病抗譜，還不影響閩恢3301的配合力，二者可作為新的水稻材料進行推廣應用。

關鍵詞： 閩恢3301;稻瘟病;抗性;分子標記輔助選擇;Pi9;Pi2;農藝性狀

中圖分類號： S511.203.51? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）08-1665-06

Improving resistance of Minhui 3301 to rice blast

by molecular marker-assisted selection

TIAN Da-gang1， YANG Xiao-shuang1，2， CHEN Zi-qiang1， CHEN Zai-jie1，

LIN Yan， WANG Feng 1*

（1Biotechnology Research Institute， Fujian Academy of Agricultural Sciences/Fujian Key Laboratory of Genetic Engineering for Agriculture， Fuzhou? 350003， China; 2College of Plant Protection， Fujian Agriculture

and Forestry University， Fuzhou? 350002， China）

Abstract：【Objective】This study aimed to improve the blast resistance of the hybrid indica rice strong restorer line，Minhui 3301，and increase its application value in production. 【Method】75-1-127 and C101A51 were donor parents for rice blast major genes Pi9 and Pi2， and Minhui 3301 was as receptor parent. The genes Pi9 and Pi2 from donor lines 75-1-127 and C101A51 were respectively introduced into Minhui 3301 to improve its resistance to blast by crossbreeding， backcrossing， self-breeding assisted by molecular marker and field selection method. The artificial inoculation resistance assay was conducted using 21 rice blast strains epidemic in Fujian in recent years and their mixed strain liquid on Minhui 3301 improved line， and naturally induction resistance in field was also investigated in diseased fields in Chadi， Shanghang for two consecutive years. Minhui 3301 improved line and Minhui 3301 were crossed with two three-line sterile lines （Huifeng A and Guang 8A） and a two-line sterile line（GRD-7S） respectively to investigate the main agronomic traits. The hybrid combinations with Minhui 3301 as male parent were as control. 【Result】In the present study，with Pi2/9 molecular marker trace selection for disease resistance genes， 20 improved lines harboring Pi9 and 20 improved lines harboring Pi2 were respectively generated by marker-assisted selection，named Minhui 3301-Pi9 and Minhui 3301-Pi2. Apart from Minhui 3301-Pi9 presented moderate susceptibility to SH17004 strain， it presented resistance to all the other 20 tested blast strains as well as the field natural induction identification in 2016 and 2017. Minhui 3301-Pi2 displayed resistant or highly resistant to 21 strains in the field natural induction identification in 2016 and 2017. The resistance of the two was even higher than the two donor parents 75-1-127 and C101A51.? However，Minhui 3301 were susceptible to seven strains and? moderately susceptible to one strain，and were moderately resistant or resistant to other strains and were highly susceptible to natural induction identitfcation in field. It indicated that Minhui 3301-Pi2 and Minhui 3301-Pi9 improved resistance to blast. Investigation of agronomic characteristics showed that there were no significant differences in plant height，panicle length，tiller number， weight of 1000-grain， yield per plant and seed setting rate in various hybrid combinations（P>0.05）， except for yield per plant of GD-7S×Minhui 3301-Pi2 and RGD-7S×Minhui 3301-Pi9 were extremely higher than the corresponding control combinations（P<0.01）， indicating Minhui 3301-Pi2 and Minhui 3301-Pi9 had broad prospect in breeding hybrid rice combination with rice blast resistance. 【Conclusion】Minhui 3301-Pi9 and Minhui 3301-Pi2 obtained in the present study have similar characteristics as Minhui 3301 and its combinations in agronomic traits and combining ability，but confer higher level and broader-spectrum resistance against blast. It indicates that Pi9 and Pi2 genes can improve the blast resistance of Minhui 3301. They broaden the resistant spectrum of rice blast， and do not affect the combining ability of Minhui 3301， therefore the two can be promoted as new rice materials.

