低溫儲存條件對原料乳嗜冷菌及細菌多樣性的影響

雷鳴，胡楠，王遠一飛，張燕

(1.天津科技大學食品工程與生物技術學院食品營養與安全國家重點實驗室，天津300457;2.南開大學醫學院天津市食品科學與健康重點實驗室，天津300071）

0 引言

鮮牛乳是理想的微生物生長基質[1]，過高的儲存溫度，會導致其變質。因此在其儲運環節中，低溫成為必要條件。低溫能夠抑制牛乳中大部分微生物的活性，但其中的嗜冷菌仍能在低溫環境中繁殖[2]。熱滅菌法可有效殺滅嗜冷菌，但其分泌的蛋白酶和脂肪酶具有耐熱性，可導致原料乳在熱滅菌后產生凝膠，沉淀，變苦[3]，并造成發酵產品品質缺陷[4]。目前我國食品安全國家標準中未規定生乳中嗜冷菌限量，因此分析低溫下嗜冷菌的變化規律對于提高牛乳品質具有重要意義。

本研究通過16S rRNA高通量測序及國標方法，監測原料乳在不同溫度儲存下嗜冷菌數及菌落總數的變化，旨在探究在不同溫度儲存期間牛乳衛生指標的變化情況以及保證原料乳高品質的冷藏溫度及時間。

1 實驗

材料為原料乳。

1.1 樣品測序

取在4℃儲存一天的原料乳兩份，每份樣品25 g，過0.22μm無菌濾膜，將原料乳中的微生物富集于膜上，然后將無菌濾膜放入無菌采樣袋于-80℃保存備用。

1.1.1 基因組DNA的提取和PCR擴增

采用SDS方法對樣本的基因組DNA進行提取，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度。取適量的樣品于離心管中，使用無菌水稀釋樣品至1 ng/μL。

以稀釋后的基因組DNA為模板，根據測序區域的選擇，使用帶Barcode的特異引物，New England Biolabs公司的Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer和高效高保真酶進行PCR，確保擴增效率和準確性。引物對應區域為16SV4區引物（515F和806R）。

1.1.2 PCR產物的混樣和純化

PCR產物使用2%濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測：根據PCR產物濃度進行等量混樣，充分混勻后使用質量分數為2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，用膠回收試劑盒回收目的條帶。

1.1.3 文庫構建和上機測序

使用TruSeq DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構建，構建好的文庫經過Qubit和Q-PCR定量，文庫合格后，使用HiSeq2500 PE250進行上機測序。

1.2 測序數據分析

1.2.1 測序數據處理

根據Barcode序列和PCR擴增引物序列從下機數據中拆分出各樣品數據，截去Barcode和引物列后應用文獻[5]中方法對每個樣品的序列進行拼接，得到原始數據；再經過嚴格的過濾處理[6]得到高質量數據。

參照文獻[7]中的質量控制流程，進行數據截取和長度過濾操作，經過以上處理后得到的數據還需要通過文獻[8]中方法與數據庫進行比對檢測嵌合體序列，并最終去除其中的嵌合體序列[9]，得到最終的有效數據。

1.2.2 OTU聚類和物種注釋

利用Uparse軟件[10]對所有樣品的全部有效數據以97%的一致性進行聚類成為OTUs（Operational Taxonomic Units），同時選取OTUs的代表性序列進行物種注釋，用Mothur方法與SILVA[11]的SSUrRNA數據庫[12]進行物種注釋分析（設定閾值為0.8～1），獲得分類學信息并統計各樣本的群落組成。使用MUSCLE[13]軟件進行快速多序列比對，得到所有OTUs代表序列的系統發生關系。最后以樣品中數據量最少的為標準進行均一化處理，后續的Alpha多樣性分析都是基于均一化處理后的數據。

