基于優化sgRNA系統提高海島棉CRISPR/Cas9基因組編輯功效的研究

李繼洋 胡 燕 姚 瑞 代培紅 劉曉東

基于優化sgRNA系統提高海島棉CRISPR/Cas9基因組編輯功效的研究

李繼洋1,2,**胡 燕1,**姚 瑞2代培紅1,*劉曉東1,*

1新疆農業大學農學院 / 新疆農業大學農業生物技術重點實驗室, 新疆烏魯木齊 830052;2石河子大學生命科學院, 新疆石河子 832000

CRISPR/Cas9基因組編輯體系已經在多種作物中被建立, 其最大的優勢在于能簡單高效定向創制突變體。然而, CRISPR/Cas9基因組編輯體系在實際操作過程中經常會出現沒有編輯的情況, 或者靶向編輯目的基因的同時也會引發不同程度的脫靶效應, 這對CRISPR/Cas9基因組編輯技術的運用帶來不利影響。本研究基于前期在海島棉體細胞中建立的CRISPR/Cas9基因組編輯體系, 通過對構建Cas9不同密碼子優化方式、不同PAM位點個數和不同靶位點數量的編輯載體, 來分析比較編輯效率和脫靶效應的差異。結果表明, 2種Cas9密碼子不同優化方式的編輯載體產生的編輯效率和脫靶效應無顯著差異; 優化后的雙PAM位點的編輯效率顯著高于單PAM位點, 且脫靶效率顯著較低; 大部分雙靶序列編輯效率均高于單靶序列且脫靶效率較低。上述研究結果為今后優化CRISPR/Cas9介導的海島棉基因組編輯體系奠定了重要的理論依據。

棉花; CRISPR/Cas9; 編輯效率; 脫靶效率; sgRNA類型

目前, CRISPR/Cas9基因組編輯體系已經在多種作物中被建立[1], 然而對轉基因后代靶位點突變情況檢測發現, 部分物種存在低編輯效率、同義突變等現象[2], 尤其在擬南芥等植物中, 轉基因后代還往往伴隨高頻脫靶效應[2-3]。影響CRISPR/Cas9介導的基因組編輯效率的因素主要源于組成其系統的2個重要元件(Cas9和sgRNA)。前人研究發現, 密碼子不同優化程度的Cas9核酸酶對編輯效率和脫靶效應都具有一定的影響[4-5]。負責招募Cas9的sgRNA包含一段約20 nt的guide RNA, 是引導Cas9靶向切割基因組的重要組成部分, guide RNA的特異性也決定了其脫靶效率[6-7]。

脫靶效應是指由于引導核酸酶的向導DNA (gDNA)或RNA (gRNA)在對基因組靶標序列識別的過程中出現了差錯, 使得核酸酶在與guide RNA高度同源位點處對基因組雙鏈進行切割, 從而造成非目標位點突變。事實上, 這一現象并不僅存在于CRISPR/Cas9系統介導的基因組編輯, 鋅指核酸酶(zinc-finger nucleases, ZFNs)和類轉錄激活效應物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases, TALENs)等基因組編輯技術或NgAgo介導的基因沉默技術同樣存在脫靶效應[8-11], 除此之外, 脫靶效應也影響基因組編輯效率。因此, 靶向編輯效率和脫靶效應是CRISPR/Cas9基因組編輯過程中1對相互對立的結果[12]。

CRISPR/Cas9技術已經在突變體創制過程中表現出絕對優勢, 但由于廣泛存在的脫靶效應, 使其在農業育種研究工作中留下潛在隱患, 對與此相關的農業分子育種工作造成負面影響。為了高效安全地使用這一技術, 就必須采取有效手段, 在保證其靶向編輯效率的同時盡可能降低脫靶效率, 為選育用于種質創新的低脫靶效應的靶向突變體提供技術保障[13-14]。到目前為止已有多個實驗室研究出提高基因組編輯效率和增加基因靶向特異性的方法。Cong等[15]構建了Cas9核酸酶的一種變體Cas9 (D10A), 該變體Cas9只能切割單鏈DNA, 如果要產生雙鏈斷裂, 引發基因突變, 就必須在基因靶位點區結合2條sgRNA。實驗證明, 上述方法能有效降低轉基因T1代的脫靶效應, 或采用基因組雙向編輯技術在目的基因靶位點被編輯的同時使Cas9也被編輯[16-17], 通過減少后代Cas9表達累積量降低脫靶效應。

