響應面法優化提純牛肉肌紅蛋白

鄭婭 胡生海 何元翔 王佳妮

摘要：以牛背肌肉為原料，篩選Tris-HCl復合提取液pH、提取液濃度、提取時間、料液比、硫酸銨溶液飽和度等對肌紅蛋白提取有影響的因素，并從中選出具有顯著影響的因素（提取液pH、提取液濃度、硫酸銨溶液飽和度）進行響應面優化試驗，確定牛肉肌紅蛋白提取最優工藝參數提取液pH為8.15、硫酸銨溶液飽和度90.93 %、提取時間1.63 h。對粗提蛋白進行純化及層析交換分離，得到純度較高的肌紅蛋白含量2.14 mg/mL，總蛋白濃度2.39 mg/mL，樣品純度達到91.95%。

關鍵詞：肌紅蛋白;響應面法優化試驗;提取純化

中圖分類號：TS251.1? ? ?文獻標志碼：A? ? ?文章編號：1001-1463（2019）11-0040-03

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2019.11.010

Extracted and Purified Myoglobin in Beef Using

Response Surface Method

ZHENG Ya， HU Shenghai，HE Yuanxiang，WANG Jiani

（Agricultural Products Storage and Processing Institute， Gansu Academy of Agricultural Sciences，Lanzhou Gansu 730070，China）

Abstract：In this study， Longissimus dorsi of cattle was used as the material， and the factors of affect the extraction of myoglobin were screened， such as pH value of Tris-HCl composite extracting solution， extract concentration， extracting time， solid-liquid ratio，ammonium sulfate saturation. The factors with significant influence （pH of the extract， concentration of the extract， saturation of ammonium sulfate solution） were selected for response surface optimization test， and the optimal extraction parameters of beef myoglobin were determined： pH value of extracting solution was 8.15， saturation of ammonium sulfate solution was 90.93 %， and extraction time was 1.63 h. The crude protein was dialysis purification and separation by chromatography exchange， to obtain the high purity myoglobin content was 2.14 mg/mL， the total protein concentration was 2.39 mg/mL， and the purity of the sample reached 91.95%.

Key words：Myoglobin;Response surface optimization test;Extraction and purification

作為牛肉制品加工過程中的重要反應，脂質氧化是影響安全品質的主因[1 ]。其中，肌紅蛋白（Myoglobin，Mb）所介導的脂質自動氧化是脂質氧化的重要途徑。Mb是存在于動物肌肉組織細胞中，貯存并分配氧的色素類蛋白質，由1條多肽鏈（珠蛋白，Globin）和1個血紅素輔基（Hemin）構成[2 ]。根據配位分子的不同，Mb在肌肉中主要以3種形態存在，即還原型肌紅蛋白（myoglobin，Mb）、氧合肌紅蛋白（Oxymyoglobin，OxyMb）、高鐵肌紅蛋白（Metmyoglobin，MetMb）[3 ]。肌肉組織作為一個復雜的系統，不易明確Mb對肌肉脂質的作用，需對其分離純化后做單項性質研究，總體來說，用Tris-HCl緩沖劑提取，并用硫酸銨鹽析，Mb的提取純化效果最好[4 ]。因此，對牛肉中的肌紅蛋白進行提取純化，并保持其還原活性，是進一步探索肌紅蛋白性質機理，明確牛肉制品加工環節肉質成分間相互作用的基礎研究。

1? ?材料與方法

1.1? ?供試材料

試驗原料均取自甘肅祁連牧歌實業有限公司。選取5頭健康西門塔爾牛，屠宰后取背最長肌，去除表面脂肪筋腱等異物，液氮冷凍運回實驗室，置于-80 ℃條件下保存。試驗試劑硫酸銨、氯化鈉、甘油、EDTA、二硫蘇糖醇（DTT），均由天津光復精細化工研究所提供;BSA（牛血清蛋白），由上海國藥集團化學試劑有限公司提供;考馬斯亮藍R-250和G-250，由阿拉丁試劑（上海）有限公司提供;三羥甲基氨基甲烷（Tris），由美國Amresco公司提供。

1.2? ?儀器與設備

TGL-24M臺式高速冷凍離心機，長沙平凡儀器儀表有限公司;SP-756P紫外可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司;AL204電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司;Sephadex G-75，美國GE公司;PHS-3C pH 計，上海精密科學儀器有限公司;JJ-2 高速組織勻漿器，金壇市富華電器有限公司。

