蛇葡萄素與8種抗生素聯用的體外抗銅綠假單胞菌作用研究

謝俊杰 阮兆娟 左國營

中圖分類號 R285.5 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）01-0021-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.01.05

摘 要 目的：研究蛇葡萄素與8種抗生素聯用的體外抗銅綠假單胞菌作用。方法：采用棋盤式微量稀釋法測定蛇葡萄素分別與頭孢曲松、頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢哌酮、環丙沙星、阿米卡星、哌拉西林、頭孢吡肟8種抗生素聯用對銅綠假單胞菌（PA）標準菌株ATCC27853和7株臨床分離菌株PA135、PA216、PA276、PA281、PA291、PA314、PA319的最小抑菌濃度（MIC），以分級抑菌濃度指數（FICI）評價其聯用效果；并以臨床分離菌株PA319為目的菌株，設置正常對照組、蛇葡萄素單用組、抗生素單用組以及二者聯用組，以聯用時蛇葡萄素與抗生素的MIC為作用濃度，計數作用0、4、8、12、24 h的菌落數，繪制時間-殺菌曲線。結果：針對上述8株菌株，蛇葡萄素單用的MIC為128～256 mg/L，分別與頭孢曲松、頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢哌酮、環丙沙星、阿米卡星、哌拉西林、頭孢吡肟聯用時FICI≤1的分別有8、8、7、6、4、4、6、6株。在時間-殺菌曲線中，與抗生素單用比較，蛇葡萄素分別與頭孢曲松、頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢哌酮、環丙沙星、阿米卡星、哌拉西林、頭孢吡肟聯用后菌落數的下降幅度分別為2.65、2.30、0.42、0.47、0.53、1.19、1.74、1.04 lgCFU/mL。結論：蛇葡萄素與頭孢曲松、頭孢哌酮/舒巴坦聯用時對銅綠假單胞菌的抗菌效果更好。

關鍵詞 蛇葡萄素；銅綠假單胞菌；臨床分離菌株；抗菌作用

Study on Antimicrobial Activity of Ampelopsin Combined with 8 Kinds of Antibiotic against Pseudomonas aeruginosa in vitro

XIE Junjie1，2，RUAN Zhaojuan2，ZUO Guoying2（1.Dept. of Pharmacy， Liuan Hospital of TCM， Anhui Liuan 237000， China；2.Dept. of Pharmacy， Kunming General Hospital of Chengdu Military Command， Kunming 650032， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the antimicrobial activity of ampelopsin combined with 8 kinds of antibiotic against Pseudomonas aeruginosa （PA） in vitro. METHODS： Chessboard trace dilution method was used to determine minimum inhibitory concentration （MIC） of ampelopsin combined with ceftriaxone， cefoperazone/sulbactam， piperacillin/tazobactam， cefoperazone， ciprofloxacin， amikacin， piperacillin and cefepime to PA strain ATCC27853 and 7 isolated strains PA135， PA216， PA276， PA281， PA291， PA314 and PA319. Fractional inhibitory concentration index （FICI） was used to evaluate its effects of drug combination. Clinically isolated strain PA319 were taken as target strain and then divided into normal control group， ampelopsin alone group， antibiotics alone group and ampelopsin+antibiotic combination group. Using MIC of ampelopsin and antibiotics during drug combination as active concentration， the number of colonies cultured for 0， 4， 8， 12 and 24 h was counted， and the time-sterilization curve was drawn. RESULTS： For above 8 kinds of strains， MIC of ampelopsin alone was 128-256 mg/L； FICI of ampelopsin combined with ceftriaxone， cefoperazone/sulbactam， piperacillin/tazobactam， cefoperazone， ciprofloxacin， amikacin， piperacillin and cefepime to 8， 8， 7， 6， 4， 4， 6 and 6 strains were equal to or lower than 1， respectively. In time-antibacterial curve， compared with antibiotics alone， the number of colonies decreased by 2.65， 2.30， 0.42， 0.47， 0.53， 1.19， 1.74， 1.04 lgCFU/mL respectively after ampelopsin combined with ceftriaxone， cefperazone/sulbactam， piperacillin/tazobactam， cefoperazone， ciprofloxacin， amikacin， piperacillin and cefepime. CONCLUSIONS： Ampelopsin combined with ceftriaxone and cefoperazone/sulbactam show better antibacterial effect on PA.