通過對驅動Cas9蛋白表達的啟動子進行改造及優化, 能顯著提高編輯效率, 降低脫靶效應。例如,選擇卵細胞特異性表達的啟動子EC1.2p或EC1.1p替代常規的CAMV35S或類啟動子, 可以在T1代就能獲得3個基因同時突變的純合體植株, 突變率高達8.3%, 進一步用融合了這2個啟動子關鍵元件的新啟動子去驅動Cas9蛋白的表達, 可以獲得比單個啟動子更高的突變效率, 并且這些突變體中均未檢測到脫靶效應。DMC1在玉米愈傷組織中高表達, 應用DMC1啟動子驅動Cas9, 也能顯著提高基因組編輯的效率, 并且獲得的突變體中也均未檢測到脫靶效應[18]。除此之外, 增加PAM位點的長度也是一種減少脫靶效應的策略。目前已經從不同的細菌物種中分離得到不同的Cas9蛋白, 除SpCas9[19]識別NGG類的PAM位點外, 還有NmeCas9識別NNNNGATT[20]; SaCas9識別NNGRRT[21]; St1Cas9和St2Cas9分別識別NNAGAAW和NGGNG[22]。與SpCas9蛋白相比, 這些不同來源的Cas9均可以增加基因靶向的特異性, 減少脫靶效應。CRISPR-Cpf1是一種V型核酸內切酶, 與Cas9蛋白相比, CRISPR-Cpf1系統在動植物應用中表現出更低的或未發現脫靶效應[23]。除了上述不同來源的Cas9可以增加基因靶向的特異性, 減少脫靶效應外, 在野生型SpCas9蛋白的基礎上, 篩選高特異性Cas9蛋白變異體的研究也取得了良好的結果, 如eSpCas9[5]、Cas9- HF[3]、evoCas9[24]、HypaCas9[25]和Sniper-Cas9[26]。其中evoCas9、HypaCas9和Sniper-Cas9不僅顯著增加了基因靶向的特異性, 同時也提高了基因的編輯效率。上述提高基因組編輯效率和增加基因靶向特異性的方法, 多集中在Cas9蛋白方面, 而從sgRNA入手的研究還鮮見報道。2015年在線蟲中研究發現與單個PAM位點相比, 連續2個PAM位點可以顯著提高基因的編輯效率, 但脫靶率是否也同步提高并不清楚[27]。

在植物中, CRISPR/Cas9系統在擬南芥、水稻應用較為廣泛, 但在棉花[28-29]中CRISPR/Cas9系統的報道還較少見, 其中在海島棉中還未見有報道能高效表達的CRISPR/Cas9系統。海島棉的組織再生存在體細胞胚胎發育困難、轉化期長、效率低等一些問題, 并且有研究發現陸地棉經Cas9編輯后, 組織再生的過程中有大量的體細胞變異會影響編輯效率[28], 這對初步構建海島棉CRISPR/Cas9基因組編輯增進了困難, 因此, 使用瞬時轉化方法快速驗證構建的CRISPR/Cas9基因組編輯載體的有效性是最佳的方法。本研究在基于前期海島棉原生質體中建立的CRISPR/Cas9基因組編輯體系[30], 針對Cas9表達量和sgRNA的優化設計, 對比轉化不同sgRNA個數和不同類型sgRNA對基因組編輯效率和脫靶效應的影響進行了初步分析和試驗來驗證上述假設。以期為今后利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術進行精確的分子設計育種奠定一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

新海16胚性愈傷組織由新疆農業大學農業生物技術重點實驗室提供, 用于制備海島棉原生質體, 載體U6-4P::-sgRNA、U6-5P::-sgRNA、()(簡稱SK載體)、pUC19均由本實驗室保存, 2種不同密碼子優化的基因(和)分別由中國科學院上海生命科學研究院和中國農業科學院生物技術研究所惠贈, 限制性內切酶和DNA聚合酶均為NEB和Thermo公司產品, 纖維素酶和離析酶由IUZMI株式會社提供, 引物合成及測序由武漢昆泰瑞有限公司(新疆分公司)完成。

1.2 海島棉編輯載體構建

1.2.1 基礎載體構建 以新海16基因組DNA為模板克隆獲得和基因部分序列用于靶序列設計, 靶序列的設計除滿足其基本要求外[29], 選擇在和基因組CDS區域不超過20 bp長度任意片段的3￠末端含有連續2個5￠NGG3￠(N代表任意堿基)位點的區域, 分別設計包含2個NGG位點(No shift sgRNA)和包含1個NGG (Shift sgRNA)位點的sgRNA序列, 引物序列如表1, 靶序列設計模式如圖1。

將經過DNA復性反應后的靶序列分別連接于以I酶切獲得的U6-4P::-sgRNA和U6-5P::-sgRNA線性化載體。退火反應體系為20 μL, 包括10 μmol L-1的上下游靶序列各10 μL。復性程序為95℃至20℃, 每5 s降低0.5℃。經測序驗證上述(shift)U6-4P(5P)::-sgRNA和(shift)U6-4P::-sgRNA2質粒構建正確后備用。

表1 本研究使用的引物信息

圖1 No shift sgRNA和Shift sgRNA靶序列特點及其作用模式

紅框標識為CRISPR/Cas9作用的PAM位點。

The red box identifies the PAM site for the action of CRISPR/Cas9.

