牛乳基和羊乳基奶粉中16種氨基酸含量的測定及比較

劉婷婷 邢青斌 唐艷斌 陳璐 孫靜 黃建 霍軍生

摘?要：目的：對乳粉中氨基酸分析的水解方法進行研究，比較牛乳基奶粉和羊乳基奶粉中氨基酸的含量。方法：樣品用含巰基乙酸的鹽酸溶液水解提取，經定容、過濾、真空濃縮、復溶、過膜后，用氨基酸分析儀測定，外標法定量。結果：應用含0.05%巰基乙酸的鹽酸水解液對奶粉樣品進行水解的同時有效防止了蛋氨酸的氧化，相對氧化水解方法節省前處理時間，方法的回收率為94%～97%，相對標準偏差小于3.0%。通過對牛乳基和羊乳基奶粉樣品中的16種氨基酸分析，牛乳基奶粉中賴氨酸含量略高于羊乳基奶粉，其他相應氨基酸含量不存在顯著性差異。結論：該方法準確快速、重現性好，適用于奶粉中氨基酸含量分析的檢測要求。

關鍵詞：氨基酸;奶粉;牛乳基;羊乳基;氨基酸分析儀

近些年，羊乳基粉和牛乳基粉營養組成及營養價值受到較多關注，但作為主要乳營養成分的蛋白質的氨基酸，在我國市場上羊乳基粉和牛乳基粉產品中的比較研究尚未見報道。氨基酸主要以結合態氨基酸和游離氨基酸形式存在。游離氨基酸可直接取樣提取后檢測，結合態氨基酸需將蛋白水解后進行測定。國內外學者對其進行大量研究，由于大部分氨基酸無熒光發射和紫外吸收特性，需通過衍生后進行檢測[1]，研究人員開發出柱前衍生的陰離子交換色譜-積分脈沖安培檢測法[2]、高效液相色譜法[3-6]、液相色譜質譜聯用法[7-9]等，上述方法所需前處理步驟復雜，分析時間較長，重現性不是很穩定，且消耗人力、物力較大。近些年，氨基酸分析儀被廣泛應用于氨基酸分析，低pH條件下帶正電荷的各種氨基酸在陽離子交換樹脂上被吸附，隨著不同離子強度、pH值的流動相依次洗脫下來，分離純化后用茚三酮衍生的色譜法，該方法靈敏、快速、重現性好，數據可靠。

本研究對乳基粉中氨基酸測定的前處理過程進行優化，使用氨基酸分析儀進行分析，建立了快速、準確、可靠的16種氨基酸含量測定方法。通過分析不同牛乳基奶粉和羊乳基奶粉產品中氨基酸的成分和含量，得到其特征圖譜，為今后評價原材料和相應產品質量的優良性、真實性提供參考。

1?材料與方法

1.1?樣品和試劑

奶粉樣品：分別采購自四川、內蒙、新疆、寧夏、青海、甘肅、重慶、廣西、貴州、云南的商場和超市。涉及嬰幼兒配方奶粉、孕婦奶粉、中老年奶粉，去除調制乳和乳基不明確的乳粉，篩選出70份牛乳基奶粉和18份羊乳基奶粉樣本。

氨基酸標樣，日本Wako公司;質控品（SRM 1849A嬰兒/成人營養配方），美國NIST;鹽酸（優級純），天津試劑公司;巰基乙酸，美國Sigma公司;氨基酸分析儀配套的流動相（茚三酮溶液和緩沖液），日本Wako公司;實驗用水為MilliQ純水儀制的。

1.2?儀器和設備

L-8900型氨基酸分析儀，日本日立公司;電熱恒溫干燥箱，上海森信;濃縮儀，東京理化公司;氮吹儀，美國Organomation公司。

1.3?方法

1.3.1?蛋白質含量的測定?參照國標方法（GB 5009.5—2016）[10]，稱取約0.20g樣品，同時做樣品空白管，每管分別加入5.0mL濃硫酸和催化片（K2SO4 1.5g;Se 0.007 5g），過夜，次日，置消化器消化6h，待消化完全后用凱式自動定氮分析儀測定氮含量，計算得到其蛋白質含量。

1.3.2?氨基酸的測定?參照國標方法（GB 5009.124—2016）[11]原理測定16種氨基酸，并對樣品預處理做出調整。稱取奶粉樣品約0.10g于酸水解管中，在水解管內加10mL 6mol/L鹽酸（含0.05%巰基乙酸），充入高純氮氣后封口，將已封口的水解管放入110℃的恒溫鼓風箱中，水解22h后取出冷卻。將水解管內全部液體轉移到50mL容量瓶內，多次沖洗水解管，用去離子水定容。將定容水解液過濾后，吸取1mL于10mL濃縮管中，應用真空濃縮儀，在55℃水浴中濃縮，殘留物用1mL水溶解后濃縮至干，用2.0mL 0.02moL/L鹽酸復溶，過濾后供儀器測定。準確吸取標準儲備溶液，用0.02mol/L稀鹽酸稀釋配制得到0.10μmol/mL混合標準溶液。