1.3 菌落總數測定

食品微生物學檢驗：乳與乳制品檢驗GB 4789.18-2010[14]。

1.4 嗜冷菌測定

乳與乳制品中嗜冷菌、需氧芽孢及嗜熱需氧芽孢數的測定NY/T 1331-2007[15]。

1.5 原料乳儲存條件

取新鮮原乳，分別在4，10，15℃下儲存并在不同規定時間取樣，測定總菌數、酸度及嗜冷菌菌數并記錄其變化。不同儲存溫度下的監測總時間及檢測頻率如表1所示。

表1 原料乳不同儲存溫度檢測頻率及檢測時間

2 結果與討論

2.1 原料乳中的細菌多樣性

將原料乳中提取的微生物核酸序列進行測序聚類，得到樣品聚類信息，結果如圖1所示。

圖1 樣品OTUs聚類韋恩圖

圖1 中，M 1和M 2分別代表測序樣品；65為兩個樣品共有的聚類單元數；12為M 1樣本的特有聚類單元數；7為M 2樣本的特有聚類單元數。兩個樣本共檢測到聚類單元（OTUs）84個，其中M 1樣品中檢測出77個聚類單元，M 2樣品中測得72個聚類單元。兩個樣品共有的聚類單元65個，超過聚類單元的70%，說明兩份原料乳樣品中檢出的微生物物種數量雖然有所不同，但大部分微生物相同。

一些微生物能夠在低溫儲存一天后成為原料乳中的優勢菌種，在低溫環境中能夠保持一定繁殖和代謝能力，是影響原料乳品質的關鍵微生物。通過聚類單元的物種注釋信息及各個物種的相對豐度信息，可以直觀找到原料乳樣品中的優勢微生物。根據樣品中相對豐度前十的物種相對豐度信息繪制的物種分類樹如圖2所示。圖2中，左側為圖例，紅色扇形代表樣品M 1，藍色代表樣品M 2；扇形面積大小表示樣品在該分類上相對豐度的比例大??；分類名下方的兩個數字分別表示所有樣品在該分類上的平均相對豐度，前者表示占所有檢出序列的相對豐度，后者表示占樣品中細菌的相對豐度。

圖2 TOP10物種分類樹

分析可知，原料乳中的原核微生物主要分屬三個門，擬桿菌門和厚壁菌門的相對豐度占比超過90%，其中擬桿菌門所占比例最高，擬桿菌門中主要有兩個屬在原料乳樣品中相對豐度較高，分別為金黃桿菌屬和黃桿菌屬。樣品中變形菌門主要包括醋酸桿菌科的醋酸桿菌屬，腸桿菌科的摩根氏菌屬，莫拉菌科的不動桿菌屬和嗜冷桿菌屬以及假單胞菌科的假單胞菌屬。除此之外，樣品中還檢出了少量厚壁菌門的微生物，主要包括乳球菌屬和葡萄球菌屬。

在相對豐度前十的物種中，含量最為豐富的是黃桿菌屬，其相對豐度占所有檢出的細菌的47.66%，其次為假單胞菌屬，相對豐度為39.54%。兩個屬的微生物均為牛乳中常見的嗜冷菌[16]。不動桿菌屬和嗜冷桿菌屬也具有在低溫下繼續生長的能力，相對豐度分別為3.77%和0.55%。

通過對16SrRNA高通量測序結果分析可知，此次采集的原料乳中，嗜冷菌主要來自四個屬，分別為黃桿菌屬、假單胞菌屬、不動桿菌屬和嗜冷桿菌屬。假單胞菌屬是對原料乳危害最大的嗜冷菌之一[17]。假單胞菌及其分泌的耐熱蛋白酶也被當作嗜冷菌耐熱蛋白酶的模板，許多研究者對其進行了深入研究[18-20]。不動桿菌屬和黃桿菌屬除了能夠在低溫環境中繼續生長繁殖，其潛在致病性和耐藥性也受到廣泛關注[21-24]，對牛乳的影響不僅僅是對成品乳質量的威脅，低溫環境下不動桿菌及黃桿菌在牛乳中的相對含量逐漸上升，若在加工設備中其毒素和分泌物不斷累積，除了可能對原料乳品質產生不良影響，還可能引發食品安全問題。

2.2 不同儲存條件下原料乳中嗜冷菌及菌落總數的變化

原料乳從收集入廠到生產期間要求冷卻到4℃貯存，但冷鏈運輸及工廠儲存條件的變化會使原料乳很難嚴格維持在4℃，而原料乳低溫儲存過程中微生物變化情況將直接影響最終產品的質量，因此儲存環節是牛乳品質控制的關鍵。實驗模擬可能的溫度變化分別設置了4，10，15℃貯存原料乳；定時測定嗜冷菌及菌落總數。