1.2.2 編輯載體組裝 以I、I酶切U6-5P::-sgRNA1載體, 同時以IdIII酶切U6-4P::-sgRNA2和U6-4P::- sgRNA2載體, 以I、dIII酶切pUC19載體, 三片段連接構建U6-5P::-sgRNA1-U6- 4P::-sgRNA2-pUC19-U6-5P::-sgRNA1-U6-4P:sgRNA2-pUC19過渡載體, 以I、dIII酶切上述過渡載體和Cas9-I編輯載體, 構建U6-5P::-sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2- Cas9-I和U6-5P::-sgRNA1-U6-4P::- sgRNA2-Cas9-I編輯載體(圖2-A)。以I、dIII酶切U6-5P::-sgRNA1載體, 同時以I、d III酶切U6-4P::-sgRNA2和U6-4P::-sgRNA2載體, 以I、I酶切SK載體, 3個片段連接構建U6-5P::-sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2- SK和U6-5P::-SgRNA1-U6-4P::-sgRNA2- SK過渡載體, 以I、I酶切上述過渡載體和Cas9II編輯載體, 構建U6-5P::-sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2-Cas9II和U6-5P::-sgRNA1-U6- 4P::-sgRNA2-Cas9II編輯載體(圖2-B), 以U6- 5P::-sgRNA1-Cas9-I和U6-5P::-sgRNA1- Cas9II及其連接2種基因不含靶序列U6- 5P(4P):: sgRNA為對照。構建Shift sgRNA類型編輯載體方法同上。

圖2 海島棉基因組編輯載體結構示意圖

A: 含Cas9I編輯載體; B: 含Cas9II編輯載體。

A: editing vector containing Cas9I; B: editing vector containing Cas9II.

1.3 海島棉原生質體制備及轉化

1.3.1 富集編輯載體核心片段 經酶切檢測正確的編輯載體利用富集引物(Cas9I編輯載體采用FJ-1引物, Cas9II編輯載體采用FJ-2引物), 采用超保真DNA聚合酶(北京全式金)擴增編輯載體的核心區域, 擴增體系參照說明書推薦反應體系, PCR產物純化參照本實驗室已有成熟體系[29], 純化后的PCR產物用雙蒸水溶解并調整濃度至0.5~1.0 μg μL-1,-20℃保存備用。

1.3.2 原生質體的制備與轉化 取新海16擴繁培養約15 d的胚性愈傷組織, 利用本實驗室建立的改良CPW雙酶法制備原生質體[31]。取10 μg富集的PCR產物直接轉化原生質體, 方法參照擬南芥原生質體轉化方法[32], 過程略有改進(懸浮原生質體不使用MMG溶液), 為獲得較高轉化率, 本研究在原有成熟體系基礎上優化了海島棉胚性愈傷組織與酶解液最適反應比例(每毫升酶解液加入約0.45 g海島棉胚性愈傷組織), 轉化后的原生質體于28℃, 50 r min-1避光孵育48 h。

1.4 內源靶基因編輯效應檢測

將孵育48 h的原生質體懸浮液以1000 ×離心1 min, 去盡上清, 用于提取原生質體沉淀的基因組DNA, 方法參照Trans Easypure plant Genomic DNA Kit (北京全式金)說明書要求。除轉化U6- 5P::-sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2-Cas9I和U6-5P::-sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2- Cas9II載體提取的基因組DNA直接用相應的Test引物(Test-sg1F和Test-sgR)進行PCR擴增外, 轉化其余編輯載體提取的基因組DNA采用先酶切后PCR方式檢測, PCR體系共20 μL, 包含ddH2O 11.2 μL、5×Phusion buffer 4 μL、2.5 mmol L-1dNTP 1.6 μL、上下游引物各1 μL、DNA模板1 μL、Phusion超保真DNA 聚合酶0.2 μL。擴增程序為94℃ 2 min; 98℃ 30 s, 60℃ 30 s, 72℃ 4 min 30 s, 35個循環; 72℃ 7 min。擴增得到的PCR產物經EasyPure Quick Gel Extraction Kit (北京全式金)回收后, 連接(北京全式金)載體, 轉化大腸桿菌Trans T1, 經菌落PCR和酶切鑒定正確后, 將鑒定正確的單克隆菌液進行序列測定, 測序序列采用DNAstar和DNAMAN軟件進行比對分析, 統計基因組靶序列20 bp區域堿基突變個數并計算相應區域堿基突變頻率, 通過計算得到編輯效率, 利用SPSS 19.0統計軟件進行差異顯著性分析, 對比每種類型編輯載體轉化Shift sgRNA和NO shift sgRNA靶序列類型對應的單靶序(U6-5P::- sgRNA1)以及雙靶序(U6-5P::-sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2-U6-5P::-sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2)編輯效率差異的顯著性。