色譜條件：色譜柱：水解氨基酸色譜柱（4.6mm×60mm，3μm）;檢測波長：570、440nm;反應柱溫度：135℃;分析柱溫度：57℃;進樣體積：20μL;洗脫溶液流速：0.4mL/min;柱后衍生試劑流速：0.35mL/min。

1.3.3?數據分析?用外標法分別測定篩選出的70份牛乳基樣本和18份羊乳基樣本中16種氨基酸的含量，應用SRM 1849A嬰兒/成人營養配方粉作為質控驗證分析數據的準確性，通過SAS 9.4軟件，用中位數[四分位間距（quartile，QR）]表示，采用Wilcoxon秩和檢驗比較組間差異。

2?結果與分析

2.1?氨基酸測定方法的改進

2.1.1?色譜分離效果?使用氨基酸分析儀，采用陽離子色譜柱分離后茚三酮在線衍生的方法，該方法靈敏準確、重現性好。從圖1～2可以看出，基線平穩，色譜峰窄而尖，分析時間短，分離效果好。在實際奶粉樣品中，目標峰也與其他雜質峰分離良好。

2.1.2?檢出限及定量限?在上述分析條件下，結合稱樣量，前處理過程和復溶后的定容體積，以3倍信噪比計算方法檢出限（LOD），10倍信噪比計算方法定量限（LOQ）（表1）。

2.1.3?分析條件優化及準確性評估?蛋氨酸作為含硫氨基酸，在酸水解過程中，容易被氧化而導致測定值比實際含量值偏低，因此，蛋氨酸回收率的提高是保證酸水解氨基酸檢測結果是否準確的關鍵。為此，本研究采用3種不同的前處理水解液對樣品進行回收率試驗，并比較了上機前氮氣濃縮和真空濃縮的效果（表2）。在樣品前處理過程中，加入含0.05%巰基乙酸的鹽酸水解法對樣品中蛋氨酸的水解保護效果較好。因巰基乙酸具有巰基和羥酸的反應特征，直接對蛋白類樣品進行水解的同時，還可有效防止蛋氨酸被氧化，減少了氨基酸前處理過程中的氧化損失。加入巰基乙酸的鹽酸水解液法相對氧化保護后酸水解法分析步驟相對簡單，節省前處理時間，回收率達到94%～97%，高于原國標方法采用的方法（回收率 89%～93%），相對標準偏差（RSD）小于3.0%，真空濃縮儀趕酸富集過程樣品中的氨基酸更穩定，不易被空氣氧化，重現性好，表明此方法有較好的重復性，準確可靠。

2.2?奶基中氨基酸比較

應用氨基酸分析儀對來自牛乳基和羊乳基樣品中的16種氨基酸進行分析，NIST的嬰兒/成人營養配方粉1849A作為質控品，對蛋白質和相應的氨基酸進行質量控制，試驗所得的質控品氨基酸含量在靶值范圍內。各氨基酸含量總和基本等于其蛋白質的含量，也間接證明了本方法測定乳粉中氨基酸含量的準確性。根據對70份牛乳基奶粉和18份羊乳基樣本的分析，蛋白質含量平均為15%（11%～22%）。牛奶基和羊奶基奶粉中均含有豐富的氨基酸，種類齊全，包括絲氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、酪氨酸等（表3）。

3?結論

本研究通過對乳基奶粉中氨基酸分析的前處理條件進行優化研究，在鹽酸水解液中加入巰基乙酸對含硫的蛋氨酸進行保護，相比傳統酸水解方法減少氧化損失，其分析步驟相對簡單，準確可靠，重現性好，為進一步開展奶粉氨基酸成分及含量的相關研究提供科學依據。通過氨基酸分析儀對國內市場上銷售的牛乳基奶粉和羊乳基奶粉中16種氨基酸進行測定，發現牛乳基奶粉中酪氨酸含量略高于羊乳基奶粉，其他種類的氨基酸含量在牛乳基和羊乳基奶粉中不存在顯著性差異，為今后相關產品的質量評價提供參考。

參考文獻

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[11]中華人民共和國衛計委GB 5009.124—2016 食品中氨基酸的測定[S].北京：中國標準出版社，2016.

（責任編輯?唐建敏）