KEYWORDS Ampelopsin； Pseudomonas aeruginosa； Clinically isolated strain； Antibacterial effect

蛇葡萄素（Ampelopsin）又叫二氫楊梅素、白蘞素、福建茶素，存在于東北蛇葡萄的漿果、顯齒蛇葡萄以及大葉蛇葡萄中。蛇葡萄素具有廣泛的藥理作用，劉海紅[1]研究表明，蛇葡萄素對酒精性肝損傷具有較好的預防和治療效果；覃瀟等[2]通過急性血瘀模型和實驗性全腦缺血再灌注損傷模型以及耳廓微循環實驗發現蛇葡萄素具有明顯的活血化瘀作用。此外還有研究發現，蛇葡萄素具有止咳祛痰、抗氧化、抗腫瘤以及降血糖和血脂的作用[3-6]。筆者在前期對粗糠柴（Mallotus philippensis）中抗菌活性物質的研究中，首次分離得到蛇葡萄素，并發現蛇葡萄素對銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）和金黃色葡萄球菌均具有較好的體外抗菌作用，但就蛇葡萄素與抗生素聯用是否能協同增強體外抗銅綠假單胞菌作用目前尚不明確。因此，本文研究了蛇葡萄素分別與臨床常用的8種抗生素（頭孢曲松、頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢哌酮、環丙沙星、阿米卡星、哌拉西林、頭孢吡肟）聯用對銅綠假單胞菌標準菌株和臨床分離菌株的抗菌作用，以期為臨床抗銅綠假單胞菌的治療提供參考。

1 材料

1.1 藥品與試劑

蛇葡萄素（從粗糠柴中提取分離得到，由中國科學院昆明植物研究所提供氫譜和碳譜數據，鑒定為蛇葡萄素，純度：95%）；注射用鹽酸頭孢吡肟（齊魯制藥有限公司，批號：4030038A1，規格：1 g/支）；注射用頭孢曲松（上海羅氏制藥有限公司，批號：SH6019，規格：0.25 g/支）；注射用哌拉西林（江蘇海宏制藥有限公司，批號：160217，規格：4.5 g/支）；注射用頭孢哌酮/舒巴坦（輝瑞制藥有限公司，批號：L86032，規格：1.0 g/支）；乳酸環丙沙星氯化鈉注射液（四川科倫藥業股份有限公司，批號：S16022307，規格：0.2 g ∶ 100 mL）；注射用頭孢哌酮（珠海聯邦制藥股份有限公司，批號：50400801，規格：1 g/支）；注射用哌拉西林/他唑巴坦（惠氏制藥有限公司，批號：J35757，規格：4.5 g/支）；硫酸阿米卡星注射液（江蘇吳中醫藥集團有限公司，批號：16090321-2，規格：0.2 g ∶ 2 mL）；二甲基亞砜（天津化學試劑有限公司，批號：20160105，分析純）。

1.2 菌株

PA標準菌株：ATCC27853，來源于中國科學院微生物菌種保藏中心。臨床分離菌株：PA135、PA216、PA276、PA281、PA291、PA314、PA319，均從成都軍區昆明總醫院臨床重癥呼吸系統患者的痰液標本中分離得到。

1.3 培養基

M-H（Mueller-Hinton）瓊脂培養基和M-H肉湯培養基（杭州天河微生物試劑有限公司，批號：20160407、20160314）。

2 方法

2.1 菌懸液的配制

于試驗前1 d挑取保存的8種菌株，接種在普通瓊脂平板上，并在（35±2） ℃的恒溫培養箱中培養18～24 h，用無菌生理鹽水配制成1.5×108 CFU/mL菌懸液備用。

2.2 藥液的配制

2.2.1 蛇葡萄素 蛇葡萄素以助溶劑二甲基亞砜溶解，配制成質量濃度為4 096 μg/mL的貯備液，置于-20 ℃保存備用，使用時以M-H肉湯培養基稀釋成1 024、512、256、128、64、32、16 μg/mL二倍比系列起始濃度。

2.2.2 頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦 頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦以二甲基亞砜溶解，配制成質量濃度為1 024 μg/mL的貯備液，置于-20 ℃保存備用，使用時以M-H肉湯培養基稀釋成128、64、32、16、8、4、2、1 μg/mL二倍比系列起始濃度。

