“鉤藤石菖蒲”藥對對TS模型大鼠神經遞質及行為活動的影響

張雪榮 鄧麗華 陳格格

摘要 目的：探討“鉤藤-石菖蒲”藥對對TS模型大鼠神經遞質及行為活動的影響。方法：將雄性SD大鼠32只隨機分為正常組、模型組、實驗組、泰必利組，每組8只。造模的同時開始灌胃給藥，正常組與模型組給予蒸餾水，其余各組給予相應藥物，1次/d，連續給藥4周。觀察各組大鼠神經遞質含量變化情況及各組大鼠在造模第7天及灌胃第14天、21天、28天刻板行為、運動行為、自主活動次數的情況，并分別進行評分。結果：與正常組比較，模型組多巴胺、多巴胺D2受體均無明顯變化（P>0.05）;與模型組比較，泰必利組、實驗組多巴胺、多巴胺D2受體含量均有下降（P<0.05）;實驗組、泰必利組二組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。通過對各組TS大鼠刻板行為評分比較，實驗組在治療21天以后，大鼠刻板行為減少優于泰必利組及模型組（P<0.05）;通過對各組TS大鼠運動行為的評分比較，泰必利組與實驗組比較，差異無統計學意義（P>0.05）;實驗組、泰必利組大鼠的活動次數較模型組均減少，二者均有治療效果。結論：“鉤藤-石菖蒲”藥對具有抑制多巴胺受體超敏感、促進多巴胺代謝的作用，從而抑制TS大鼠的刻板行為，減少TS大鼠的活動次數。

關鍵詞 “鉤藤-石菖蒲”藥對;TS模型大鼠;神經遞質;行為活動

Abstract Objective：To investigate the effects of drug pair of “Ramulus Uncariae Cum Uncis and Rhizoma Acori Tatarinowii” on neurotransmitters and behavioral activities in TS rats.Methods：A total of 32 male SD rats were randomly divided into a normal group，a model group，an experimental group and a tabilium group，with 8 rats in each group.Intragastric administration of drugs was given when model establishing.At the same time，the normal group and the model group were given distilled water，and the other groups were given corresponding drugs，once per day，for 4 weeks.The changes of neurotransmitter content in each group of rats were observed，and the stereotyped behaviors，motor behaviors and autonomous activity times of each group of rats were evaluated on the 7th day of modeling and the 14th，21st and 28th day of instillation.Results：Compared with the normal group，there were no significant changes in dopamine and D2 receptors in the model group（P>0.05）.Compared with the model group，the levels of dopamine and dopamine D2 receptor in the tabilium group，the experimental group all decreased（P<0.05）.There was no significant difference between the experimental group and the tabilie group（P>0.05）.By comparing the scores of stereotyped behaviors of TS rats in each group，after 21 days of treatment，the reduction of stereotyped behaviors of the experimental group was better than that of the tabilie group and the model group（P<0.05）.By comparing the scores of exercise behaviors of TS rats in each group，there was no statistical significance between the tabilium group and the experimental group（P>0.05）.The activity frequency of rats in the experimental group and the tabilium group decreased compared with the model group，and both of them had therapeutic effect.Conclusion：Drug pair of “Ramulus Uncariae Cum Uncis and Rhizoma Acori Tatarinowii” can inhibit the hypersensitivity of dopamine receptor and promote the metabolism of dopamine，thus inhibiting the stereotypical behavior of TS rats and reducing the activity frequency of TS rats.

Key Words drug pair of “Ramulus Uncariae Cum Uncis and Rhizoma Acori Tatarinowii”; TS model rats; Neurotransmitters; Activities

