聚木糖酶處理桉木預(yù)水解液制備低聚木糖的研究

陳嘉川 董吉冉 楊桂花徐 豐 吉興香

（齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）生物基材料與綠色造紙國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/制漿造紙科學(xué)與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南，250353）

低聚木糖（xylo-oligosaccharides，XOS）又稱(chēng)木寡糖，是一種由木糖分子通過(guò)β-1,4糖苷鍵連接而成的功能性低聚糖，其主要成分為木二糖、木三糖和木四糖的混合物[1]。低聚木糖具有較好的理化性質(zhì)，例如選擇性增殖腸道益生菌[2]；降低膽固醇、提高鈣的生物利用度[3]；抗氧化、抗菌、增強(qiáng)免疫力、改善心血管系統(tǒng)[4]；可滿(mǎn)足糖尿病人及肥胖癥人對(duì)甜度的需求[5-6]等。因此，低聚木糖被認(rèn)為是目前最有前景的功能性低聚糖之一，廣泛應(yīng)用于食品及醫(yī)藥行業(yè)[7]。

目前國(guó)內(nèi)外生產(chǎn)低聚木糖的方法主要有自水解、酸水解、微波降解法和酶水解[6]。自水解方法操作簡(jiǎn)單、無(wú)污染，但是對(duì)設(shè)備要求較高，精制過(guò)程繁瑣，且產(chǎn)物得率和純度較低。酸水解方法過(guò)程簡(jiǎn)單，反應(yīng)迅速，但是對(duì)設(shè)備要求高、反應(yīng)過(guò)程不易控制、產(chǎn)物得率低、有毒副產(chǎn)物含量高[8]。微波降解法加熱方式簡(jiǎn)單方便，具有加熱速率快、可選擇性加熱、對(duì)熱能消耗量少及反應(yīng)副產(chǎn)物少、所得產(chǎn)物純度高等優(yōu)點(diǎn)，但多局限于實(shí)驗(yàn)室研究階段[9]。酶水解主要是利用內(nèi)切聚木糖酶選擇性切割木糖單元間的糖苷鍵。該方法條件溫和、對(duì)設(shè)備無(wú)特殊要求、易于控制，且制備過(guò)程不產(chǎn)生有毒副產(chǎn)物，制備所得低聚木糖產(chǎn)品純度較高，是一種清潔環(huán)保型低聚木糖制備工藝[10]。

據(jù)報(bào)道，目前市場(chǎng)上的低聚木糖大多是由玉米芯、麥麩等農(nóng)林廢棄物生產(chǎn)而來(lái)[6,11]。由于這些原料所含雜質(zhì)較多，因此精制工藝較為繁瑣，生產(chǎn)成本高，使低聚木糖產(chǎn)品價(jià)格較高，限制了其在普通食品中的擴(kuò)大應(yīng)用[7]。近年來(lái)，隨著溶解漿市場(chǎng)需求量的不斷提高，預(yù)水解液作為溶解漿生產(chǎn)過(guò)程中的副產(chǎn)物其產(chǎn)量日益增加[12-13]。預(yù)水解液中含有大量的半纖維素，部分企業(yè)將預(yù)水解液與黑液混合燃燒產(chǎn)生熱量，降低了資源利用率[14-15]。闊葉木預(yù)水解液中的半纖維素糖類(lèi)主要是低聚木糖和聚木糖，因此是生產(chǎn)低聚木糖的良好資源[16-17]。利用預(yù)水解液生產(chǎn)低聚木糖不僅可以為企業(yè)帶來(lái)額外的利潤(rùn)收入，同時(shí)可以豐富低聚木糖的生產(chǎn)途徑，符合生物質(zhì)精煉的要求。

本研究以桉木預(yù)水解液為原料，首先采用Ca(OH)2、活性炭對(duì)預(yù)水解液進(jìn)行純化，制備得到二級(jí)處理預(yù)水解液，然后通過(guò)聚木糖酶處理制備富含木二糖～木四糖的三級(jí)處理預(yù)水解液，探討聚木糖酶處理過(guò)程中不同因素對(duì)三級(jí)處理預(yù)水解液中低聚木糖含量的影響，并對(duì)所制備的低聚木糖產(chǎn)品進(jìn)行分析與表征，為預(yù)水解液中半纖維素的高值化利用提供理論指導(dǎo)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料及試劑

