五花茶配方優化對發熱模型大鼠的療效及其對肝腎的影響

甘柯林 李漢成 彭孝鵬

摘要 目的：觀察五花茶發熱模型鼠的退熱效應，進一步明確其退熱機制，同時研究其對肝腎功能的影響。方法：將50只SPF級SD大鼠納入研究，隨機分為空白組、模型組及五花茶組。其中模型組及五花茶組利用對干酵母制備發熱模型，隨后五花茶組大鼠接受高、中、低劑量灌胃[劑量分別為6.480、3.240、1.620 g/（kg·d）]，空白組及模型組接受等體積生理鹽水進行灌胃，各組均連續干預5 d，觀察各組大鼠成模后不同時間點大鼠體溫情況、干預前后大鼠肝腎功能的變化以及外周血清白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-1β、環氧化酶1（COX-1）表達水平變化。結果：1）經過造模后大鼠體溫明顯升高，與空白組比較，差異有統計學意義（P<0.05），且體溫呈現出雙峰熱型，分別在術后2 h和5 h時出現，在研究過程中部分造模大鼠出現明顯的精神萎靡、毛色暗沉，甚至出現寒戰癥狀，這提示本此造模成功。與模型組比較，五花茶組大鼠體溫明顯下降（P<0.05），且各五花茶干預組之間退熱效應差異無統計學意義（P>0.05）。2）與空白組比較，模型組與五花茶組ALT、AST、BUN、Cr差異無統計學意義（P>0.05），在五花茶干預組中，五花茶+黃芪組與五花茶+大棗組小腸推進率水平低于五花茶組，差異有統計學意義（P<0.05），五花茶+大棗+黃芪組小腸推進率低于其余2組患者，差異有統計學意義（P<0.05）。3）與空白組比較，模型組及五花茶組大鼠IL-6、TNF-α及IL-1β均明顯升高（P<0.05），其中五花茶組上述指標的改變較模型組明顯，其中五花茶+大棗+黃芪組改變幅度最大（P<0.05）。4）Western blotting實驗顯示：與空白組比較，模型組及五花茶組大鼠下丘腦組織COX-1明顯下降升高（P<0.05），其中五花茶組COX-1濃度有所上調，各組間COX-1的OD值差異無統計學意義（P>0.05）。結論：五花茶有明顯退熱效應，具有一定的劑量依賴性，且無肝腎毒性，臨床可推廣應用。

關鍵詞 發熱;大鼠模型;五花茶;配方優化;肝功能;腎功能;IL-6;TNF-α;IL-1β;COX-1

Abstract Objective：To observe the antipyretic effect of Wuhua tea fever model rats，to further clarify its antipyretic mechanism，and to study its effect on liver and kidney function.Methods：A total of 50 SPF SD rats were randomly divided into blank group，model group and tea group.The febrile model was made by dry yeast in the model group and the Wuhua tea group，and then the rats in the Wuhua tea group were given high，middle and low doses [6.480 g/（kg·d），3.240 g/（mol·d）and 1.620 g/（mol·d）]，respectively.The blank group and the model group received the same volume of normal saline for gavage.Each group was treated with continuous intervention for 5 days.The body temperature，liver and kidney function，peripheral serum interleukin-6（IL-6），tumor necrosis factor-α（TNF-α），IL-1 β，TNF-α，TNF-β，TNF-α，TNF-β in peripheral serum were observed.The expression level of cyclooxygenase 1（COX-1）changed.Results：1）After modeling，the body temperature of the rats was significantly higher than that of the blank group（P<0.05），and the body temperature showed bimodal heat type，which appeared at 2 h and 5 h after operation，respectively.In the course of the study，some of the rats showed obvious mental malaise，dark hair color，and even shivering symptoms，which indicated that the model was successful.Compared with the model group，the body temperature of rats in the Wuhua tea group decreased significantly（P<0.05），and there was no significant difference in antipyretic effect among the intervention groups（P>0.05）.2）Compared with the blank group，there was no significant difference in ALT，AST，BUN and Cr between the model group and the five-flower tea group（P>0.05）.In the five-flower tea dry preparation group，the intestinal propulsive rate in the five-flower tea+astragalus membranaceus group and the five-flower tea+jujube group was lower than that in the five-flower tea group.The difference was statistically significant（P<0.05）.The intestinal propulsive rate of Wuhua tea+jujube+astragalus membranaceus group was lower than that of the other two groups，the difference was statistically significant（P<0.05）.3）Compared with the blank group，IL-6，TNF-α and IL-1 β in the model group and the tea group were significantly increased（P<0.05），and the changes of the above indexes in the tea group were more obvious than those in the model group.The change range of Wuhua tea+jujube+astragalus membranaceus group was the largest（P<0.05）.4）Western blotting test showed that compared with the blank group，the COX-1 in the hypothalamus of the model group and the tea group decreased significantly（P<0.05），and the concentration of COX-1 in the group of the five flowers tea increased significantly（P<0.05），and the concentration of MDA in the hypothalamus of the model group and the tea group increased significantly（P<0.05）.There was no significant difference in OD value of COX-1 among the three groups（P>0.05）.Conclusion：Wuhua tea has obvious antipyretic effect in a dose-dependent manner and has no hepatorenal toxicity.it can be popularized and applied in clinic.