2.2.3 頭孢曲松、頭孢吡肟 頭孢曲松、頭孢吡肟以二甲基亞砜溶解，配制成質量濃度為2 048 μg/mL的貯備液，置于-20 ℃保存備用，使用時以M-H肉湯培養基稀釋成256、128、64、32、16、8、4、2 μg/mL二倍比系列起始濃度。

2.2.4 哌拉西林、頭孢哌酮 哌拉西林、頭孢哌酮以二甲基亞砜溶解，配制成質量濃度為1 024 μg/mL的貯備液，置于-20 ℃保存備用，使用時以M-H肉湯培養基稀釋成256、128、64、32、16、8、4、2 μg/mL二倍比系列起始濃度。

2.2.5 阿米卡星 阿米卡星用無菌生理鹽水稀釋制成質量濃度為2 mg/mL的貯備液，置于-20 ℃保存備用，使用時以M-H肉湯培養基稀釋成128、64、32、16、8、4、2、1 μg/mL二倍比系列起始濃度。

2.2.6 環丙沙星 環丙沙星使用時，直接用M-H肉湯培養基稀釋其注射液原液（2 mg/mL）制成128、64、32、16、8、4、2、1 μg/mL二倍比系列起始濃度。

2.3 分級抑菌濃度指數測定

采用棋盤式微量稀釋法測定蛇葡萄素分別與頭孢曲松、頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢哌酮、環丙沙星、阿米卡星、哌拉西林、頭孢吡肟8種抗生素聯用時的最小抑菌濃度（MIC），計算分級抑菌濃度指數（Fractional inhibitory concentration index，FICI），FICI=甲藥MIC聯合/甲藥MIC單用+乙藥MIC聯合/乙藥MIC單用，其中甲藥代表蛇葡萄素，乙藥代表抗生素。1

在96孔平底細胞培養板中以二維棋盤的橫向（自左向右記為1～8）、縱向（自上向下記為A～H）兩個方向分別加入二倍比濃度的兩種聯用藥物。蛇葡萄素橫向自左向右加入初始濃度為0、16、32、64、128、256、512、1 024 mg/L的藥液50 μL，縱向自下往上遞增加入已配制好的二倍比系列起始濃度的抗生素（除H行不加入抗生素外）50 μL，再加入1.5×108 CFU/mL菌懸液100 μL。其中H行中除H1孔外其余各孔只加入了蛇葡萄素藥液，用于記錄單用蛇葡萄素時的MIC，即甲藥MIC單用；列1中除H1孔外其余各孔只加入了抗生素，用于記錄單用抗生素時的MIC，即乙藥MIC單用。在每塊培養板上均設置一個陰性對照孔（加入200 μL M-H肉湯培養基）和一個陽性對照孔（加入100 μL菌懸液和100 μL M-H肉湯培養基）。將培養板放入（35±2） ℃的恒溫培養箱中孵育24 h，觀察每孔中液體渾濁與否，以澄清透明的最小濃度為MIC。

2.4 時間-殺菌曲線驗證

以臨床分離菌株PA319為目的菌株，設置正常對照組、蛇葡萄素單用組、抗生素單用組以及蛇葡萄素與抗生素聯用組，以聯用時蛇葡萄素和抗生素的MIC為作用濃度，菌液濃度為5×105 CFU/mL，每組加菌液和藥液各2 mL，分別在（35±2） ℃環境下孵育0、4、8、12、24 h，對每個時間點進行菌落計數，取其對數值（lgCFU/mL）為縱坐標，孵育時間為橫坐標（t），繪制時間-殺菌曲線，平行試驗3次，取平均值進行作圖。如果與抗生素單用組比較，聯用組菌落數的下降幅度大于2 lgCFU/mL，則認為二者有協同作用；下降幅度為1～2 lgCFU/mL，則認為二者有相加作用；下降幅度<1 lgCFU/mL，則認為二者的相互作用為無關[9]。以此評價蛇葡萄素分別與頭孢曲松、頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢哌酮、環丙沙星、阿米卡星、哌拉西林、頭孢吡肟8種抗生素聯用的抗菌作用。