1.3? ?試驗方法

1.3.1? ? 肌紅蛋白粗提工藝? ? 參考林森森、吳成帆總結的方法[5 ]，并稍做修改。取牛肉背最長肌，去除表面筋膜及結締組織，切碎。準確稱取一定量肉樣，加入5倍體積提取緩沖劑（10 mmol/L Tris-HCl緩沖液，含1 mmol/L EDTA、0.54 mmol/L甘油、1 mmol/L DTT，4 ℃），10 000 r/s下勻漿1 min，4 ℃下靜置，然后在9 600? r/s下離心10 min（4 ℃），濾紙過濾，得濾液。在濾液中加入固體硫酸銨，一邊加一邊攪拌，至一定飽和度，然后4 ℃下靜置30 min以充分沉淀蛋白質。在12 000 r/s、4 ℃下離心30 min，收集沉淀測定樣品吸光度，計算樣品肌紅蛋白含量及其純度。

1.3.2? ?肌紅蛋白提取工藝優化? ? 采用單因素試驗，選取提取時間（A）、pH（B）、提取液濃度（C）、鹽析液飽和度（D）、料液比（E）5個因素，通過單因素試驗確定其對肌紅蛋白提取量的影響，因子水平見表1。

1.3.3? ? 肌紅蛋白提取Plackett-Burman試驗設計? ? 分析上述單因素試驗的變化趨勢，利用 Design-expert 8.05軟件，以響應值為肌紅蛋白含量，設計Plackett-Burman試驗（N=12）。

1.3.4? ? 響應面優化試驗設計? ? 針對肌紅蛋白提取工藝，以提高肌紅蛋白含量為目標，對影響肌紅蛋白提取量的因素進行響應面優化試驗。

1.3.5? ? 肌紅蛋白提取物透析? ? 經鹽析的肌紅蛋白沉淀用2倍體積的Tris-HCl（pH 8.5，10 mmol/L）溶解，置于透析袋中（截留分子量為8k- 14k Da），用相同緩沖液透析24 h，緩沖液置換10次，透析液進行磁力攪拌，控制溫度為0～4 ℃。

1.3.6? ?凝膠過濾層析分離提純? ? 選擇 Sephadex G-75作為柱料，將柱子用pH 8.5，1 mmol/L的 Tris-HCl緩沖液平衡，用0.1 mol/L NaCl溶液（pH 8.4，含有10 mmol/L Tris- HCl）進行線性洗脫，流速為2 mL/min，紫外檢測波長為280 nm。

1.3.7? ? 相關指標測定? ? Mb含量測定采用紫外分光光度法，測定Mb溶液在542 nm和700 nm 處的吸光值，重復3次，取平均值。

Mb含量計算公式如下：

CMb（mmol/L）=（A542-A700）×2.303，其中Mb是3種衍生型肌紅蛋白總量。

Mb純度的測定：總蛋白含量采用考馬斯亮藍法測定;標準曲線用0～0.1 mg/mL的牛血清蛋白質測定，結果用mg/mL表示。

Mb純度=（Mb含量/總蛋白質含量）×100%

2? ? 結果與分析

2.1? ?肌紅蛋白單因素試驗結果

2.1.1? ? 提取時間對肌紅蛋白含量的影響? ? 由圖1可以看出，肌紅蛋白含量隨著提取時間延長，在0～1.5 h內逐步提高;在提取1.5 h時含量達到最大值，為1.63 mg/mL。而后繼續延長提取時間，肌紅蛋白含量明顯下降。故在提取時間為1.0～2.0 h時，肌紅蛋白含量相對較高。

2.1.2? ? pH對肌紅蛋白含量影響? ? 由圖2可以看出，肌紅蛋白含量隨著pH的增大先增加后降低。在pH為8.2時肌紅蛋白含量達到最大，為1.62 mg/mL。而后pH繼續增加，肌紅蛋白含量明顯下降。故在pH為8.0～8.4時，肌紅蛋白含量相對較高。

2.1.3? ? 提取液濃度對肌紅蛋白含量影響? ? 由圖3可以看出，隨著提取液濃度增大，肌紅蛋白含量先增大后減小。在提取液濃度為10.0 mmol/L時肌紅蛋白含量達到最大值，為1.61 mg/mL。而后提取液濃度繼續增加，肌紅蛋白含量明顯下降。故在7.5～12.5 mmol/L時，肌紅蛋白含量相對較高。

2.1.4? ? 料液比對肌紅蛋白含量影響? ? 由圖4可以看出，隨著料液比的增大，肌紅蛋白含量先增大后減小，在料液比為1∶5時肌紅蛋白含量達到最大值，為1.62 mg/mL，而后料液比繼續增加，肌紅蛋白含量明顯下降。由此看出，在料液比為1∶3～1∶7時，肌紅蛋白含量相對較高。