原料乳在不同溫度儲存期間菌落總數變化如圖3所示。圖3（a）為4℃和10℃儲存時原料乳菌落總數變化；圖3（b）為15℃儲存時原料乳菌落總數變化。

原料乳中總菌落數在（1.5～1.8）×105mL-1之間，反映出原料乳衛生狀況較好。分析發現，菌落總數的變化隨貯存溫度、貯存時間的變化有顯著差異。4℃貯存72 h后菌落總數仍在1×106mL-1內；10℃貯存64 h后樣品中菌落總數快速增加，貯存72 h后超過國家安全標準2×106mL-1；15℃貯存24 h后菌落總數快速增加，超過國家規定的安全限量。

我國“生乳食品安全標準”中并沒有對嗜冷菌進行限量，但原料乳低溫儲存時嗜冷菌能分泌蛋白酶、脂肪酶等引起牛乳品質劣變。因此嗜冷菌是影響液態奶品質的重要因素。原料乳在不同溫度儲存期間的嗜冷菌數變化情況如圖4所示。

圖3 原料乳菌落總數變化

圖4 不同溫度儲存期間的嗜冷菌數變化情況

原料乳中嗜冷菌含量在1～1.3×105mL-1。不同貯存溫度下，嗜冷菌數變化差別較大。4℃貯存24 h，嗜冷菌數無明顯變化，貯存至32 h嗜冷菌數顯著增加，但后期貯存至72 h并沒有檢測到數量顯著增加；10℃貯存時，24 h時嗜冷菌數已增至1×106mL-1，72 h后超過國家規定的原乳中菌落總數限量值2×106mL-1；15℃貯存8 h時，嗜冷菌數已顯著增加，24 h后嗜冷菌數超過2×106mL-1。

以上結果說明，低溫儲藏過程中嗜冷菌依然可以存活并增殖，4-15℃貯存條件下，隨溫度的升高嗜冷菌的生長繁殖速度迅速增大。雖然在低溫下原料乳中微生物數量增長緩慢，但其多樣性能夠迅速發生變化[25-27]。冷藏前，嗜冷菌僅占原料乳微生物總量的10%左右[28]，16SrRNA高通量測序結果表明4℃冷藏一天后，原料乳中的嗜冷菌相對含量超過了90%，嗜冷菌成為了原料乳中的優勢菌。盡管15℃貯存24 h后菌落總數才超過生乳安全限量標準（2×106CFU/mL），但低溫貯存過程中伴隨嗜冷菌的繁殖生長，嗜冷菌分泌蛋白酶、脂肪酶等的風險增大，極易引起牛乳品質劣變。因此實際運輸和貯存期間應嚴格控制溫度，應盡可能以更低的溫度貯存生乳，以保證生乳的安全衛生，提高乳制品品質。

現行國標中雖然規定了嗜冷菌的計數方法，但其方法培養時間過長，無法滿足企業生產需要。經研究發現，低溫儲存時，原料乳中的嗜冷菌數量和菌落總數能夠呈現一定的線性關系，且儲存溫度越低，菌落總數和嗜冷菌數的相關系數越大[29]。我們的高通量測序結果也發現，4℃貯存24 h的牛乳中嗜冷菌數占總菌的90%，因此實際生產過程中可通過構建菌落總數與嗜冷菌數的線性模型來快速推算原料乳中嗜冷菌的數量。

3 結論

（1）原料乳貯存過程中溫度對細菌增殖的影響很大。4℃儲存條件下，原料乳嗜冷菌數及菌落總數在72 h內并未增至2×106mL-1，10℃和15℃儲存時，原料乳的菌落總數和嗜冷菌數分別在72 h和24 h后超過國家標準規定的安全限量。

（2）嚴格控制原乳入廠后貯存溫度及時間，抑制微生物的生長代謝，保證原料乳良好的衛生狀況是液態乳生產中的關鍵控制點。結合本研究中菌落總數及嗜冷菌數的分析結果，建議原料乳收購后4℃貯存不超過24 h，10℃貯存不超過16 h，15℃貯存不超過8 h。