桉木預(yù)水解液，山東太陽(yáng)紙業(yè)有限公司提供。

Ca(OH)2，分析純，天津恒興試劑有限公司；活性炭，磷酸活化、木質(zhì)、過(guò)200目，廣東海燕活性炭有限公司；聚木糖酶，酶活70000 U，山東隆科特酶制劑公司；KBr，光譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；液體NaOH，色譜純、純度50%，美國(guó)Thermo-Fisher公司；木糖、木二糖、木三糖及木四糖，標(biāo)準(zhǔn)品，上海意果科技有限公司；透析袋：MD34、200 Da，美國(guó)邁姆生物科技有限公司；商品低聚木糖，食品級(jí)，XOS-95，購(gòu)于山東龍力公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 桉木二級(jí)處理預(yù)水解液的制備

向桉木預(yù)水解液中加入用量1%（以預(yù)水解液質(zhì)量計(jì)）的Ca(OH)2，以150 r/min的轉(zhuǎn)速攪拌處理30 min，后置于離心機(jī)中以4500 r/min的轉(zhuǎn)速離心3 min，取上清液，稱(chēng)為一級(jí)處理預(yù)水解液；向一級(jí)處理預(yù)水解液中加入用量0.8%（以一級(jí)處理液質(zhì)量計(jì)）的活性炭，吸附10 min后離心（4500 r/min）3 min，取上層清液，稱(chēng)為二級(jí)處理預(yù)水解液。各級(jí)處理預(yù)水解液中木素、木糖、乙酸和糠醛的含量如表1所示。從表1可知，經(jīng)過(guò)Ca(OH)2和活性炭處理后，預(yù)水解液中木素脫除率較高為80.3%，糠醛完全脫除，總木糖損失率較低為9.6%。另外，Ca(OH)2處理使聚木糖側(cè)鏈上連接的乙酰基脫落下來(lái)形成乙酸，從而提高了水解液中的乙酸含量。二級(jí)處理預(yù)水解液中木糖及低聚木糖DP2～4的含量如表2所示。

表1 各級(jí)預(yù)水解液化學(xué)成分分析 g/L

表2 二級(jí)處理預(yù)水解液中木糖及低聚木糖DP2～4含量 g/L

1.2.2 聚木糖酶處理制備三級(jí)處理預(yù)水解液

向50 mL錐形瓶中各加入20 g二級(jí)處理預(yù)水解液，分別加入用量為2、5、10、20 U/g的聚木糖酶，將錐形瓶置于恒溫?fù)u床中，以150 r/min的轉(zhuǎn)速搖晃處理，探究處理時(shí)間（0.67、1、2、3、6、18 h）、處理溫度（45、55、60℃）和pH值（4.5、5.5、6.5）對(duì)三級(jí)處理預(yù)水解液中木糖和低聚木糖DP2～4含量的影響。反應(yīng)完成后，將三級(jí)處理預(yù)水解液置于沸水浴中處理10 min使聚木糖酶滅活，后置于離心機(jī)中以4500 r/min的轉(zhuǎn)速離心3 min，收集上清液用于木糖及低聚木糖DP2～4含量的檢測(cè)。

1.2.3 低聚木糖的純化

將聚木糖酶處理后的三級(jí)處理預(yù)水解液置入透析袋中透析處理48 h，以除去其中剩余的小分子木素等雜質(zhì)。透析完成后，將透析液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去部分水分，然后將濃縮糖液進(jìn)行冷凍干燥得到低聚木糖產(chǎn)品，用于后續(xù)分析與表征。

1.3 檢測(cè)與分析

1.3.1 預(yù)水解液中木糖、低聚木糖及總木糖含量的檢測(cè)

取1 mL預(yù)水解液稀釋適宜倍數(shù)，采用離子色譜儀（ICS-5000型，美國(guó)Thermofisher公司），以Dionex CarboPacTM PA200（3 mm×250 mm）為分析柱，以CarboPacTM PA200（3 mm×50 mm）為保護(hù)柱，柱溫30℃，取樣25 μL，采用100 mmol/L NaOH與500 mmol/L NaOAc溶液，以0.3 mL/min的流速梯度淋洗，測(cè)定預(yù)水解液中木糖、木二糖、木三糖、木四糖的含量。

預(yù)水解液中總木糖含量的檢測(cè)：取5 mL預(yù)水解液放入耐壓瓶中，加入174 μL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為72%的H2SO4，將耐壓瓶密封后放入油浴中，121℃下反應(yīng)60 min，然后取上清液稀釋適宜倍數(shù)，按上述方法測(cè)定預(yù)水解液中的木糖含量，即為預(yù)水解液中的總木糖含量。

