鴨胚成纖維細胞上坦布蘇病毒受體蛋白的鑒定

趙冬敏 韓凱凱 劉青濤 黃欣梅 楊婧 劉宇卓

摘要：【目的】拓展對坦布蘇病毒受體的認知，為研究其在鴨體內的感染機制打下基礎。【方法】取9日齡SPF鴨胚制備鴨胚成纖維細胞（DEF），待細胞長成單層后提取DEF膜蛋白，利用免疫共沉淀試驗篩選出DEF膜蛋白中可與坦布蘇病毒結合的蛋白，經病毒輔覆蛋白結合分析（VOPBA）驗證后通過LC-MSMS質譜分析進行鑒定;同時人工合成鴨熱休克蛋白70基因（HSP70）序列的開放閱讀框（1905 bp），構建重組質粒pET32a-HSP70并轉化大腸桿菌BL21（DE3）感受態細胞，經IPTG誘導表達，以重組蛋白免疫小鼠制備抗鴨HSP70血清，與DEF細胞共孵育后接種坦布蘇病毒，并采用實時熒光定量PCR檢測抗血清對病毒感染的抑制作用。【結果】DEF膜蛋白中分子量約70 kD的蛋白可與坦布蘇病毒結合，經LC-MSMS質譜分析和序列比對可確定該蛋白即為鴨熱休克蛋白70（HSP70）。含重組質粒pET32a-HSP70的BL21（DE3）感受態細胞經IPTG誘導4 h后，SDS-PAGE檢測發現在分子量約85 kD處出現目的蛋白條帶，獲得的重組鴨HSP70蛋白主要以包涵體形式進行表達，且能與His標簽抗體發生特異性反應。以重組鴨HSP70蛋白免疫小鼠獲得的抗鴨HSP70血清可封閉DEF細胞上的HSP70，而競爭性抑制坦布蘇病毒感染。【結論】HSP70是坦布蘇病毒感染DEF細胞的受體，可作為新的靶點用于抗坦布蘇病毒藥物設計。

關鍵詞： 坦布蘇病毒;鴨胚成纖維細胞;熱休克蛋白70;受體;免疫共沉淀;病毒輔覆蛋白結合分析（VOPBA）

中圖分類號： S852.657? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）01-0173-06

0 引言

【研究意義】自2010年以來，坦布蘇病毒（Tembusu virus，TMUV）在我國多個省（市）鴨、鵝養殖場引起一種以食欲急劇減退、產蛋量驟降為主要特征的新發疫病，給水禽養殖業造成重大經濟損失（趙冬敏等，2014;黃欣梅等，2015）。坦布蘇病毒感染率最高可達100%，死亡率5%～30%（Su et al.，2011）。除鴨和鵝外，坦布蘇病毒還可自然感染雞、鴿子和麻雀等禽類（Tang et al.，2013）。在人工攻毒條件下，坦布蘇病毒可感染小鼠并表現出對神經系統的致病力（Zhang et al.，2017）。體外培養試驗發現，坦布蘇病毒在哺乳動物細胞系（Vero、BHK-21、Hela、HepG2和SH-SY5Y）、禽源細胞系（DEF、CEF、GEF和DF-1）和蚊細胞系（C6/36和白紋伊蚊細胞）中均表現出良好的繁殖特性（Zhang et al.，2017），說明其感染宿主譜極其廣泛。因此，明確坦布蘇病毒在不同動物體內的感染機制，對科學防控坦布蘇病毒病具有重要意義。【前人研究進展】坦布蘇病毒隸屬于黃病毒科（Flaviviridae）黃病毒屬（Flavivirus），該屬病毒還包括登革病毒、日本腦炎病毒、西尼羅病毒、黃熱病毒和寨卡病毒等蟲媒病毒（趙冬敏等，2017）。黃病毒屬病毒囊膜蛋白以延伸的二聚體形式平鋪于病毒表面，在病毒感染細胞的過程中，囊膜蛋白作為吸附蛋白與細胞表面的受體分子結合，使病毒粒子吸附于靶細胞，隨后通過內吞作用進入細胞（Smit et al.，2011）。黃病毒屬病毒感染不同細胞時所使用的受體具有多樣性，不同細胞型表面的不同分子均有可能成為受體。Liu等（2017）通過免疫共沉淀和病毒輔覆蛋白結合分析（VOPBA）鑒定出熱休克蛋白A9是坦布蘇病毒在DF-1細胞上的受體分子;Zhao等（2018）利用VOPBA分析和間接免疫熒光法證實GRP78作為受體分子參與坦布蘇病毒感染BHK-21細胞。受體的分子類型依賴于細胞類型和病毒血清型，已有研究結果顯示，CD14相關蛋白（Chen et al.，1999）、整合素β3（Chu and Ng，2004）、GRP78/BiP （Jindadamrongwech et al.，2004）、高親和性層粘連蛋白（Thepparit and Smith，2004）、熱休克蛋白90/70（Reyes-Del Valle et al.，2005）、DC-SIGN（Pokidysheva et al.，2006）、硫酸乙酰肝素（Pattnaik et al.，2007）、凝集素（Chen et al.，2008）和微管蛋白的β鏈（Fang et al.，2013）等均可作為黃病毒屬病毒感染不同細胞時的受體，而這些受體正是研發抗黃病毒屬病毒藥物的潛在靶點。【本研究切入點】坦布蘇病毒感染宿主譜十分廣泛，但針對其受體的研究較少，且至今尚無坦布蘇病毒感染鴨胚成纖維細胞（DEF）受體鑒定的相關報道。【擬解決的關鍵問題】利用免疫共沉淀試驗分離DEF細胞膜中能與坦布蘇病毒結合的受體蛋白，經VOPBA驗證后通過LC-MSMS質譜分析進行鑒定，旨在拓展對坦布蘇病毒受體的認知，為研究其在鴨體內的感染機制打下基礎。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