1.5 脫靶效率分析

根據設計的Guide RNA序列, 瀏覽華中農業大學CRISPR sgRNA設計網站(http://crispr.hzau.edu. cn/cgi-bin/CRISPR2/CRISPR)[6], 尋找本研究設計使用的-sgRNA1和Shift-sgRNA1靶序列, 并分別預測得到脫靶率較高的2種靶序列(表2), 利用該序列, 登錄中國農業科學院棉花基因組數據庫(https:// cgp.genomics.org.cn/), 通過BLAST獲得每條預測的脫靶序列對應的同源序列, 再通過Mapping View將上述核苷酸序列定位到具體的染色體進而獲得涵蓋該脫靶序列的基因組序列, 設計用于檢測脫靶率的引物(表3)。

表2 脫靶序列預測信息

加粗部分為靶序列PAM位點。Bold part shows the target sequence PAM sites.

表3 脫靶序列檢測引物信息

以上述轉化不同編輯載體核心片段原生質體提取的基因組DNA為模板, 擴增獲得涵蓋脫靶序列的片段, 克隆該序列, 方法參照編輯效應分析方法, 將菌落PCR鑒定正確的單克隆菌液進行序列測定, 測序序列采用DNAstar軟件進行比對分析, 統計基因組涵蓋脫靶序列20 bp區域中堿基突變個數并計算相應區域堿基突變頻率, 利用SPSS 19.0統計軟件進行單因素方差分析, 對比分別轉化Shift sgRNA和No shift sgRNA靶序列類型對應的單靶序列和雙靶序列目標片段脫靶效率的差異是否具有顯著性。

1.6 sgRNA及其Cas9表達分析

收集轉化后孵育48 h的原生質體, 參照Biospin Plant Total RNA Extration Kit (DNA-free)試劑盒(Bioer Technology Co, Ltd.)說明書立即提取總RNA, 將質檢合格用于合成cDNA第1條鏈的總RNA質量調整至1 μg逆轉錄為cDNA, 方法參照TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix (北京全式金)試劑盒說明書, 將合成的cDNA用于、-sgRNA1、-sgRNA2、-sgRNA2半定量RT-PCR檢測分析。

2 結果與分析

2.1 編輯載體的構建

采用雙酶切方式(IdIII)檢測上述構建的編輯載體, 酶切結果符合預期設計, 證明分別連接不同的U6-5P--sgRNA1、U6- 5P::-sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2和U6- 5P::-sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2的編輯載體均構建成功(圖3)。連接Shift相關靶序列的上述編輯載體鑒定結果與預期相符。

2.2 原生質體制備

基于前期本實驗室建立的較成熟的原生質體制備體系, 轉化前后原生質體形態如圖4, 經計算每毫升轉化前原生質體數量達到約4×106個左右, 鏡檢視野內, 原生質體未出現明顯畸形或破壁現象, 表明制備的原生質體能夠用于編輯效率、脫靶效率以及半達量RT-PCR的檢測分析。

2.3 編輯效率結果分析

2.3.1 海島棉基因組編輯檢測分析 將轉化U6-5P--sgRNA1和轉化U6-5P::- sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2提取的基因組DNA采用酶切(I、I)后PCR方式檢測, 轉化U6-5P::-sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2采用直接PCR方式檢測, 結果如圖5, 轉化Cas9 I型靶序列編輯載體的原生質體DNA酶切后PCR檢測存在擴增條帶, 對照則未出現明顯條帶, 初步證明, 轉化U6-5P--sgRNA1和轉化U6-5P::- sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2編輯載體造成海島棉基因組相應的靶位點突變, 將上述PCR產物克隆后測序結果(圖6和圖7)分析發現, 所有轉化靶序列的原生質體均檢測到堿基突變現象, 轉化與之對應空載體的原生質體未檢測到堿基突變現象, 對比轉化不同載體的原生質體, 雖然靶序列作用位點相同, 但引發堿基突變的個數和位置均不同。分析后認為, 可能是轉化不同編輯載體引起不同程度編輯效應造成的結果。針對轉化Shift相關靶序列的基因組編輯載體, 也獲得與上述相同的實驗結果, 相比同一位點2種(No shift sgRNA和shift sgRNA)不同靶序列類型, 轉化No Shift靶序列的原生質體其編輯效率高于轉化Shift靶序列, 增幅為20.0%~49.6% (表4)。轉化Cas9II型編輯載體結果與上述類似。

圖3 海島棉編輯載體酶切檢測結果

A:U6-5P--sgRNA1編輯載體酶切檢測結果; M1為1 kb plus marker。B: 1和2分別為U6-5P::-sgRNA1-U6- 4P::-sgRNA2和U6-5P::-sgRNA1-U6-4P::- sgRNA2編輯載體酶切檢測結果; M2為2 kb plus II marker。

A:U6-5P--sgRNA 1 editing vector digestion test results; M1 is 1 kb plus marker. B:U6-5P::-sgRNA1-U6- 4P::-sgRNA2 andU6-5P::-sgRNA1-U6-4P::- sgRNA2 edit vector restriction test results; M2 is 2 kb plus II marker.