1.3.2 紅外光譜（FT-IR）分析

取1 mg經(jīng)過(guò)冷凍干燥后得到的低聚木糖樣品，與100 mg干燥的KBr經(jīng)瑪瑙研缽研磨后壓片，置于Vertex70傅里葉變換紅外光譜儀（FT-IR）（Vertex70型，德國(guó)布魯克公司）中測(cè)試，掃描范圍為250～4250 cm－1，掃描次數(shù)為16次。

1.3.3 熱穩(wěn)定性（TGA）分析

取5～10 mg經(jīng)過(guò)冷凍干燥后得到的低聚木糖樣品置于坩堝中，在熱重分析儀（Q50型，美國(guó)TA儀器公司）中進(jìn)行測(cè)試。測(cè)試條件：以高純度氮?dú)猓ā?9.99%）為載氣，流量為60 mL/min，以10℃/min的升溫速率從室溫升溫至600℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶用量及處理時(shí)間對(duì)三級(jí)處理預(yù)水解液中木糖及低聚木糖DP2～4含量的影響

圖1 酶用量及處理時(shí)間對(duì)三級(jí)處理預(yù)水解中木糖及低聚木糖DP2～4含量的影響

聚木糖酶處理過(guò)程中酶用量及處理時(shí)間對(duì)三級(jí)處理預(yù)水解液中木糖及低聚木糖DP2～4含量的影響見(jiàn)圖1。由圖1中數(shù)據(jù)可知，酶用量及處理時(shí)間對(duì)三級(jí)處理預(yù)水解液中低聚木糖DP2～4含量的影響較大，而對(duì)木糖含量影響較小。圖1(a)顯示，在酶用量為2 U/g時(shí)，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，三級(jí)處理預(yù)水解液中低聚木糖DP2～4的含量呈現(xiàn)先快速增加后逐漸不變的趨勢(shì)，原因可能是酶用量較低時(shí)，預(yù)水解液中酶分子數(shù)量較少，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，酶分子與反應(yīng)底物不斷結(jié)合，在處理時(shí)間為3 h時(shí)，幾乎所有的酶分子與反應(yīng)底物結(jié)合，此時(shí)預(yù)水解液中低聚木糖DP2～4含量較高為12.22 g/L；之后，由于預(yù)水解液中剩余的酶分子數(shù)量更少，因此進(jìn)一步延長(zhǎng)處理時(shí)間低聚木糖含量變化不明顯。由圖1(b)、圖1(c)可知，在酶用量為5 U/g、10 U/g時(shí)，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，三級(jí)處理預(yù)水解液中低聚木糖DP2～4含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，而且分別在處理6 h和3 h時(shí)達(dá)到最大值，分別為13.02 g/L和13.12 g/L。這是由于隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，預(yù)水解液中的聚木糖不斷被降解為低聚木糖，在處理時(shí)間分別為6 h和3 h時(shí)，幾乎所有的聚木糖轉(zhuǎn)化為低聚木糖，此時(shí)，預(yù)水解液中木糖和低聚木糖DP2～4總量分別為18.84 g/L和19.08 g/L；由于預(yù)水解液中剩余的聚木糖含量較少，因此進(jìn)一步延長(zhǎng)處理時(shí)間，預(yù)水解液中剩余的大量酶分子會(huì)進(jìn)一步切割低聚木糖的糖苷鍵形成木糖，這和預(yù)水解液中木糖含量的提高是一致的。圖1(d)中數(shù)據(jù)表明，在酶用量為20 U/g時(shí)，酶處理0.67 h即可使預(yù)水解液中的低聚木糖DP2～4含量達(dá)到最大值13.1 g/L；進(jìn)一步延長(zhǎng)處理時(shí)間，低聚木糖含量不斷降低。這是由于酶用量較高時(shí)預(yù)水解液中的酶分子數(shù)量較高，酶分子與反應(yīng)底物結(jié)合的機(jī)率增加。因此，較短的處理時(shí)間內(nèi)酶分子即可與反應(yīng)底物充分結(jié)合，有效提高了聚木糖水解生產(chǎn)低聚木糖DP2～4的反應(yīng)速度。由以上分析可知，低酶用量和長(zhǎng)處理時(shí)間或者高酶用量和短處理時(shí)間均可使低聚木糖DP2～4含量達(dá)到較高值。因此，考慮到實(shí)際生產(chǎn)成本，較優(yōu)的聚木糖酶用量為2 U/g，酶處理時(shí)間為3 h。