坦布蘇病毒JS804株和坦布蘇病毒囊膜蛋白特異性單克隆抗體均由江蘇省農業科學院獸醫研究所禽病與生物獸藥研究室保存提供;9日齡SPF鴨胚購自中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所;細胞膜蛋白提取試劑盒購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司;Protein A+G瓊脂糖、His標簽抗體和堿性磷酸酶標記的羊抗鼠IgG均購自上海碧云天生物技術有限公司。

1. 2 DEF細胞制備

取9日齡SPF鴨胚置于蛋托上，以75%酒精棉球擦拭蛋殼，隨后在氣室部位將蛋殼擊碎，用無菌剪刀將卵膜剪開，取出鴨胚，去除鴨胚四肢、眼、喙、內臟及腦組織。以PBS洗滌鴨胚后放入小燒杯中剪碎，PBS洗滌剪碎的鴨胚，靜置5 min，棄上清液;加入1.0 mL胰酶37 ℃消化10 min，再加入10.0 mL含5%胎牛血清的DMEM終止反應，用吸管吹打數次后進行細胞計數。計數后吸取上清液分裝于細胞瓶中，每瓶約5×106個細胞。

1. 3 DEF膜蛋白提取

以胰酶消化長成單層的DEF細胞，用含5%胎牛血清的DMEM終止反應，2000 r/min離心5 min，收集細胞，根據細胞膜蛋白提取試劑盒說明提取DEF膜蛋白。提取的DEF膜蛋白分裝后-80 ℃保存備用。

1. 4 免疫共沉淀試驗

（1）去除非特異性結合：取400.0 μL提取的DEF膜蛋白，加入10.0 μL陰性小鼠血清和20.0 μL Protein A+G瓊脂糖，4 ℃搖床（緩慢搖動，下同）孵育2 h;3500 r/min離心5 min，取上清液用于后續試驗。（2）免疫共沉淀：于上述上清液中加入400.0 μL純化的坦布蘇病毒，4 ℃搖床孵育5 h，再加入10.0 μL坦布蘇病毒囊膜蛋白特異性單克隆抗體，4 ℃搖床孵育過夜;加入20.0 μL充分重懸的 Protein A+G瓊脂糖，4 ℃搖床孵育3 h。3500 r/min離心5 min，小心棄除上清液，沉淀用PBS洗滌5次，加入40.0 μL 4×SDS-PAGE電泳上樣緩沖液重懸沉淀，沸水處理5 min后進行SDS-PAGE檢測。對照組不加坦布蘇病毒，其余操作相同。電泳結束后進行考馬斯亮藍染色，并將篩選獲得的蛋白條帶切下送至上海博苑生物科技有限公司進行LC-MSMS質譜分析。

1. 5 VOPBA分析

對提取的DEF膜蛋白進行SDS-PAGE電泳并轉印至NC膜上，利用3%牛血清白蛋白封閉后，加入純化坦布蘇病毒，4 ℃孵育過夜。NC膜以PBST洗滌3次，加入坦布蘇病毒囊膜蛋白特異性單克隆抗體，37 ℃孵育1 h后用PBST洗滌3次，加入堿性磷酸酶標記的羊抗鼠IgG，37 ℃再孵育1 h。孵育結束后，以PBST洗滌3次，利用堿性磷酸酶顯色試劑盒進行顯色反應。對照組不加入坦布蘇病毒，其余操作相同。