Key Words Fever;Rat model;Wuhua tea;Formula optimization;Liver function;Renal function;IL-6;TNF-α;IL-1 β;COX-1

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.08.016

發熱是夏季風熱感冒或流行性感冒的主要臨床表現，五花茶是廣東傳統藥茶，主要由金銀花、菊花、雞蛋花、木棉花、葛花、槐花、羅漢果組成，有清熱解毒、解暑宣肺的作用[1]。有清熱燥濕的苦寒類藥物多耗氣傷陰[2-3]，正如《血證論》云：“苦寒藥能大伐生氣”，我們在臨床中亦發現五花茶在清熱解暑的同時亦導致患者出現腸道或肝腎功能受損等毒性反應，且我們在前期篩選工作中發現五花茶中加入黃芪和大棗后即能保特原有作用又能減少苦寒性對腸胃、肝腎的影響，但其作用機制目前尚不明了。基于此我們以發熱模型鼠為研究對象，利用五花茶加黃芪、大棗藥液進行干預，以期觀察其對肝腎毒性是否減少？配方優化是否影響五花茶的退熱作用，具體報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 60只SPF級SD大鼠納入研究，所有動物均購自南方醫科大學[許可證號：SCXK（粵）2016-0041]。本研究最終符合實驗要求的大鼠50只納入研究，隨機分為空白組10只，造模組40只。體質量（220±10.5）g，鼠齡（5±0.5）個月。所有動物均飼養于肇慶醫學高等專科學校動物實驗中心，飼養條件：溫度（22.5±1.0）℃，濕度（53±0.5）%，以12/12 h為光暗周期。本研究方案經過肇慶醫學高等專科學校倫理委員會批準進行。

1.1.2 藥物 五花茶由本校中藥研究院提供，中藥組成：金銀花10 g、菊花10 g、雞蛋花10 g、木棉花10 g、葛花10 g、槐花10 g、羅漢果10 g;五花茶+黃芪組：基礎方+黃芪15 g;五花茶+大棗組：基礎方+大棗5枚。