Key words： Minhui 3301; rice blast; resistance; molecular marker-assisted selection; Pi9; Pi2; agronomic traits

0 引言

【研究意義】稻瘟病是世界上對水稻危害最嚴重的真菌性病害，一般導致水稻減產10%～30%，嚴重時甚至造成絕收（Skamnioti and Gurr，2009;Helliwell et al.，2013）。近年來，隨著雜交稻親本的遺傳基礎變窄及栽培中氮肥的不合理施用，稻瘟病害呈逐年遞增趨勢，給水稻生產帶來了極大威脅（宋成艷等，2014），利用抗病基因改良品種抗性是水稻抗病防治最經濟、有效的方法（Ashkani et al.，2015，2016;Tanweer et al.，2015）。由于稻瘟病菌無毒效應因子的高度變異，使含單一抗性基因的品種在短時間內喪失抗性（Zhu et al.，2000）。因此，改良現有水稻品種對稻瘟病的抗性，對水稻生產具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】前人研究發現，抗稻瘟病基因Pi9和Pi2是位于水稻第6號染色體短臂Pi2/9基因座上的廣譜抗性基因（Zhou et al.，2006;Deng et al.，2017），其中，Pi9基因來自于小粒野生稻（Oryza minuta），對13個國家的43個稻瘟病菌株均表現出高抗性（Liu et al.，2002a）;Pi2基因來自于Co39近等系，對從菲律賓不同地區和我國13個水稻主產區收集的792個稻瘟病菌株均表現出較高的抗性（Liu et al.，2002b）。因此，Pi2和Pi9基因用于改良品種抗性方面具有良好的應用前景。如陳志偉等（2004）將Pi2基因導入珍汕97B后獲得的改良品系對稻瘟病抗性顯著提高;倪大虎等（2005）、陳建民等（2009）分別將Pi9基因導入水稻恢復系M12和閩恢3139后也獲得了稻瘟病抗性顯著提高的改良品系。此外，還有部分學者利用分子標記輔助選擇將Pi2或Pi9基因與其他抗病基因同時聚合到一個品種中，極大提高了水稻品種對稻瘟病的抗性及持久性（陳紅旗等，2008;柳武革等，2008;Luo and Yin，2013;田大剛等，2014）。但Tian等（2016）利用Pi2和Pi9基因的功能標記分析我國434份水稻種質及育種材料，發現這兩個抗病基因并未在我國種植品種中大規模應用，表明二者對改良水稻抗性具有較大的應用潛力?！颈狙芯壳腥朦c】閩恢3301是福建省農業科學院生物技術研究所育成的三系雜交秈稻強勢恢復系，以其配制的20個優勢組合如天優3301、II優3301、谷優3301和花2優3301等均通過了國家或省級審定，但近年來閩恢3301的稻瘟病抗性呈逐年下降趨勢。經本課題組前期研究發現，閩恢3301不含有Pi2和Pi9基因（Tian et al.，2016），利用這兩個廣譜高抗的基因改良閩恢3301的稻瘟病抗性具有較大的生產應用價值，但目前未見相關研究報道?！緮M解決的關鍵問題】以75-1-127和C101A51為稻瘟病主效基因Pi9和Pi2的供體親本，以閩恢3301為受體親本，通過雜交、多代回交和自交，結合分子標記輔助選擇和田間選擇的方法，將供體親本的Pi9和Pi2基因導入閩恢3301中，改良其稻瘟病抗性，采用人工接種法和田間自然誘發法對改良的閩恢330進行稻瘟病抗病性評價，篩選出對稻瘟病具有廣譜抗性的改良株系，并分別與3個不育系配制雜交組合，考察各組合的相關農藝性狀，最終篩選出具有閩恢3301遺傳背景且可用于水稻生產的優良株系，為利用分子標記輔助選擇改良現有水稻品種的稻瘟病抗性提供理論依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試水稻品種為Pi9基因供體親本75-1-127、Pi2基因供體親本C101A51和受體親本閩恢3301，其中，75-1-127的抗性基因Pi9來源于野生稻（O. minuta），C101A51的抗性基因Pi2來源于Co39近等系。以上材料均由福建省農業科學院生物技術研究所提供。三氯甲烷（分析純）、異戊醇（分析純）、75%（v/v）乙醇溶液和10 g/L瓊脂糖溶液等均由福建省農業科學院生物技術研究所提供，雙組分簡單型PCR反應系統購自天根生化科技（北京）有限公司。主要儀器設備：PCR擴增儀（美國Bio-Rad公司）、凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司）和電泳儀（美國Bio-Rad公司）等。

1. 2 Pi2/9分子標記檢測

用于檢測Pi2/9分子標記的引物為Pi2/9-F：5'-T TTGTTACTAGAATCGCTCCAT-3'和Pi2/9-R：5'-GA TTAGTGAGATCCATTGTTCC-3'（Tian et al.，2019）。所有引物均由福州鉑尚生物有限公司合成。PCR反應體系和擴增程序參照Qu等（2006）、鄭家團等（2009）的方法。

