實時熒光定量PCR檢測人感染狂犬病病毒的分析報告

何芝菲

摘 ? ?要：狂犬病是一種由狂犬病病毒引起的烈性傳染病。本試驗通過實時熒光定量PCR技術對一例疑似人感染狂犬病病毒的病例分7個時段采集其尿液及唾液標本進行實驗室檢測。結果顯示，7個唾液樣本狂犬病病毒均為陽性，7個尿液樣本中5個樣本為陽性，2個樣本為陰性，唾液樣本Ct值明顯優于尿液樣本。本試驗對實時熒光定量PCR技術應用到臨床檢測狂犬病病毒具有重要的參考價值。

關鍵詞：狂犬病病毒;實時熒光定量PCR;檢測

中圖分類號：S852.65 ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ? ? ? ? 文章編號：1004-7344（2019）03-0272-02

狂犬病（rabies）是由狂犬病毒（rabiesvirus，RABV）所致的人獸共患急性傳染病，發病后死亡率接近100%。全球每年約有5.5萬人死于狂犬病，我國是狂犬病高發地區，因感染狂犬病死亡的人數居世界第二[1]。在我國，狂犬病是國家重點防控的乙類傳染病。近年來，由于我國養犬、貓等寵物的家庭日漸增多，該病的發病率呈上升趨勢[2]。據中國疾病預防控制中心2017年的最新統計，2017年全國狂犬病發病數為516人，死亡502人。

狂犬病毒屬于彈狀病毒（Rhabdoviridae）狂犬病毒屬，是單股負鏈RNA病毒，基因組長度為11928～11932nt，編碼5種蛋白結構，5種蛋白對應5種結構基因編碼，其中N基因具有毒株間的相對保守性和高拷貝復制性，是分子診斷的目標序列[3]。近年來，隨著分子生物技術的迅猛發展，核酸診斷技術被應用到狂犬病的診斷中。實時熒光定量PCR（Real-TimePCR）是基于傳統PCR上發展起來的新技術，具有實時監測核算拷貝數量、靈敏度高、檢測速度快等優點，被廣泛應用于病毒性病原體的快速檢測中[4]。目前，國內鮮有采用實時熒光定量PCR技術對人體感染狂犬病病毒樣本進行檢測的報道。本試驗通過實時熒光定量PCR技術對一例人感染狂犬病病毒的病例進行取樣檢測，旨在為實時熒光定量PCR技術應用到臨床檢測狂犬病病毒提供參考。

1 ?材料與方法

1.1 ?標本信息

患者劉某，男，53歲，重慶市潼南區人。該患者于2018年7月被犬咬傷手臂，暴露程度Ⅲ度，傷口未處理。劉某于2018年11月28日出現煩躁、恐水、怕風、抽出等癥狀，并于12月1日入院。2018年12月3日晚間19點至4日早上7點期間，時隔2h對患者中段尿及唾液進行采集，共計14個樣本（1～7號為尿液樣本，8～14號為唾液樣本），采集后的樣品于-20℃下保存。

1.2 ?試劑與儀器

病毒核酸提取試劑盒（磁珠法）和狂犬病毒核酸檢測試劑盒（熒光PCR法）均購自江蘇碩世生物科技有限公司，Real-TimePCRSystem（stepone），全自動核酸提取儀（SSNP-2000A）。

1.3 ?方 法

1.3.1 ?核酸提取

將樣品于室溫條件下融凍，向病毒核酸提取試劑盒對應孔位分別加入樣品200μl，置于全自動核酸提取儀中進行核酸提取，具體操作見說明書。提取完成后吸出樣品核酸于保存管中，-20℃下保存。

1.3.2 ?實時熒光定量PCR反應

①反應體系：每人份PT-PCR反應液7.5μl，酶混合液5μl，狂犬病反應液4μl，去RNA酶水3.5μl，樣品5μl，總體積25μl。②反應條件：逆轉錄反應50℃30min，預變性95℃5min，變性95℃10s，退火、延伸及檢測熒光55℃40s45個循環。