1.1.3 試劑與儀器 BCA試劑盒（北京索寶生物科技有限公司，批號：28392739），干酵母懸液（合肥博美生物科技有限責任公司，批號：482732），IL-6試劑盒（上海廣銳生物科技有限公司;批號：10923），TNF-α試劑盒（上海廣銳生物科技有限公司，批號：11023），IL-1β試劑盒（購自上海廣銳生物科技有限公司，批號：17293），環氧化酶1一抗抗體（美國CST公司，批號：4841S），歐姆龍MC-347電子體溫計[歐姆龍自動化（中國）有限公司，貨號：PBA003149P]。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 按照參考文獻[4]中發熱模型制備方法，具體操作如下：造模前3 d對大鼠早中晚3個時間點基礎體溫進行測量，將單次體溫≥38 ℃且連續測量時體溫波動≥0.5 ℃的大鼠剔除。本研究最終符合實驗要求的大鼠有50只，隨機分為空白組10只，造模組40只。其中40只造模組大鼠背部皮下注射10%干酵母懸液（10 mL/kg）。注射后每1 h測量1次體溫，成模后（△T>0.8 ℃，約5 h）將大鼠隨機分為模型組及五花茶組，其中五花茶組分為高、中、低劑量組。空白組與造模組大鼠在體質量、鼠齡等資料比較，差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.2.2 干預方法 五花茶組大鼠隨機分為3組，分別是五花茶組、五花茶+黃芪組、五花茶+大棗組，按大鼠與人體間等效劑量換算將劑量組3.240 mL/（kg·d），灌胃1次/d，空白組及模型組大鼠接受等劑量的生理鹽水灌胃，各組均連續灌胃7 d。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 各組大鼠成模后不同時間點大鼠體溫情況 對各組大鼠進行灌胃，給藥后，每1 h測量體溫1次，連續測量6次，記錄體溫變化情況（△T=實測體溫-基礎體溫），同時觀察大鼠皮毛、精神狀態、飲水攝食、二便、體質量等變化。

1.2.3.2 各組大鼠肝腎功能的變化 干預后每組隨機選取5只大鼠，利用10%水合氯醛腹腔麻醉后取腹主動脈血，利用全自動生化分析儀對大鼠肝腎功能指標進行檢測，肝功能：丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST），腎功能：尿素（BUN）、肌酐（Cr）。

1.2.3.3 各組大鼠小腸推進率變化 干預后各組隨機選取3只大鼠，禁食12 h后用活性炭進行灌胃，隨后斷頭處死動物。剪取腸管計算小腸總長度，將幽門至活性炭前緣的長度作為腸管內推進距離，由此計算小腸推進率。

1.2.3.4 各組大鼠下丘腦環氧化酶1表達水平變化 干預結束后各組隨機抓取3只大鼠，利用10%水合氯醛腹腔麻醉后冰上快速取出下丘腦組織，按照200 mg∶1 mL裂解液的比例加入適量1%PMSF的蛋白裂解液，勻漿后室溫下靜置10 min后，用BCA試劑盒測定樣本總蛋白，根據結果得出上樣量后進行電泳跑膠，轉膜，加入環氧化酶1（COX-1）及β-actin一抗，比例均按照1∶1 000稀釋，再進行生物辣根過氧化酶HRP標記的二抗孵育，最后顯影、拍攝，用Image（BIO-RAD公司）的圖像處理軟件進行處理，測定各樣本灰度值。

1.2.3.5 各組大鼠外周血清IL-6、TNF-α、IL-1β濃度變化 收集1.2.3.2步驟中大鼠的腹主動脈血，4 ℃ 10 000 r/min下離心5 min，抽吸上清液，使用ELISA（酶聯免疫吸附試驗）對大鼠外周血清IL-6、TNF-α、IL-1β濃度進行檢測，具體過程如下：將樣本滴加如反應孔中，37 ℃孵育1 h，用PBS洗滌反應孔后每孔加入0.1 mL的酶標抗體，37 ℃孵育30 min，在用PBS洗滌，隨后在各反應孔中加入0.1 mL的TMB底物溶液，37 ℃孵育30 min，再加入2 mol/L硫酸0.05 mL中止反應。隨后將反應孔板置于酶標儀中讀取數據，波長設置492 nm。操作過程全部按照試劑盒說明書進行檢測。