1. 6 鴨熱休克蛋白70（HSP70）原核表達及鑒定

根據蛋白質譜分析結果和GenBank已公布的鴨HSP70基因序列（EU678246.2），人工合成鴨HSP70基因序列的開放閱讀框（1905 bp），并分別在5'和3'端加入Sal I（GTCGAC）和Not I（GCGGCCGC）酶切位點。在合成鴨HSP70基因片段的Sal I和Not I位點插入pET32a原核表達載體，轉化大腸桿菌BL21（DE3）感受態細胞，過夜培養后選取酶切鑒定呈陽性的重組質粒送至南京金斯瑞生物科技有限公司測序，測序正確的重組質粒命名為pET32a-HSP70。將含pET32a-HSP70的BL21（DE3）感受態細胞接種至含100 μg/mL氨芐霉素的LB液體培養基中，37 ℃振蕩培養至OD600約0.4，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG進行誘導表達。誘導4 h后收集菌液，6000 r/min離心10 min，棄上清液，沉淀用PBS重懸，超聲波破碎15 min后6000 r/min離心10 min，分別取上清液和沉淀進行SDS-PAGE檢測。同時將表達蛋白轉印至NC膜上，用5% BSA在37 ℃下封閉2 h，PBST（含0.05% Tween-20）洗滌3次，加入抗His標簽抗體，4 ℃孵育過夜;PBST洗滌3次，加入堿性磷酸酯酶標記的羊抗鼠IgG，37 ℃孵育1 h;PBST洗滌3次，加入堿性磷酸酶底物顯色。

1. 7 抗鴨HSP70血清制備

將純化的重組鴨HSP70蛋白與等量弗氏完全佐劑完全乳化后免疫6周齡雌性Balb/c小鼠，免疫劑量為70 μg/只。每隔2周加強免疫1次，共免疫3次，最后一次免疫后2周采集血清。以提取的DEF膜蛋白包被ELISA板，利用間接ELISA檢測血清中抗重組鴨HSP70蛋白的抗體效價（朱文姣等，2018）。

1. 8 抗鴨HSP70血清對坦布蘇病毒感染的抑制作用

接種DEF細胞于48孔板中，長成單層后與終濃度為100 μg/mL的抗鴨HSP70血清4 ℃共孵育1 h。對照組DEF細胞與空白小鼠的陰性血清進行共孵育，其余操作相同。棄孵育上清液，以冰預冷的PBS洗滌2次，接種坦布蘇病毒，4 ℃孵育30 min后再37 ℃孵育1 h。棄上清液，以冰預冷的PBS洗滌2次，加入含10%胎牛血清的1640培養液，37 ℃孵育24 h。收集細胞，利用QIAamp Viral RNA Mini Kit（Qiagen）試劑盒提取RNA，按照HiScript II Q select RT SuperMix for qPCR（諾唯贊）說明進行反轉錄。以合成的cDNA為模板，采用實時熒光定量PCR檢測坦布蘇病毒核酸，并以GAPDH為內參基因，采用2?△△Ct計算其相對表達量（Livak and Schmittgen，2001）。

2 結果與分析

2. 1 DEF膜蛋白與坦布蘇病毒的免疫共沉淀試驗結果

利用免疫共沉淀試驗篩選DEF膜蛋白中可與坦布蘇病毒結合的蛋白，SDS-PAGE檢測結果（圖1）顯示，約在70 kD處出現1條目的蛋白條帶，而對照組未出現對應的目的條帶。將分子量約70 kD的蛋白條帶切下送至上海博苑生物科技有限公司進行LC-MSMS質譜分析。

2. 2 DEF膜蛋白與坦布蘇病毒結合的驗證結果

為進一步驗證DEF膜蛋白與坦布蘇病毒的結合作用，對提取的DEF膜蛋白進行SDS-PAGE檢測并轉印至NC膜上，與純化坦布蘇病毒孵育后進行VOPBA分析。結果顯示，在分子量約70 kD處通過坦布蘇病毒囊膜蛋白特異性單克隆抗體檢測到1條蛋白條帶（圖2），與免疫共沉淀試驗結果一致;而對照組未出現對應的目的條帶，故確定DEF膜蛋白中分子量約70 kD的蛋白可與坦布蘇病毒結合。