1. 3 構建分子標記輔助選擇群體

于2013年4月在海南省三亞市藤橋育種基地分別以75-1-127和C101A51為供體親本，閩恢3301為受體親本雜交獲得F1代雜交種。利用Pi2/9分子標記從中篩選出含抗病基因的單株，并與受體親本閩恢3301連續多代回交獲得BC5F1種子。2015年冬季于海南省三亞市藤橋育種基地種植BC5F1，選擇基因型純合且農藝性狀和稻瘟病抗性與受體親本一致的株系，自交兩次，獲得BC5F3株系（圖1）。

1. 4 抗性鑒定

人工接種鑒定：于2016年從福建稻瘟病發病嚴重區（上杭縣茶地鄉、南靖縣、廈門市、德化縣、清流縣、將樂縣、寧化縣、寧德市、武夷山和建陽市）分離獲得21個稻瘟病菌株。于水稻苗期采用人工噴霧的方法接種21個稻瘟病菌株及其混合菌株。稻瘟病菌株的培養、產孢、接種及抗性調查等均參考Tian等（2019）的方法。

田間自然誘發鑒定：于2016─2017年在福建上杭茶地病圃進行田間抗性鑒定，分別于分苗期、分蘗盛期和抽穗結實期3個時期進行，種植期間通過重施氮肥，增加田間濕度創造發病條件。采用GB/T 15790—2009國家標準進行調查和分級，得出綜合抗性水平，最終篩選出抗稻瘟病的改良株系。

1. 5 農藝性狀考察

以三系不育系薈豐A、廣8A和兩系不育系RGD-7S作母本，分別與閩恢3301改良株系和閩恢3301配制雜交組合，以閩恢3301為父本的雜交組合為對照。該試驗在福州壽山育種基地進行。按水稻正常種植季節播種插秧，株行距21 cm×21 cm，每小區種植100株，設3次重復。正常防治病蟲害，常規水肥管理。考種時取每小區中間地段整齊一致的5個單株，測量自然不發病條件下各雜交組合的株高及考察穗數、穗長、分蘗數、結實率、千粒重和單株產量等農藝性狀。

1. 6 統計分析

采用SPSS 19.0對農藝性狀數據進行統計分析。

2 結果與分析

2. 1 Pi2/9標記在供受體間的多態性分析及基因純合株系篩選結果

利用Pi2/9-F和Pi2/9-R引物對75-1-127、C101A51和閩恢3301進行多態性分析，結果顯示，從75-1-127、C101A51和閩恢3301擴增的片段大小為164、147和174 bp（圖2-A和圖2-B），表明Pi2/9標記在供受體親本間具有明顯的多態性，可應用于相應抗性基因的輔助篩選。在連續多代回交、自交過程中，利用該標記對抗病基因進行跟蹤選擇，最終獲得含Pi9和Pi2基因的純合BC5F3代株系各20份，分別將其命名為含Pi9閩恢3301改良系（閩恢3301-Pi9）和含Pi2閩恢3301改良系（閩恢3301-Pi2）（圖2-A和圖2-B）。

2. 2 閩恢3301改良系的稻瘟病抗性鑒定結果

由表1可知，人工接種后，75-1-127和C101A51對21個稻瘟病菌株及其混合菌株均表現為抗病，但二者于2016和2017年在福建上杭茶地病圃的田間自然誘發鑒定中抗性表現略有不同，其中，75-1-127在2016和2017年分別表現為抗病和中抗，而C101A51均表現為中抗，二者綜合抗性水平均為抗病，表明Pi9和Pi2基因可用于上杭地區的稻瘟病抗性改良。

由表1還可知，閩恢3301對7個稻瘟病菌株（SM17211、SH17004、NH13093、NH17267、SM17192、NH15039和SM17191）表現感病，對NH17026菌株表現中感，對其他菌株則表現中抗或抗病，但閩恢3301于2016和2017年連續兩年的田間自然誘發鑒定中均表現高感;除閩恢3301-Pi9對SH17004表現為中感外，閩恢3301-Pi9對其他稻瘟病菌株及于2016和2017年在田間自然誘發鑒定中均表現抗病，且閩恢3301-Pi2對21個稻瘟病菌株及于2016和2017年在田間自然誘發鑒定中均表現抗病或高抗?？梢?，與閩恢3301相比，閩恢3301-Pi9和閩恢3301-Pi2抗性得到有效提高，其抗性達到甚至超過供體親本75-1-127和C101A51的抗性水平。通過比較閩恢3301-Pi9和閩恢3301-Pi2抗性發現，雖然Pi9和Pi2基因均能明顯提高閩恢3301的抗性水平，但Pi2基因的提高效果更明顯。