1.3 統計學方法 采用SPSS 20.0對所得數據進行統計分析，計量數據如體溫、肝腎功能、COX-1、IL-6、TNF-α、IL-1β均采用均數±標準差（±s）描述，符合正態分布的采用t檢驗，不符合正態分布的采用秩和檢驗;以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠體溫變化情況比較 經過造模后大鼠體溫明顯升高，與空白組比較，差異有統計學意義（P<0.05），且體溫呈現出雙峰熱型，分別在術后2 h和5 h時出現，在研究過程中部分造模大鼠出現明顯的精神萎靡、毛色暗沉，甚至出現寒戰癥狀，這提示本此造模成功。與模型組比較，五花茶組大鼠體溫明顯下降（P<0.05），且各五花茶干預組之間退熱效應差異無統計學意義（P>0.05）。見表1、圖1。

2.2 各組肝腎功能及小腸推進率比較 與空白組比較，模型組與五花茶組ALT、AST、BUN、Cr差異無統計學意義（P>0.05），在五花茶干預組中，五花茶+黃芪組與五花茶+大棗組小腸推進率水平低于五花茶組，差異有統計學意義（P<0.05），五花茶+大棗+黃芪組小腸推進率低于其余2組小鼠，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

2.3 各組IL-6、TNF-α、IL-1β濃度比較 ELISA實驗顯示：與空白組比較，模型組及五花茶組大鼠IL-6、TNF-α及IL-1β均明顯升高（P<0.05），其中五花茶組上述指標的改變較模型組明顯，其中五花茶+大棗+黃芪組改變幅度最大（P<0.05）。見表3。

2.4 各組COX-1蛋白表達變化 Western blotting實驗顯示：與空白組比較，模型組及五花茶組大鼠下丘腦組織COX-1明顯下降升高（P<0.05），其中五花茶組COX-1濃度有所上調，各組間COX-1的OD值差異無統計學意義（P>0.05）。見表4、圖2。

3 討論

發熱是夏季風熱感冒及流行性感冒常見的臨床表征，多數與體內病變存在密切關注，換言之，發熱是疾病轉歸的重要信號，值得臨床重視。查閱大量文獻[5-7]顯示干酵母、LPS、2，4-二硝基酚等方法均可形成發熱模型，本研究選用干酵母作為致熱源進行發熱模型制備，結果顯示大鼠在短時間內出現了體溫急劇升高，短時間內體溫下降后又再次上升，故體溫波動趨勢形成2次熱峰，這顯示利用干酵母致發熱模型具有穩定性、易于操作的優點。在研究中我們發現接受干酵母制備發熱模型鼠機體IL-6、TNF-α及IL-1β水平出現明顯升高，這與國內外諸多文獻抑制，這進一步顯示本研究造模成功。IL-6、TNF-α及IL-1β均是與炎性反應密切相關的因子，上述因子釋放后刺激巨噬細胞介導機體的免疫調節環節，介導炎性反應效應，影響下丘腦體溫調節中樞，從而出現發熱[8-10]。本研究利用Western blotting檢測各組大鼠下丘腦的COX-1水平變化，結果顯示與空白組比較，模型組及五花茶組大鼠下丘腦組織COX-1明顯下降升高（P<0.05），其中五花茶組COX-1濃度有所上調，各組間COX-1的OD值差異無統計學意義（P>0.05）。COX屬于膜結合蛋白，是合成前列腺素和血栓素的關鍵蛋白，是花生四烯酸代謝途中的關鍵限速酶，廣泛參與機體免疫調節、炎性反應等過程。其中COX-1是COX重要的異構體，是COX家族重要的抗炎因子，其濃度降低意味著機體抗炎效應減弱，故而出現發熱[11-12]。本研究結果顯示五花茶對發熱模型鼠有明顯退熱效應，使用五花茶后大鼠外周血IL-6、TNF-α及IL-1β水平明顯下降，COX-1表達上調，這揭示五花茶退熱的主要機制與IL-6、TNF-α、IL-1β及COX-1有關。