2.1.5? ? 硫酸銨飽和度對肌紅蛋白含量影響

由圖5可以看出，隨著硫酸銨溶液飽和度的增高，肌紅蛋白含量呈現先上升后下降的趨勢。硫酸銨溶液飽和度為90%時肌紅蛋白含量達到最大，為1.63 mg/mL。整體來看，在硫酸銨飽和度為85%～95%時，肌紅蛋白含量相對較高。

由表2、表3、表4可以得出，Plackett- Burman 試驗各因素效應的顯著性可確定，5個因素中能顯著影響肌紅蛋白得率的3個因素依次為提取時間（P=0.007 5）、硫酸銨飽和度（P=0.001 6）、提取液pH（P=0.013 4）。從而確定了提取時間、硫酸銨溶液飽和度、提取pH等3個因素對肌紅蛋白提取具有顯著影響。

2.2? ?牛肉肌紅蛋白提取工藝的響應面優化試驗

以肌紅蛋白含量為響應值，在上述單因素試驗范圍內，通過 Design-expert 軟件進一步完成中心旋轉組合試驗。試驗因素水平設計、試驗結果見表5、表6。中心旋轉組合試驗方差分析結果（表7）表明，模型項P < 0.01，說明肌紅蛋白提取優化，所得回歸方程與相關因素間的關系極顯著。失擬項P =0.855 6 > 0.05，確定系數R-Squared與Adj.R-Squared分別為97.45%和94.17%，二者相差不大。另外，對肌紅蛋白含量結果預測進行整體估計，R-Squared和Pred.R-Squared分別為 97.45%和90.12%，說明該模型具有較為合理的擬合度。同時，提取時間、pH兩個因素對肌紅蛋白含量的影響顯著（P <0.05）;硫酸銨飽和度、提取時間、pH等3個因素的二次項、硫酸銨飽和度及其與提取時間的交互，對肌紅蛋白含量影響極顯著（P <0.01）。

肌紅蛋白最佳提取參數通過對回歸方程求最大值來完成（圖6、圖7、圖8），最大響應值 Y（肌紅蛋白含量）達1.62 mg/mL，此時對應的因素變量為提取液 pH 8.15、硫酸銨溶液飽和度 90.93 %、提取時間1.63 h，而后利用預測所得的最佳提取條件進行3次試驗，最終所得肌紅蛋白（Mb）平均含量為1.65 mg/mL，總蛋白濃度為9.67 mg/mL。

2.3? ?牛肉肌紅蛋白分離純化

通過圖9看出，經粗提取后，所得肌紅蛋白（Mb）平均含量為1.65 mg/mL，總蛋白濃度為9.67 mg/mL;再經透析后Mb含量為1.98 mg/mL，總蛋白濃度8.13 mg/mL;最后經凝膠過濾層析得到純度較高的Mb樣品，洗脫圖譜顯示，在280 nm處有2個主吸收峰，第2個峰吸收值最大，樣品顯示出淺紅棕色，Mb含量為2.14 mg/mL，總蛋白濃度2.39 mg/mL。

3? ?小結與討論

以牛背肌肉為原料，篩選Tris-HCl復合提取液pH、提取液濃度、提取時間、料液比、硫酸銨溶液飽和度對肌紅蛋白提取有影響的因素，通過響應面優化試驗確定牛肉肌紅蛋白提取最優工藝參數為提取液pH 8.15、硫酸銨溶液飽和度90.93%、提取時間1.63 h。對牛肌肉中肌紅蛋白進行提取分離，粗提取所得肌紅蛋白（Mb）平均含量為1.65 mg/mL，總蛋白濃度為9.67 mg/mL;經透析處理后Mb含量為1.98 mg/mL，總蛋白濃度8.13 mg/mL，經層析純化后Mb含量為2.14 mg/mL，總蛋白濃度2.39 mg/mL，樣品純度達到91.95%。

吳成帆試驗發現[6 ]，Mb一次沉淀效果低于分級沉淀，因此本試驗逐步添加硫酸銨固體至溶液中，硫酸銨飽和度達到實驗設計。同時，為防止溫度升高導致Mb變性氧化[7 ]，關鍵試驗均在4 ℃條件下進行。另外，為保證Mb蛋白活分子鏈之間不會交聯，影響提取物得率及還原性[8 ]，在Tris-HCl提取緩沖液加入了甘油、DTT進行復配，結合透析及凝膠過濾層析，此方法不會破壞蛋白的結構與功能[9 ]，較高純度的肌紅蛋白可有效提升后續肌紅蛋白性質分析、肉質成分相互作用等研究內容準確性與科學性。

參考文獻：

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（本文責編：陳? ? 偉）