圖4 海島棉原生質體制備及其轉化結果

A: 海島棉轉化前原生質體鏡檢結果; B: 海島棉轉化U6-5P::-sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2-Cas9I載體后原生質體鏡檢結果。標尺為40 μm。

A: microscopic examination ofL. protoplast before transformation; B: after protoplast microscopy results transformation ofU6-5P::-sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2-Cas9I vector. Bar = 40 μm.

圖5 海島棉轉化不同靶序列編輯效應檢測結果

A: 1為轉化U6-5P--sgRNA1-Cas9I載體酶切前直接PCR擴增結果, 2為轉化U6-5P--sgRNA1-Cas9I載體酶切后PCR擴增結果, 3為轉化U6-5P-sgRNA1-Cas9I載體酶切前直接PCR擴增結果, 4為轉化U6-5P-sgRNA1-Cas9I載體酶切后PCR擴增結果。B: 1為轉化U6-5P::-sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2-Cas9I直接PCR擴增結果, 2為轉化U6-5P-sgRNA1-U6-4P-sgRNA2- Cas9I直接PCR擴增結果。C: G1、E1為轉化U6-5P::-sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2-Cas9I酶切前直接PCR擴增結果, G2、E2為轉化U6-5P::-sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2-Cas9I酶切后PCR擴增結果, G3、E3為轉化U6-5P-sgRNA1-U6-4P- sgRNA2-Cas9I酶切前直接PCR擴增結果, G4、E4為轉化U6-5P-sgRNA1-U6-4P-sgRNA2-Cas9I酶切后PCR擴增結果。M1為1 kb plus marker, M2為2 kb plus II marker。

A: 1 is the result of direct PCR before transformation ofU6-5P--sgRNA1-Cas9I vector, 2 is PCR amplification after transformation ofU6-5P--sgRNA1-Cas9I vector As a result, 3 was obtained by direct PCR amplification before transformation ofU6-5P-sgRNA1- Cas9I vector and 4 was PCR amplification after transformation withU6-5P-sgRNA1-Cas9I vector. B: 1 was transformed withU6- 5P::-sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2-Cas9I direct PCR amplification results, 2 for the transformation ofU6-5P-sgRNA1-U6- 4P-sgRNA2-Cas9I direct PCR amplification results. C: G1 and E1 are the results of direct PCR before transformation ofU6-5P::-sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2-Cas9I, G2 and E2 are the results of transformation ofU6-5P::-sgRNA1-U6-4P::- sgRNA2-Cas9 digestion after PCR amplification results, G3 and E3 to transformU6-5P-sgRNA1-U6-4P-sgRNA2-Cas9I digestion before direct PCR amplification results, G4 and E4 to transformU6-5P-sgRNA1-PCR amplification results afterU6-4P-sgRNA2-Cas9 digestion. M1 is 1 kb plus marker, M2 is 2 kb plus II marker.

圖6 海島棉轉化不同類型靶序列堿基突變測序結果

A: 轉化U6-5P--sgRNA1-Cas9I載體靶位點編輯效應測序檢測結果; B: 轉化U6-5P::-sgRNA1-U6-4P::- sgRNA2-Cas9I載體靶位點編輯效應測序檢測結果; C: 轉化U6-5P::-sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2-Cas9I載體靶位點編輯效應測序檢測結果; D: 轉化U6-5P::-sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2-Cas9I載體-sgRNA2靶位點編輯效應測序檢測結果; E: 轉化U6-5P::-sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2-Cas9I載體-sgRNA1靶位點編輯效應測序檢測結果。紅色框為PAM位點的位置。

A: Transformation ofU6-5P--sgRNA 1-Cas9I vector target site editing effect sequencing detection results; B: TransformationU6- 5P::-sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2-Cas9I vectortarget site editing effect sequencing detection results; C:U6-5P::- sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2-Cas9I vectortarget site editing sequencing results; D: transformationU6-5P:-sgRNA1-U6- 4P::-sgRNA2-Cas9I vector-sgRNA2 target site editing effect sequencing test results; E: transformationU6-5P::-sgRNA1-U6- 4P::-sgRNA2-Cas9I vector-sgRNA1 target site editing effect sequencing test results. The red box is the location of the PAM site.

圖7 海島棉轉化不同類型靶序列堿基突變部分測序峰圖

A: 轉化U6-5P--sgRNA1-Cas9I靶序列基因組堿基突變測序峰圖; B: 轉化U6-5P::-sgRNA1-U6-4P::- sgRNA2-Cas9I靶序列基因組堿基突變測序峰圖; C: 轉化U6-5P::-sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2-Cas9I靶序列基因組堿基突變測序峰圖。

A: baseline mutation map of genomes transformed withU6-5P--sgRNA1-Cas9I target sequence; B: transformation ofU6- 5P::-sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2-Cas9I target sequence; C: baseline mutation sequencing of the genome of transformedU6- 5P::-sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2-Cas9I target sequence.