2.2 處理溫度對(duì)三級(jí)處理預(yù)水解液中木糖及低聚木糖 DP2～4含量的影響

圖2 處理溫度對(duì)三級(jí)處理預(yù)水解液中木糖及低聚木糖DP2～4含量的影響

聚木糖酶處理過(guò)程中處理溫度對(duì)三級(jí)處理預(yù)水解液中木糖和低聚木糖DP2～4含量的影響見(jiàn)圖2。圖2中數(shù)據(jù)表明，溫度是影響酶處理效果的重要因素。在處理溫度為45℃時(shí)，預(yù)水解液中低聚木糖DP2～4含量較低，這是由于溫度較低時(shí)聚木糖酶活性較低，酶反應(yīng)速率較慢。升高處理溫度至55℃，預(yù)水解液中低聚木糖DP2～4含量快速提高至12.22 g/L，此時(shí)預(yù)水解液中木糖、木二糖、木三糖及木四糖含量分別為5.53、5.69、4.15和2.38 g/L，原因是升高處理溫度使反應(yīng)體系中的酶分子與聚木糖分子運(yùn)動(dòng)加快，增加了二者之間的碰撞機(jī)會(huì)，有效地提高了酶分子-聚木糖底物絡(luò)合物轉(zhuǎn)變?yōu)榈途勰咎堑乃俣取Ｖ螅M(jìn)一步升高處理溫度至60℃，預(yù)水解液中低聚木糖DP2～4的含量快速降低，這是由聚木糖酶自身的性質(zhì)造成的，聚木糖酶是一種具有特殊催化活性的蛋白質(zhì)，在溫度較高時(shí)酶蛋白的構(gòu)象與參與酶促反應(yīng)的功能團(tuán)的離解狀態(tài)會(huì)發(fā)生改變，使酶分子活力降低或發(fā)生失活[17]。因此，利用聚木糖酶水解制備低聚木糖時(shí)需要嚴(yán)格控制處理溫度。綜上分析，較優(yōu)的聚木糖酶處理溫度為55℃。

2.3 酶解pH值對(duì)三級(jí)處理預(yù)水解液中木糖及低聚木糖 DP2～4含量的影響

聚木糖酶處理過(guò)程中pH值對(duì)三級(jí)處理預(yù)水解液中木糖和低聚木糖DP2～4含量的影響見(jiàn)圖3。

圖3 pH值對(duì)三級(jí)處理預(yù)水解液中木糖及低聚木糖DP2～4含量的影響

由圖3中數(shù)據(jù)可知，隨著三級(jí)處理預(yù)水解液pH值的不斷增加，低聚木糖DP2～4含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，這是由于pH值可以通過(guò)改變聚木糖酶的構(gòu)象進(jìn)而影響酶的活性位點(diǎn)與底物的結(jié)合。在pH值為4.5或6.5時(shí)，聚木糖酶的構(gòu)象與參與酶反應(yīng)的功能團(tuán)的離解狀態(tài)發(fā)生了改變，使得聚木糖酶活力下降，因此，過(guò)低或過(guò)高的pH值環(huán)境均不適合聚木糖酶水解制備低聚木糖。另外，圖3顯示，pH值對(duì)預(yù)水解液中木糖含量的影響較小，這是由于內(nèi)切聚木糖酶可以選擇性地切割聚木糖主鏈的β-1,4糖苷鍵。由以上分析可知，聚木糖酶處理二級(jí)處理預(yù)水解液制備低聚木糖DP2～4的較優(yōu)pH值為5.5。

2.4 較優(yōu)處理工藝條件下不同聚合度低聚木糖DP2～4含量分布

由上述2.1～2.3分析可知，聚木糖酶處理二級(jí)處理預(yù)水解液制備富含低聚木糖DP2～4的較優(yōu)工藝條件為聚木糖酶用量2 U/g、處理時(shí)間3 h、處理溫度55℃、處理液pH值5.5。在此條件下，三級(jí)處理預(yù)水解液中木糖及低聚木糖DP2～4的含量如表3所示。

表3 聚木糖酶處理前后預(yù)水解液中木糖及低聚木糖 DP2～4含量 g/L

由表3中數(shù)據(jù)可知，聚木糖酶處理對(duì)三級(jí)處理預(yù)水解液中木糖含量的影響較小，而對(duì)低聚木糖DP2～4含量的影響較大。經(jīng)過(guò)聚木糖酶處理后，預(yù)水解液中木二糖及木三糖含量分別提高了108.4%、86.9%，而木四糖含量變化不明顯，低聚木糖DP2～4含量由原來(lái)的7.31 g/L提高為12.22 g/L，提高了67.2%。在較優(yōu)的酶處理?xiàng)l件下，所得三級(jí)處理預(yù)水解液中低聚木糖DP2～4的含量占原始桉木預(yù)水解液中總木糖含量的56.1%。由以上分析可知，利用聚木糖酶處理桉木預(yù)水解液是制備低聚木糖較為有效的方法。