1.3.3 ?結果判定方法

（1）陽性對照：Ct≤30且擴增曲線呈典型S型顯示。

（2）陰性對照：無典型S型擴增曲線顯示。

（3）樣本陽性：Ct≤35且曲線呈S型。若樣本檢測結果35（4）樣本陰性：Ct>38或者未檢出。

2 ?結 果

2.1 ?實時熒光PCR對尿液樣品檢測結果

對7個時段采集的病人中段尿樣品進行實時熒光定量PCR檢測，結果見圖1，由圖可知2號和6號樣本為陰性，其余樣本實時熒光定量PCR的Ct值分別為1號：35.68，3號：35.77，4號：36.63，5號：36.12，7號：35.92。

2.2 ?實時熒光PCR對唾液樣品檢測結果

對7個時段采集的病人唾液樣品進行實時熒光定量PCR檢測，結果見圖2，由圖可知7個唾液樣本均含有狂犬病病毒，各樣本實時熒光定量PCR的Ct值分別為8號：30.12，9號：31.22，10號：30.91，11號31.75，12號：29.33，13號：29.89：14號29.78。

3 ?討 論

本試驗采用實時熒光定量PCR方法對以一例真實發病的病人7個時段唾液及尿液為樣本進行檢測。由結果可知尿液樣本中2號和6號樣本結果為陰性，其余時段尿液均有病毒檢出，而7個唾液樣本所有時均為陽性，且曲線的CT值明顯優于尿液樣本。這是由于狂犬病的最主要傳染源是發病和攜帶病毒的動物，這些動物的唾液中含有大量病毒[5]，并通過咬傷、抓傷進行傳染，因此唾液樣本的病毒含量遠高于尿液樣本。而狂犬病毒的分泌量由一定的波動性[6]，因此在尿液樣本中出現兩個陰性。

目前，對狂犬病毒的實驗室診斷方法主要有酶聯免疫吸附試驗（ELISA）、熒光抗體技術（FAT）、環介導等溫擴增技術（LAMP）、逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）及實時熒光定量PCR（Real-TimePCR）等。目前FAT技術是WHO和OIE推薦的黃金標準方法，但此方法需要異硫氰酸熒光素鹽為熒光標記物標記抗體以定位抗原，同時還需要使用熒光顯微鏡，操作較繁瑣，對試驗操作人員專業素質要求較高。實時熒光定量PCR技術以其快速、靈敏、重復性好的特點已被廣泛應用于高通量的病毒檢測，目前，國內外已經應用這一技術建立了多種檢測RABV的熒光定量PCR方法，針對我國狂犬病的流行特征，許運斌[7]等均成功合成引物和探針建立了熒光定量PCR檢測RABV的方法。但實時熒光定量PCR技術在試驗過程中容易造成樣本的污染導致假陽性的出現，這一情況有待進一步研究改善。

狂犬病是一種嚴重危害人類生命安全的疫病，急需一種快速、準確、靈敏的診斷方法。本試驗通過實時熒光定量PCR檢測了一例人感染狂犬病病毒的尿液及唾液樣本，一定程度上填補了國內使用此方法用于臨床檢測報道的空白，對未來實時熒光定量PCR用于臨床檢測人感染狂犬病病毒的檢測及推廣有一定的參考價值。

參考文獻

[1]Blanton J D，Palmer D，Dyer J，etal.Rabies surveillance in the United States during[J].J Am Vet Med Asso，2011，239：773～783.

[2]王 科，葉 峰，趙英仁.狂犬病的研究進展[J].臨床內科雜志，2010，5（27）：298～301.

[3]Bourhy H，Tordo N，Kissi B.Molecular diversity of the Lyssa-virus genns[J]. Virology，1993，194：70～91.

[4]高 鑫，朱武洋，盧學新.實時熒光定量PCR在病毒檢測中的應用[J].中國人獸共患病學報，2018，34（7）：660～666.

[5]羅 明.我國狂犬病流行狀況分析及防治對策[J].中國人獸共患病雜志，2005，02.

[6]Zaidman G W，Billingsley A.Corneal impression for the diagnosis of acute rabies encephatilis[J].Ophthalmology，1998，105（2）：249～251.

[7]許遠斌，邵明富，范金紅，等.基因I型狂犬病毒一步熒光定量PT-PCR檢測方法的建立[J].中國人獸共患病學報，2011，27（4）：297～310.

收稿日期：2018-12-7