表4 轉化不同靶序列編輯效率統計結果

表格中分子代表突變個數, 分母代表克隆測序個數; 概率值均為平均值。

The number of molecules in the table represents the number of mutations, and the denominator represents the number of clones; the probabi-lity values are the average.

2.3.2 Cas9及其相關sgRNA表達量檢測 半定量RT-PCR檢測轉化靶序列和對照編輯載體原生質體中Cas9及其對應sgRNA表達量, 結果如圖8, 在轉化包括對照編輯載體的原生質體中, Cas9和相應sgRNA表達量均無明顯差異, 表明不同載體轉化的原生質體中Cas9和相應sgRNA表達量均無明顯差異。

2.4 脫靶效應檢測結果

對轉化不同類型靶序列編輯載體的海島棉基因組進行脫靶率鑒定后發現, 在海島棉原生質體瞬時表達的基因組編輯過程中也存在一定概率的脫靶現象(圖9、圖10和圖11), 轉化不同類型靶序列的編輯載體, 脫靶效應存在差異, 這說明不同類型靶序列對海島棉基因組編輯效應影響不同, 對比編輯效率較高的靶序列類型發現其脫靶效率并未相應升高, 同時對比轉化單靶序列和雙靶序列類型的編輯載體,其脫靶效率同樣存在差異且轉化單靶序列脫靶效率高于雙靶序列(表5), 同時, 轉化No shift sgRNA靶序列脫靶率顯著低于Shift sgRNA (表5)。

3 討論

3.1 靶序列類型對編輯效率影響

CRISPR/Cas9基因組編輯技術已在各種動物、植物、微生物和人中得到了廣泛的應用。但基因編輯的脫靶效應和編輯效率低, 甚至常常不編輯的現象也引起了科學家們的關注。一系列提高基因編輯效率和增加基因靶向特異性的方法陸續研發出來, 這些方法多集中在Cas9蛋白方面[19-26], 而從sgRNA入手的研究還鮮見報道。在線蟲中研究發現, 與單個NGG的PAM位點(Shift)相比, 連續2個NGG位點(No shift)可以顯著提高基因的編輯效率。那么在植物體內No shift是否也能顯著提高基因的編輯效率？為此本文開展了相關的研究工作。根據在3個基因靶位點、5組獨立的轉化編輯實驗數據結果顯示, 在海島棉原生質體內優化后, No shift編輯效率較對應的Shift的編輯效率有所提高, 提高幅度為20.0%~49.6%。這與在秀麗隱桿線蟲中報道的結果相似[33], 只是提高的幅度低于線蟲。連續2個NGG位點(No shift)可以顯著提高基因的編輯效率, 推測No shift sgRNA類型靶序列引導Cas9發揮基因組編輯時, Cas9在確定最適作用位點時需要在基因組的作用區域發生滑動, 該過程類似于RNA聚合酶識別啟動子的過程[34-35], 連續的NGG堿基組成相當于雙PAM結構, 可能增加了Cas9識別切割位點的效率, 從而使得Cas9-sgRNA-DNA編輯復合體更穩定, 編輯效率也因此更高。另外在對編輯效率統計時還發現, 轉化不同類型雙靶序列編輯效率均高于單靶序列, 原因可能是更多的DNA雙鏈斷裂激活了細胞體內的錯誤傾向修復的SOS應急反應, 使細胞有了更高的突變率[36]。但該結論還需要進一步擴大實驗規模來驗證。Cas9和相應sgRNA的表達量在不同載體轉化原生質體細胞內沒有明顯差異, 表明出現的編輯效率的差異不是因為基因表達差異引起的, 而是因為sgRNA的選擇不同。

圖8 轉化海島棉不同類型靶序列的原生質體Cas9及對應sgRNA半定量檢測結果

1、2分別為轉化U6-5P--sgRNA1-Cas9I和對照編輯載體檢測-sgRNA1, 3、4為U6-5P--sgRNA1-U6-4P--sgRNA2-Cas9I編輯載體分別檢測-sgRNA1、- sgRNA2, 5、6為轉化U6-5P::-sgRNA1-U6-4P::- sgRNA2-Cas9I分別檢測-sgRNA1、-sgRNA2, 7為轉化與U6-5P-sgRNA1-4P-sgRNA1Cas9I對照編輯載體檢測- sgRNA1。

1 and 2 is transformedU6-5P--sgRNA1-Cas9I edit vector and Control edit vector were detected-sgRNA1, 3 and 4 is transformedU6-5P--sgRNA1-U6-4P::-sgRNA1- Cas9I edit vector were detected-sgRNA1,-sgRNA2, 5 and 6 is transformedU6-5P--sgRNA1-U6-4P::- sgRNA2-Cas9I edit vector were detected-sgRNA1,- sgRNA2, 7 is transformedU6-5P-sgRNA1-4P-sgRNA1-Cas9I control edit vector were detected-sgRNA1.