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.08.020

多發性抽動癥（Tourette Syndrome，TS）是一種慢性神經精神疾病，其患病率在1%～4%之間，且有逐年增高的趨勢[1]。至今為止，西醫對此病尚無根治方法，目前以氟哌定醇、泰必利為代表的多巴胺受體阻滯劑是公認有效治療藥物，但不良反應明顯，如錐體外系反應、認知遲鈍等。而中醫學認為“肝常有余”是小兒重要的生理病理機制，情志不舒，肝氣郁結，日久化火，火極生風，風陽鼓動，則肝風挾痰循經而上，出現面部肌肉、四肢的抽動及怪聲連連等癥狀。小兒又“脾常不足”，運化維艱，肝氣旺盛常易乘脾犯胃，則脾胃愈虧，脾虛木亢，則肝風內動愈甚。且怪病多責之于痰，風與痰關系密切，既可因風而生痰，亦可因痰而生風，風痰合邪橫串經絡，可使氣阻竅閉而發病。故“脾虛肝旺、痰熱動風”為本病的基本病機。本研究為了探討“鉤藤-石菖蒲”藥對對TS模型大鼠神經遞質及行為活動的影響，進行了如下研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SD大鼠32只，3周齡，清潔級，體質量在（20±2）g，雄性。

1.1.2 藥物 受試藥物：鉤藤、石菖蒲（飲片），由江陰天江藥業有限公司提供。陽性藥物：泰必利，由山東健康藥業有限公司提供。造模藥物：亞氨基二丙腈（IDPN，90%），為上海至鑫化工有限公司提供。

1.1.3 試劑及儀器 臺式冰凍離心機（美國BECKMAN公司GS-15R型），Thermo超低溫冰箱（美國REVCO公司），移液器（加樣器）（德國Eppendorf），電子天平（FA.1104型，上海天平儀器廠），恒冷冰凍切片機（德國Leica-CM1900），Real-timePCR擴增儀（7500型，美國AppliedBiosystems公司產品）、紫外分光光度計（752.C型，上海產）、恒溫水浴箱（江蘇太倉醫用儀器廠，DSHZ-300型）等。30%三氯乙酸、生理鹽水、PVDF膜、、焦碳酸二乙酯、0ligo（dT）15、DNTPs（10 mM）、乙醇、M-MLV 5×Buffer、10×Buffer、M-MLV RT、DNA Taq polymerase、cDNA、TRIzol試劑、RT-PCR試劑盒等。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備

應用IDPN造模，將IDPN溶于0.9%生理鹽水中，使其終濃度為22 mg/mL，每只大鼠腹腔注射IDPN 330 mg/（kg·d），連續注射7 d。對照組腹腔注射等量生理鹽水7 d。

1.2.2 給藥方法

將實驗大鼠隨機分組，每組大鼠8只。正常組：腹腔注射生理鹽水15 mL/（kg·d），共注射7 d，自注射當日起蒸餾水按20 mL/（kg·d）連續灌胃4周;模型組、泰必利組、實驗組均予IDPN 330 mg/（kg·d），配置成15 mL/（kg·d）的劑量，連續腹腔注射7 d;自注射當日起泰必利組予含泰必利30 mg/（kg·d）的溶液，按20 mL/（kg·d）連續灌胃4周。實驗組自造模當日起予含生藥10%的“鉤藤-石菖蒲”藥對溶液，按20 mL/（kg·d）連續灌胃4周。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 神經遞質含量的測定

灌胃結束的第2天斷頭處死各組大鼠（處死前24 h禁食不禁水），在冰盒上快速剝離大鼠腦黑質-紋狀體，將其一部分放到玻璃勻漿器中，快速勻漿，吸取勻漿液，離心后，取上清液待測，另一部分放入冰箱中冷凍。采用酶聯免疫吸附測定法檢測實驗28 h后大鼠腦組織多巴胺系統神經遞質DA、DRD2的含量。

1.2.3.2 模型動物行為學觀察

由不明確實驗分組的實驗人員參與TS大鼠行為活動評分，分別觀察實驗動物大鼠在造模第7天及灌胃第14天、21天、28天刻板行為、運動行為、自主活動次數的情況，并分別進行評分。1）刻板行為測試：將大鼠放入一較大的觀察籠內，大鼠適應5 min后，參照杜淑娟等[2]動物模型中對刻板行為的評分方法，在每周灌胃后1 h，進行雙盲觀察1 h，5 min記錄1次，并記錄總分。評分標準及方法：0分：無刻板行為;1分：旋轉行為;2分：頭和頸部的上下運動過多;3分：頭、頸部的上下運動過多加旋轉行為;4分：頭向側擺合并頭和頸部的上下運動過多。2）運動行為評分：刻板行為評分結束后，立即將大鼠放入一較大的觀察籠內，大鼠適應后，以抽動癥動物模型中對運動行為的評分方法，進行雙盲觀察1 h，記錄5 min/次，并記錄總分。評分標準及方法：0分：安靜或正常活動;1分：能過度興奮;2分：探究行為增加;3分：跑;4分：跑和跳。3）自主活動次數測定：參照Wei[3]等報道的方法，運動行為評分結束后立即應用大鼠自主活動程序儀進行大鼠自發活動計數，當計算機進入測定程序后，將大鼠放入活動箱中（高13 cm，直徑25 cm），由計算機自動記錄大鼠活動情況，測定每只大鼠5 min內的活動次數。