我們認為外邪侵襲機體皮毛，借助孔道入里，營衛不和，正邪交織，故出現發熱、熱勢退而復發，治療應清熱解毒、解表宣肺。五花茶由金銀花、菊花、雞蛋花、木棉花、葛花、槐花、羅漢果組成。方中金銀花、菊花有清熱解毒、疏風利咽之功。木棉花、葛花性均甘涼，均有清熱利濕的作用，羅漢果花性涼，味甘，歸肺、大腸經，主治清熱潤肺、止咳、利咽，諸藥合用共奏清熱解毒、解表宣肺的作用[13-14]。在臨床實踐中我們發現五花茶可明顯改善夏季風熱感冒及流行性感冒的癥狀，但與此同時我們亦發現由于五花茶性味多苦寒涼，苦寒涼易燥濕，也就是會損傷人體津液，部分脾胃虛寒、腸胃濕滯、體質較弱等人群服用后出現腹瀉等癥狀，故我們在研究中加入黃芪、大棗，結果顯示這兩味藥加入后對五花茶退熱功效并未受影響，但大鼠的小腸推進率明顯下降，這意味著加用黃芪大棗可明顯減少五花茶的胃腸道反應，但大鼠的肝腎功能并未受損，故我們認為五花茶乃至加入黃芪、大棗后用于治療夏季風熱感冒及流行性感冒具有安全性。

采用五花茶治療外感發熱具有積極效應，加用黃芪、大棗對配方進行優化后既不影響藥物的功效，又可減少未嘗不良反應，具有一定的臨床優勢。

參考文獻

[1]湯瑞蓮，王曉燕.三陽清解液乙狀結腸滴注對內毒素誘導大鼠發熱模型解熱機制的研究[J].中醫藥學報，2019，47（1）：34-38.

[2]傅勁松.比較五花茶中藥飲片與五花茶沖劑治療熱氣的臨床效果[J].基層醫學論壇，2018，22（14）：1968-1969.

[3]武栗妃，李玉琳，闞曉玉，等.多巴胺受體5活化對內毒素介導的急性腎臟炎癥的影響[J].中國醫藥，2016，11（3）：381- 385.

[4]萬宇翔，鄭子安，白辰，等.銀萊湯對發熱大鼠血清IL-1β、TNF-α、IL-6含量的影響[J].湖南中醫藥大學學報，2017，37（11）：1184-1187.

[5]安祥，高靜飛，孫潔雨，等.柴芩清寧膠囊與感冒靈膠囊對LPS及干酵母大鼠發熱模型的解熱作用研究[J].中藥藥理與臨床，2017，33（5）：157-162.

[6]李潔，楊萍，李紹強，等.復方柴芩退熱顆粒對發熱大鼠模型退熱作用的研究[J].新中醫，2017，49（10）：20-24.

[7]王齊，劉凱，陳凡，等.疏風解毒膠囊治療小兒急性上呼吸道感染的療效分析[J].臨床肺科雜志，2018，23（10）：1842-1845.

[8]陳金偉.金銀花類中成藥治療熱病5例[N].上海中醫藥報，2017-03-31（009）.

[9]韓玲，趙一粒.熱必清顆粒對發熱模型大鼠體溫及血清IL-1β影響的實驗研究[J].湖南中醫雜志，2016，32（10）：174-175，189.

[10]薛小平，李東華，張浩，等.清熱解毒方對急性細菌性腹膜炎大鼠血清內毒素及細胞因子的影響[J].中國實驗方劑學雜志，2010，16（6）176-178.

[11]伍世恒.苦參對干酵母致大鼠發熱模型解熱作用的中樞調控機制研究[J].北方藥學，2016，13（8）：112-112，113.

[12]吳小麗，馮譯影，黃艾冰，等.五花茶中藥飲片與五花茶沖劑的應用對比[J].當代醫學，2014，20（22）：145-146.

[13]楊巨成，張海文.清熱解毒存陰法治療外感發熱的臨床觀察[J].中國民間療法，2014，22（7）：31-32.

[14]韓琴，韓鋒，高兵.五花茶顆粒聯合氯雷他定片治療慢性蕁麻疹44例[J].中國中醫藥現代遠程教育，2011，9（23）：46-47.

（2019-04-09收稿 責任編輯：王明）