圖9 海島棉脫靶目標序列擴增檢測

轉化No shift sgRNA類型靶序列: 1、2分別為轉化U6-5P--sgRNA1-Cas9I和對照編輯載體, 3、4為U6-5P--U6-4P-sgRNA1--sgRNA2-Cas9I和對照編輯載體, 5、6為轉化U6-5P::-sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2 -Cas9I和對照編輯載體。轉化Shift sgRNA類型靶序列: 1、2分別為轉化ShiftU6-5P--sgRNA1-Cas9I和對照編輯載體, 3、4為ShiftU6-5P--U6-4P-sgRNA1--sgRNA2- Cas9I和對照編輯載體, 5、6為轉化ShiftU6-5P::- sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2-Cas9I和對照編輯載體。

Transform No shift sgRNA type target sequence: 1 and 2 is transformedU6-5P--sgRNA1-Cas9I edit vector and Control edit vector, 3 and 4 is transformedU6-5P--sgRNA1-U6- 4P::-sgRNA1-Cas9I edit vector and Control edit vector, 5 and 6 is transformedU6-5P--sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2- Cas9I edit vector and Control edit vector. Transform Shift sgRNA type target sequence: 1 and 2 is transformed ShiftU6-5P--sgRNA1-Cas9I edit vector and Control edit vector, 3 and 4 is transformed ShiftU6-5P--sgRNA1-U6-4P::-sgRNA1- Cas9I edit vector and Control edit vector, 5 and 6 is transformed ShiftU6-5P--sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2-Cas9I edit vector and Control edit vector.

3.2 靶序列類型對脫靶效率影響

對轉化不同類型靶序列后脫靶效應測序統計發現, 轉化雙靶序列脫靶效率顯著低于單靶序列, 推測上述原因, 一方面, 由轉化不同數量靶序列結果分析, 轉化雙靶序列進行基因組編輯時, 由于Cas9在細胞內的表達量基本相似(從Cas9半定量RT-PCR結果可以得出), Cas9核酸酶在同一細胞內需同時編輯2個基因組位點, 相比單一位點基因組編輯(轉化一個靶序列類型), Cas9作用更加分散, 冗余性更低, 在發揮基因組編輯效應時, 雙靶序列對Cas9蛋白的競爭作用強于單靶序列, 作用于脫靶靶序列的Cas9蛋白效應相比單靶序列更弱, 因此造成的脫靶效率相應較低。另一方面, No shift sgRNA類型靶序列在設計過程中選擇3￠末端帶有連續“NGG”結構作為候選靶序列, 使得No shift sgRNA靶序列與基因組匹配特異性較Shift sgRNA靶序列類型特異性提高約16倍(基因組具有連續5￠-NGG-3￠結構的位點數目少于單一NGG結構), 同時由No shift sgRNA靶序列產生的脫靶序列與基因組匹配度特異性降低了約256倍, No shift sgRNA靶序列與基因組匹配度提高有利于增強sgRNA與基因組結合穩定性, 同時細胞內相應sgRNA表達量仍處于同一水平(從sgRNA半定量RT-PCR結果可以得出), 因此編輯效率也相應提高, 從降低脫靶效率角度, No shift sgRNA靶序列對避免脫靶的貢獻率更加顯著。

圖10 海島棉脫靶目標序列突變檢測

A: OTtest-SG1-2引物檢測; 1為轉化ShiftU6-5P-- sgRNA1-Cas9I編輯載體, 2為ShiftU6-5P--U6-4P- sgRNA1--sgRNA2-Cas9I編輯載體, 3為轉化ShiftU6- 5P::-sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2-Cas9I編輯載體。 B: OTtest-G1-2引物檢測; 1為轉化U6-5P--sgRNA1-Cas9I編輯載體, 2為U6-5P--U6-4P-sgRNA1--sgRNA2- Cas9I編輯載體, 3為轉化U6-5P::-sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2-Cas9I編輯載體。C: OTtest-SG1-1引物檢測; 1為轉化ShiftU6-5P--sgRNA1-Cas9I編輯載體, 2為ShiftU6-5P--U6-4P-sgRNA1--sgRNA2-Cas9I編輯載體, 3為轉化ShiftU6-5P::-sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2- Cas9I編輯載體。

A: OTtest-SG1-2 primer detection; 1 is transformed ShiftU6- 5P--sgRNA1-Cas9I edit vector, 2 is transformed ShiftU6- 5P--sgRNA1-U6-4P::-sgRNA1-Cas9I edit vector, 3 is transformed ShiftU6-5P--sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2- Cas9I edit vector. B:OTtest-G1-2 primer detection; 1 is transformedU6-5P--sgRNA1-Cas9I edit vector, 2 is transformedU6- 5P--sgRNA1-U6-4P::-sgRNA1-Cas9I edit vector, 3 is transformedU6-5P--sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2-Cas9I edit vector. C: OTtest-SG1-2 primer detection; 1 is transformed ShiftU6-5P--sgRNA1-Cas9I edit vector, 2 is transformed ShiftU6-5P--sgRNA1-U6-4P::-sgRNA1-Cas9I edit vector, 3 is transformed ShiftU6-5P--sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2- Cas9I ditvector.