2. 3 閩恢3301改良系與不育系所配雜交組合的農藝性狀表現

用三系不育系薈豐A、廣8A和兩系不育系RGD-7S作母本，分別與閩恢3301-Pi2、閩恢3301-Pi9和閩恢3301配制9個雜交組合，測定自然不發病條件下各組合的株高、穗長、分蘗數、千粒重、單株產量和結實率等農藝性狀，結果如表2所示。除RGD-7S×閩恢3301-Pi9和RGD-7S×閩恢3301-Pi2組合的單株產量分別極顯著（P<0.01）高于相應的對照組合（CK3）外，其他以閩恢3301改良系為父本的雜交組合在株高、穗長、分蘗數、千粒重、單株產量和結實率上與相應的對照組合（CK1和CK2）均無顯著差異（P>0.05），說明稻瘟病抗性改良并未影響閩恢3301的配合力，閩恢3301-Pi2和閩恢3301-Pi9在培育稻瘟病抗性雜交水稻上具有廣闊的應用前景。

3 討論

Pi2/9基因座上的Pi2和Pi9基因是我國東北各地區抗性最好、抗譜最廣的抗源基因（王倩等，2011），但目前這兩個基因尚未在生產中廣泛應用，具有很好的應用前景（Tian et al.，2016）。本研究利用稻瘟病菌株抗性較好的Pi2和Pi9供體親本C101A51和75-1-127對閩恢3301進行抗性改良，獲得了這兩種抗性基因的改良系，即閩恢3301-Pi9和閩恢3301-Pi2，二者對稻瘟病菌株抗性水平得到有效提高，其抗性達到甚至超過供體親本75-1-127和C101A51的抗性水平。此外，本研究以這兩種抗性基因改良系為父本，分別與三系不育系薈豐A、廣8A和兩系不育系RGD-7S雜交，結果發現，除RGD-7S×閩恢3301-Pi9和RGD-7S×閩恢3301-Pi2組合的單株產量分別極顯著高于相應的對照組合（CK3）外，其余以閩恢3301改良系父本的雜交組合的株高、穗長、分蘗數、千粒重、單株產量和結實率與以閩恢3301為父本的對照雜交組合間無顯著差異，說明稻瘟病抗性改良并未影響閩恢3301的配合力。因此，這兩份改良系可在實際生產中混合使用以提高改良系的生產應用范圍。前人研究也發現，通過混合種植攜帶不同抗性基因的近等系可對稻瘟病產生高抗效果（Zhu et al.，2000;Abe，2004;Thakur et al.，2013），其原因在于利用不同品種在抗病性上的異質性或多樣化以減弱單一品種對病原物小種群體的選擇壓力，有利于品種與菌群間形成平衡，以限制病原菌暴發（Tack et al.，2012），進一步明確了抗性基因型不同的品種與病原菌互作可產生抗性反應（Gallet et al.，2014）。

分子標記輔助育種應考慮目的基因和遺傳背景的分子標記檢測（Hittalmani et al.，2000;Gouda et al.，2013）。本研究在抗病基因回交轉移時，通過Pi2/9標記檢測結合對回交后代農藝性狀的比較選擇，在農藝性狀與受體親本一致時再自交2次，得到目的基因和遺傳背景純合的株系，結果表明本研究的試驗方案具有很好的可行性，且本研究供受體親本間均為秈型常規品種，遺傳距離相對較小，經過5 次定向回交后和兩次自交獲得的純合株系，其農藝性狀已與輪回親本基本一致。此外，雖然本研究證實稻瘟病抗性改良未影響閩恢3301的配合力，但是否影響其他重要病蟲害抗性，尚有待研究。因此，在今后進行抗稻瘟病品種選育時，還應兼顧重要病蟲害抗性及稻米品質，注重分子標記選擇與常規育種手段的結合，力爭使抗性、產量與品質達到同步改良。

4 結論

閩恢3301-Pi9和閩恢3301-Pi2抗性得到有效提高的同時在農藝性狀和配合力等方面保持了閩恢3301及其組合的主要特性，說明利用Pi9和Pi2基因可有效改良閩恢3301的稻瘟病抗性，不僅拓寬了稻瘟病抗譜，還不影響閩恢3301的配合力，二者可作為新的水稻材料進行推廣應用。

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（責任編輯 陳 燕）