1.3 統計學方法 采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析，其中計數資料以（%）表示，采用χ2檢驗，計量資料以（±s）表示，采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

3 討論

小兒多發性抽動癥屬于中醫學中“瘛疭”“慢驚風”“肝風證”等范疇。臨床多表現為眨眼、擠眉、皺鼻、搖頭、咧嘴等。中醫學認為小兒“肝常有余”“脾常不足”“腎常虛”的生理特點是發為本病的病機所在。其病因可責之先天稟賦不足，產傷，外傷等多種因素。小兒稚陰稚陽之體，腎常虛，腎虛則肝木無制，陰虛則筋脈失養[4]。小兒情志不舒，肝氣郁結，日久化火，火極生風，風陽鼓動，則肝風挾痰循經而上，出現面部肌肉、四肢的抽動及怪聲連連等癥狀。小兒“脾常不足”，運化維艱，肝氣旺盛常易乘脾犯胃，則脾胃愈虧，脾虛木亢，則肝風內動愈甚。加之“怪病多為痰作祟”，故本病的病機為“脾虛肝旺、痰熱動風”，病變臟腑在于肝脾，涉及胃，病理產物責之于風痰。

TS發現至今已有200多年的歷史，其病因及發病機制目前尚不十分清楚，但普遍認為其發病與遺傳因素、中樞神經遞質失衡、神經生化異常和精神因素等諸多方面有關[5]。但TS患者紋狀體內多巴胺神經過度支配或突觸后受體超敏感是目前公認的TS發病的神經生物化學因素[6]。多巴胺（DA）是中樞神經系統中重要的神經遞質，占所有腦內兒茶酚胺類神經遞質總含量的80%。學者多認為本病存在與基底節紋狀體的DA神經元活動過度及突觸DA受體超敏感相關，TS患兒紋狀體內DA能系統存有活動過度現象。多巴胺受體DRD2被認為與TS間存在密切關聯。有實驗顯示，IDPN誘導的模型鼠的DRD2mRNA表達較正常小鼠明顯升高[7]。本實驗研究結果顯示在造模后模型組、實驗組、泰必利組大鼠腦組織中DA、多巴胺受體DRD2的含量均升高，提示TS大鼠DA能系統存在過度活化的現象，符合理論研究。實驗研究的目的在于通過藥物干預使DA缺乏，從而DRD2由腦內最重要的興奮性神經遞質谷氨酸激活，通過間接通路，對丘腦-皮質投射產生抑制作用，從而降低運動興奮性，從而較少改善刻板運動。

本實驗研究結果顯示在對TS模型大鼠進行中藥（“鉤藤-石菖蒲”）及西藥（泰必利）干預后，實驗組及泰必利組DA、多巴胺受體DRD2的含量較模型組均下降（P<0.05），說明“鉤藤-石菖蒲”藥對與泰必利均可降低DRD2mRNA表達及抑制DA的過度活化;將實驗組和泰必利組DA、多巴胺受體DRD2的含量進行比較，2者差異無統計學意義（p>0.05），說明“鉤藤-石菖蒲”藥對及泰必利二者在療效上無明顯優劣之分。