圖11 海島棉脫靶目標序列測序峰圖

A、B、C分別為OTtest-SG1-2、OTtest-G1-2、OTtest-SG1-1引物擴增轉化下圖對應載體得到的目標片段測序結果。紅框標識為堿基突變位點。

A, B, and C are OTtest-SG1-2, OTtest-G1-2, and OTtest-SG1-1 primers to transform the sequencing result of the target fragment amplified by the corresponding vector in the figure below, respectively. The red box identifies the base mutation site.

表5 轉化不同靶序列脫靶效率統計結果

長期以來, 棉花功能基因組學研究由于缺乏適宜創制突變體的方法, 使得對棉花功能基因挖掘及其分子育種工作都造成嚴重影響。棉花遺傳轉化由于操作困難, 受基因型影響限制了棉花功能基因組學研究工作。CRISPR/Cas9基因組編輯技術的出現為棉花功能基因組學研究拓寬了思路, 有利于針對性地創制棉花突變體。隨著該技術在近幾年發展逐漸趨于成熟, CRISPR/Cas9技術也正如當初人類基因組計劃, 可以暢想, CRISPR/Cas9技術也必將呈現出一個以高效、精準、高通量基因編輯為代表的后基因組編輯時代。然而目前, 棉花基因組編輯研究面臨著與擬南芥等物種相同的現象, 如何在棉花中實現精準高效的基因組編輯, 需要對CRISPR/Cas9基因組編輯系統進一步優化, 提高編輯效率, 降低脫靶效率, 本研究為利用CRISPR/Cas9技術對棉花功能基因組學研究奠定了一定的基礎。

4 結論

轉化不同類型雙靶序列編輯效率大部分顯著高于單靶序列(轉化-sgRNA1--sgRNA2和Shift-sgRNA1--sgRNA2差異不顯著), 其對應的脫靶效率較單靶序列均有所降低, 轉化No shift sgRNA類型靶序列編輯效率顯著高于轉化Shift sgRNA。

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Enhancing CRISPR/Cas9 genomic editing efficiency based on optimization of sgRNA ofL.

LI Ji-Yang1,2,**, HU Yan1,**, YAO Rui2, DAI Pei-Hong1,*, and LIU Xiao-Dong1,*

1Agricultural College, Xinjiang Agricultural University / Key Laboratory of Agricultural Biotechnology, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052, Xinjiang, China;2Life Sciences College, Shihezi University, Shihezi 832000, Xinjiang, China

The CRISPR/Cas9 genome editing system has been established in many crops. The advantages of its directional creation of mutants are increasingly favored by researchers. However, the CRISPR/Cas9 genome editing technology targets the editing of the target gene and also triggers off-target effects at different frequencies, which determine the reliability of the genome editing system. This study was based on the previous CRISPR/Cas9 genome editing system established in the island-cotton somatic cells. Edit the vector by constructing different codon optimization methods for Cas9, different numbers of PAM sites and different target sites, and the difference in editing efficiency and off-target effect were analyzed and compared. There was no significant difference in editing effects and off-target effects caused by Cas9-edited vectors with different optimal codons. The partially double-sgRNA had significantly higher editing efficiency and significantly lower off-target efficiency than the single sgRNA; the editing efficiency of the transformed No shift sgRNA target sequence was significantly higher than that of the Shift sgRNA and the former had a significant decrease in off-target efficiency relative to the latter. Therefore, using No shift sgRNA type target sequence can effectively improve the editing efficiency and significantly reduce the off-target efficiency, thus laying a theoretical foundation for optimizing the CRISPR/Cas9mediated island cotton genome editing system and accurately and efficiently creating island cotton functional gene mutants in the future.

cotton; CRISPR/Cas9; editing efficiency; off-target efficiency; sgRNA type

本研究由南京農業大學-新疆農業大學聯合基金項目(KYYJ201603)和新疆農業大學作物學重點學科發展基金項目資助。

This study was supported by the Nanjing Agricultural University-Xinjiang Agricultural University Joint Fund Project (KYYJ201603) and Xinjiang Agricultural University Crop Science Key Discipline Development Fund Project.

劉曉東, E-mail: xiaodongliu75@aliyun.com; 代培紅, E-mail: 40836520@qq.com

**同等貢獻(Contributed equally to this work)

lijiyangbio@163.com; 胡燕, E-mail: 532084683@qq.com

2018-10-16;

2019-05-12;

2019-05-31.

10.3724/SP.J.1006.2019.84130

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20190530.1035.006.html