2.5 FT-IR分析

預(yù)水解液經(jīng)過(guò)聚木糖酶處理后所得酶解低聚木糖和商品低聚木糖樣品的FT-IR圖如圖4所示。由圖4可知，兩種低聚木糖樣品均在1045、894和1408 cm－1處出現(xiàn)特征吸收峰。樣品在1045 cm－1處出現(xiàn)較強(qiáng)的吸收峰，是由C—O的伸縮振動(dòng)引起，是聚木糖主鏈的特征吸收峰[18]；894 cm－1處出現(xiàn)的吸收峰是由糖單元間顯性β-糖苷鍵的振動(dòng)引起；1635 cm－1處的吸收峰是由吸附水的彎曲振動(dòng)引起[19]；1408 cm－1處出現(xiàn)的吸收峰是由—COO－的對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)引起，為糖醛酸的典型特征峰[20]，這表明經(jīng)過(guò)聚木糖酶處理所制備的低聚木糖產(chǎn)品中含有部分糖醛酸側(cè)鏈。另外圖4顯示，酶解低聚木糖在1730 cm－1處沒(méi)有出現(xiàn)特征吸收峰，這是由于Ca(OH)2處理純化預(yù)水解液過(guò)程中，堿性條件下聚木糖側(cè)鏈上的乙酰基脫落造成的[21]。

圖4 聚木糖酶處理所制備的酶解低聚木糖和商品低聚木糖樣品的FT-IR圖

2.6 TGA分析

聚木糖酶處理所制備的酶解低聚木糖和商品低聚木糖樣品的TGA圖如圖5所示。由圖5中TG曲線(xiàn)和DTG曲線(xiàn)可知，酶解低聚木糖和商品低聚木糖的TGA圖相似。兩種低聚木糖在160℃前只發(fā)生脫水，從190℃開(kāi)始發(fā)生分解，并在310℃出現(xiàn)最大質(zhì)量損失峰，質(zhì)量損失過(guò)程在600℃完成，之后質(zhì)量損失變化不明顯。由以上分析可知，酶解所得低聚木糖熱降解過(guò)程主要分為4個(gè)階段：160℃前為第一階段，樣品吸熱使樣品中的水分蒸發(fā)，這一階段只發(fā)生物理變化；160～310℃為第二階段，在此階段內(nèi)低聚木糖出現(xiàn)解聚轉(zhuǎn)變現(xiàn)象，生成不燃性氣體如CO、CO2、甲酸和乙酸等[18]；310～440℃為第三階段，在此階段內(nèi)，不燃性氣體生成為可燃性氣體[19]；440℃后為第四階段，該階段主要發(fā)生炭化反應(yīng)，是由C—O和C—H鍵的進(jìn)一步裂解造成的[22]。由上述分析可知，利用聚木糖酶處理預(yù)水解液所制備的低聚木糖樣品具有較高的熱穩(wěn)定性。

圖5 聚木糖酶處理所制備的酶解低聚木糖和商品低聚木糖的TGA分析

3 結(jié) 論

采用單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)聚木糖酶處理二級(jí)處理預(yù)水解液制備富含低聚木糖DP2～4的工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化分析，并得出以下結(jié)論。

3.1 聚木糖酶用量、處理時(shí)間、處理溫度及pH值對(duì)預(yù)水解液中低聚木糖DP2～4的含量均有較大影響；低酶用量和長(zhǎng)處理時(shí)間或者高酶用量和短處理時(shí)間均可使低聚木糖DP2～4的含量達(dá)到較高值；聚木糖酶處理預(yù)水解液制備低聚木糖DP2～4的較優(yōu)工藝條件為酶用量2 U/g、處理時(shí)間3 h、處理溫度55℃和pH值5.5，在此條件下，經(jīng)過(guò)酶處理后三級(jí)處理預(yù)水解液中低聚木糖DP2～4含量為12.22 g/L，與未經(jīng)過(guò)酶處理的二級(jí)處理預(yù)水解液相比，低聚木糖DP2～4含量提高了67.2%。三級(jí)處理預(yù)水解液中低聚木糖DP2～4含量為桉木預(yù)水解液中總木糖含量的56.1%。

3.2 紅外光譜（FT-IR）分析表明，通過(guò)聚木糖酶處理桉木預(yù)水解液所制備的低聚木糖含有部分糖醛酸側(cè)鏈；熱重分析（TGA）顯示，經(jīng)過(guò)聚木糖酶處理制備的低聚木糖具有較高的熱穩(wěn)定性。