通過對各組TS大鼠刻板行為的評分比較，在治療后實驗組、泰必利組TS大鼠的刻板行為較模型組均減少，說明二者均有治療效果，但對實驗組及泰必利組TS大鼠刻板行為的評分進行比較，實驗組在治療21 d以后，大鼠刻板行為較泰必利組減少，說明中藥組在優于泰必利組及模型組（P<0.05）。通過對各組TS大鼠運動行為的評分比較，泰必利組在治療14 d后運動行為減少，而在治療28 d后運動行為再次增多;而實驗組在治療21 d后運動行為持續減少，說明二者在起效時效上泰必利組優于實驗組，而在藥效維持時間上實驗組優于泰必利組。通過對各組TS大鼠活動次數的比較，模型組在治療各階段無明顯變化，實驗組大鼠活動次數呈逐漸下降趨勢，而在治療21 d后活動次數呈現明顯下降趨勢，泰必利組大鼠活動次數呈現時少時多的波動趨勢，在治療第7～14天，活動次數較實驗組明顯減少，而在治療14 d后又呈現活動次數增多的趨勢，且在治療21 d后活動次數高于實驗組，這也再次證明了泰必利治療TS大鼠起效快，但藥效維持時間弱于實驗組。但總體而言實驗組、泰必利組大鼠的活動次數較模型組均減少，說明二者均有治療效果。

綜上所述“鉤藤-石菖蒲”藥對具有抑制多巴胺受體超敏感、促進多巴胺代謝的作用，從而改善TS大鼠的刻板行為及減少其活動次數。

鉤藤可清熱平肝，熄風止痙，為治療驚風之良藥。鉤藤中主要有效成分生物堿，對中樞神經系統的藥理作用主要表現為鎮靜、抗癲癇、抗驚厥和對神經元的保護等[8]。有研究發現石菖蒲可有效清除自由基、阻止過氧化物形成，發揮神經及腦細胞保護的作用[9]。鉤藤、石菖蒲在臨床上治療多發性抽動癥應用廣泛，我們分析了萬方數據庫近20年關于中醫藥治療小兒多發性抽動癥的文獻，并對其進行了分析，結果顯示鉤藤的使用頻次為376次，占用藥總數的74.3%，位居第1位;石菖蒲的使用頻次為219次，占用藥總數的43.3%，位居第6位[10]。本實驗研究也證實了鉤藤、石菖蒲具有抑制多巴胺受體超敏感、促進多巴胺代謝的作用，從而降低運動興奮性，改善TS大鼠的刻板運動，減少活動次數，為臨床運用提供依據。

參考文獻

[1]隆紅艷.小兒多發性抽動癥多巴胺系統的分子機制及靜安口服液作用機理研究[D].南京：南京中醫藥大學，2012.

[2]杜淑娟，彭貝如，程樹軍，等.抽動-穢語綜合征動物模型的建立和評價[J].中國比較醫學雜志，2010，20（3）：23-25.

[3]Haifeng Wei，Lin Li，Qiujie Song，et al.Behavioral study of the D2 galactose induced aging model in C57BL/6J mice.Behav BrainRes，2005，157：245-251.

[4]朱先康，韓新民，王敏華.定抽顆粒治療小兒多發性抽動癥的臨床及實驗研究[J].中華中醫藥雜志，2011，26（2）：399-401.

[5]劉智勝.小兒多發性抽動癥[M].北京：人民衛生出版社，2002：32-74.

[6]Xiong S，She H，Zhang AS，et al.Hepatic macrophage iron aggravates experimental alcoholic steatohepatitis[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2008，29（5）：512-521.

[7]劉曉芳，王素梅，衛利，等.健脾止動湯對多發性抽動綜合征模型鼠紋狀體多巴胺D2受體mRNA的影響[J].中華行為醫學與腦科學雜志，2013，22（4）：296-298.

[8]黃華，丁伯平.鉤藤生物堿對中樞神經系統的藥理作用研究進展[J].現代藥物與臨床，2013，28（5）：807-808.

[9]Cho J，Kim YH，Kong JY，eta1.Protection of cultured reactortrial neurons from excitotoxi city by asarone，a major essential oil component in the rhizomes of Acorns gramineus[J].Life Sic，2002，71（5）：591-599.

[10]鄧麗華，陳格格，張雪榮.中醫藥治療小兒多發性抽動癥方藥文獻分析[J].中醫藥臨床雜志，2017，29（5）：663-664.

（2019-04-29收稿 責任編輯：徐穎）