2. 3 LC-MSMS質譜分析結果

為確定分子量約70 kD的蛋白是何種蛋白，將該蛋白條帶切下送至上海博苑生物科技有限公司進行LC-MSMS質譜分析，并將質譜分析結果（表1）輸入鴨蛋白質數據庫中進行比對，發現得分最高的蛋白為鴨熱休克蛋白70（HSP70）。鑒于檢測到的其他幾種蛋白為細胞生長、代謝和凋亡等相關蛋白，同時參考其他黃病毒屬病毒的HSP70受體（Das et al.，2009），因此，可確定通過免疫共沉淀和VOPBA分析篩選獲得可與坦布蘇病毒結合的蛋白即為鴨HSP70。

2. 4 鴨HSP70蛋白原核表達及鑒定結果

SDS-PAGE檢測結果顯示，含重組質粒pET32a-HSP70的BL21（DE3）感受態細胞經IPTG誘導4 h后，可在分子量約85 kD處出現目的蛋白條帶（圖3）。經超聲波破碎后的SDS-PAGE檢測結果（圖4）顯示，重組鴨HSP70蛋白主要以包涵體形式進行表達。利用His標簽抗體進行Western blotting鑒定，結果顯示誘導后的菌液在分子量約85 kD處出現能與His標簽抗體反應的特異性條帶（圖5）。

2. 5 抗鴨HSP70蛋白血清效價測定結果

用提取的DEF膜蛋白包被ELISA板，以重組鴨HSP70蛋白免疫小鼠血清為一抗，采用間接ELISA測定其血清效價，結果表明，免疫小鼠產生了抗鴨HSP70蛋白的抗體，抗體效價達1∶400。

2. 6 抗鴨HSP70血清對坦布蘇病毒感染的競爭性抑制作用

為檢驗抗鴨HSP70血清是否可封閉DEF細胞上的HSP70而抑制坦布蘇病毒感染，在接種坦布蘇病毒前加入抗鴨HSP70血清與DEF細胞進行共孵育，對照組采用空白小鼠的陰性血清進行共孵育。實時熒光定量PCR檢測結果（圖6）顯示，與對照組相比，抗鴨HSP70血清孵育DEF細胞中的坦布蘇病毒含量顯著降低（P<0.05），說明抗鴨HSP70血清可結合HSP70而封閉受體，競爭性抑制坦布蘇病毒感染。

3 討論

熱休克蛋白（HSP）是從細菌到哺乳動物廣泛存在的一類高度保守的熱應激蛋白，按其分子量大小可分為HSP100、HSP90、HSP70、HSP60、小分子HSP和泛素，其中最主要的是HSP70家族（張杰等，2017）。HSP70在進化上高度保守，可劃分為3個功能域：N端為45 kD的ATPase活性結構域，緊接著為18 kD的多肽結合域及C端功能尚不明確的10 kD結構域（任寶波等，2005）。HSP70已被鑒定為登革病毒感染單核細胞、巨噬細胞及C6/36細胞時的受體（Fang et al.，2013;張響英等，2017）。此外，Reyes-Del Valle等（2005）研究表明，HSP70和HSP90是登革病毒侵入人類神經母細胞瘤所需受體復合物的組成部分;Das等（2009）研究證實HSP70是乙型腦炎病毒感染蚊細胞和神經細胞（Neuro2A細胞）時的受體。可見，HSP70作為受體或受體復合物的一部分在黃病毒屬病毒入侵宿主細胞的過程中發揮重要作用。本研究采用免疫共沉淀試驗分離出坦布蘇病毒感染DEF細胞的受體是分子量為70 kD的蛋白，通過LC-MSMS質譜分析確定該蛋白為HSP70，首次鑒定出坦布蘇病毒在DEF細胞中的受體，為進一步研究鴨坦布蘇病毒的感染和致病機制打下基礎。

病毒吸附蛋白與細胞受體分子間的相互作用介導病毒進入宿主細胞，目前認為這種相互作用與病毒的宿主譜、組織嗜性和致病機制有關。病毒—受體的相互作用是一個多步驟過程，且該過程中可能依次涉及多種受體或輔助受體（Reyes-Del Valle et al.，2005）。黃病毒屬病毒感染細胞所需的受體呈多樣性，且依賴于細胞類型和病毒血清型，即使同一細胞也可能采用不同分子作為受體（Liu et al.，2017）。本研究結果雖然顯示抗鴨HSP70血清對坦布蘇病毒感染具有競爭性抑制作用，但并不能完全抑制病毒感染，說明在DEF細胞中還存在其他受體分子，具體是何種受體尚有待進一步探究。

4 結論

HSP70是坦布蘇病毒感染DEF細胞的受體，可作為新的靶點用于抗坦布蘇病毒藥物設計。

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（責任編輯 蘭宗寶）