3 結果

3.1 FICI

結果發現，針對8株菌株，蛇葡萄素分別與頭孢曲松、頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢哌酮、環丙沙星、阿米卡星、哌拉西林、頭孢吡肟聯用24 h的FICI分別為0.187 5～0.625 0、0.312 5～1.000 0、0.312 5～1.500 0、0.312 5～1.062 5、0.312 5～1.125 0、0.312 5～>1.500 0、0.312 5～>1.500 0、0.312 5～1.500 0。其中，蛇葡萄素與頭孢曲松聯用后抗菌效果最強，對其中6株菌株呈現出協同作用。蛇葡萄素與頭孢曲松、頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢哌酮、環丙沙星、阿米卡星、哌拉西林、頭孢吡肟聯用的FICI值分別見表1～表8。

3.2 時間-殺菌曲線

與頭孢曲松單用組比較，蛇葡萄素與頭孢曲松聯用組菌落數下降幅度為2.65 lgCFU/mL，即蛇葡萄素與頭孢曲松鈉聯用呈協同作用。與頭孢哌酮/舒巴坦單用組比較，蛇葡萄素與頭孢哌酮/舒巴坦聯用組菌落數下降幅度為2.3 lgCFU/mL，即蛇葡萄素與頭孢哌酮/舒巴坦聯用呈協同作用。與哌拉西林/他唑巴坦單用組比較，蛇葡萄素與哌拉西林/他唑巴坦聯用組菌落數下降幅度為0.42 lgCFU/mL，即蛇葡萄素與哌拉西林/他唑巴坦聯用呈無關作用。與頭孢哌酮單用組比較，蛇葡萄素與頭孢哌酮聯用組菌落數下降幅度為0.47 lgCFU/mL，即蛇葡萄素與頭孢哌酮聯用呈無關作用。與環丙沙星單用組比較，蛇葡萄素與環丙沙星聯用組菌落數下降幅度為0.53 lgCFU/mL，即蛇葡萄素與環丙沙星聯用呈無關作用。與阿米卡星單用組比較，蛇葡萄素與頭孢曲松鈉聯用組菌落數下降幅度為1.19 lgCFU/mL，即蛇葡萄素與阿米卡星聯用呈相加作用。與哌拉西林單用組比較，蛇葡萄素與哌拉西林聯用組菌落數下降幅度為1.74 lgCFU/mL，即蛇葡萄素與哌拉西林聯用呈相加作用。與頭孢吡肟單用組比較，蛇葡萄素與頭孢吡肟聯用組菌落數下降幅度為1.04 lgCFU/mL，即蛇葡萄素與頭孢吡肟聯用呈相加作用。蛇葡萄素與8種抗生素聯用的時間-殺菌曲線見圖1。

4 討論

銅綠假單胞菌由于存在天然耐藥和獲得性耐藥兩種耐藥途徑，再加上臨床上抗生素的廣泛使用和不合理使用，更加加速了銅綠假單胞菌耐藥率的發展，造成臨床上很多抗生素不可以單用作銅綠假單胞菌的感染治療，常常需要考慮多種抗生素的聯合使用，以達到抗銅綠假單胞菌感染的目的[10-12]。臨床上已有許多關于多種抗生素聯合使用以及天然產物與抗生素聯合使用的體外抗菌研究報道[13-16]。

本次研究在綜合前人的研究、化合物本身的性質以及從粗糠柴中分離得到的蛇葡萄數產量考慮，選擇其與抗生素聯用，以棋盤式微量稀釋法測定FICI以及繪制時間-殺菌曲線兩種方法，綜合評價兩者聯用后體外抗銅綠假單胞菌的效果。棋盤式微量稀釋法是在微量稀釋法基礎之上對兩種藥物的聯合使用情況進行考察的一種方法，是目前研究抗菌藥物相互作用最常見的體外試驗方法，具有操作簡單、結果清晰、可靠等優點。時間-殺菌曲線法則是通過平板計數法對活菌進行計數的一種方法，其可以準確記錄菌落的存活情況，可監測兩藥聯用或單用時的動態抗菌效果。時間-殺菌曲線是目前國際上公認的評價聯合作用效果的標準方法[17]。本研究通過棋盤式微量稀釋法和時間-殺菌曲線兩種方法綜合考察蛇葡萄素分別與臨床常用的8種抗生素聯用抗銅綠假單胞菌的效果，可保證試驗結果的可靠性。

本研究結果表明，針對本文考察的8種銅綠假單胞菌，蛇葡萄素與頭孢曲松、頭孢哌酮/舒巴坦聯用的抗菌效果更好。

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（收稿日期：2018-07-15 修回日期：2018-11-04）

（編輯：鄒麗娟）