白藜蘆醇聯合奧沙利鉑對人結腸癌細胞惡性生物學行為的抑制作用及機制

趙桂柱 孫占軍 溫志鵬

摘要?目的：探討白藜蘆醇（Res）聯合奧沙利鉑（Oxa）對人結腸癌細胞惡性生物學行為的抑制作用及機制。方法：將體外培養結腸癌HCT-116細胞分為Res組、Oxa組、聯合組及對照組，分別以100 μmoL/L Res、2 μmoL/LOxa、100 μmoL/L Res+2 μmoL/LOxa、等量生理鹽水處理，各組分別處理24、36、48 h。采用噻唑藍（MTT）法檢測結腸癌HCT-116細胞增殖抑制情況;采用Transwell小室實驗檢測結腸癌HCT-116細胞侵襲能力;Wound Healing法檢測結腸癌HCT-116細胞遷移能力;采用蛋白免疫印跡法檢測結腸癌HCT-116細胞波形蛋白（Vimentin）蛋白表達情況。結果：干預48 h時，Res組、Oxa組及聯合組結腸癌HCT-116細胞增殖抑制率分別為（28.41±6.25）%、（36.11±8.47）%、（83.61±12.72）%;干預48 h時，對照組、Res組、Oxa組及聯合組結腸癌HCT-116細胞侵襲率分別（97.14±2.81）%、（81.23±4.52）%、（69.84±3.97）%、（37.11±3.58）%;遷移率分別為（68.57±4.02）%、（46.11±3.13）%、（31.25±2.86）%、（18.79±2.21）%;Vimentin蛋白相對表達量分別為0.93±0.14、0.52±0.08、0.31±0.04、0.13±0.02。Res組、Oxa組及聯合組結腸癌HCT-116細胞增殖抑制率呈逐漸升高趨勢（P<0.05）;與對照組比較，Res組、Oxa組及聯合組結腸癌HCT-116細胞侵襲率、遷移率和Vimentin蛋白相對表達量降低，且聯合組顯著低于Res組與Oxa組，差異有統計學意義（P<0.05）。結論：Res與Oxa聯合使用具有顯著的協同效應，可更有效抑制結腸癌HCT-116細胞增殖，并降低其侵襲和遷移能力，其機制可能與下調Vimentin蛋白表達有關。

關鍵詞?結腸癌;白藜蘆醇;奧沙利鉑;增殖;侵襲;遷移;波形蛋白;抗腫瘤;上皮細胞-間充質轉化

Inhibitory Effect and Mechanism of Resveratrol Combined with Oxaliplatin on the Malignant Biological Behavior of Human Colon Cancer Cells

Zhao Guizhu， Sun Zhanjun， Wen Zhipeng

（Department of Pharmacy， Baogang Hospital， Baotou 014010， China）

Abstract?Objective：To investigate the inhibitory effect and mechanism of resveratrol（Res）combined with oxaliplatin（Oxa）on the malignant biological behavior of human colon cancer cells.Methods：Colon cancer HCT-116 cells were cultured in vitro.The Res group， the Oxa group， the combination group and the control group were treated with 100 μmoL/L Res， 2 μmoL/L Oxa and 100 μmoL/L Res+2 μmoL/L Oxa， the same amount of saline， and each group was treated for 24， 36， 48 h.The inhibition of proliferation of colon cancer HCT-116 cells was detected by MTT assay; Transwell chamber assay was used to detect the invasion ability of colon cancer HCT-116 cells; Wound healing method was used to detect the migration ability of colon cancer HCT-116 cells; The expression of Vimentin protein（vimentin）in colon cancer HCT-116 cells was detected by Western blotting（Wb）method.Results：At 48 h after intervention， the proliferation inhibition rates of HCT-116 cells in the Res group， the Oxa group and the combination group were（28.41±6.25），（36.11±8.47）and（83.61±12.72）%， respectively; At 48 h after intervention， the invasive rates of HCT-116 cells in the control group， the Res group， the Oxa group and the combination group were（97.14±2.81），（81.23±4.52），（69.84±3.97），（37.11±3.58）%， respectively; The mobility rates were（68.57±4.02），（46.11±3.13），（31.25±2.86）， and（18.79±2.21）%， respectively; The relative expression levels of Vimentin protein were（0.93±0.14），（0.52±0.08），（0.31±0.04）， and（0.13±0.02）， respectively.The proliferation inhibition rate of colon cancer HCT-116 cells in the Res group， the Oxa group and the combination group increased gradually（P<0.05）; Compared with the control group， the invasion rate， mobility rate and Vimentin protein expression of HCT-116 cells in the Res group， the Oxa group and the combination group significantly decreased， and the combination group was significantly lower than the Res group and the Oxa group（all P<0.05）.Conclusion：The combination of Res and Oxa has significant synergistic effect， which can inhibit the proliferation of colon cancer HCT-116 cells and reduce its invasion and migration rate， and its mechanism may be related to the down-regulation of Vimentin protein expression.

Key Words?Colon cancer; Resveratrol; Oxaliplatin; Proliferation; Invasion; Migrate; Vimentin; Antitumor; Epithelial-mesenchymal transition

中圖分類號：R284;R735.3文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.12.022

奧沙利鉑（Oxa）是繼順鉑和卡鉑之后的第三代鉑類抗癌藥物，具有較好的抗腫瘤效果，且目前已成為臨床治療胃癌及結直腸癌的一線化療藥物，白藜蘆醇（Res）具有抗腫瘤、抗衰老、抗炎、抗氧化及抗血栓等多種藥理學作用，已有研究證實，Res可對人乳腺癌、肝癌、胃癌、白血病等多種腫瘤細胞拮抗作用[1]。研究報道，Oxa和Res聯用具有協同抑制結直腸癌細胞增殖的作用，其機制與抑癌基因miR-34c表達上調有關[2]。研究發現，Res能逆轉人大腸癌細胞對Oxa耐藥，進而抑制人大腸癌細胞增殖，誘導其凋亡[3]。本研究旨在探討Res聯合Oxa對人結腸癌細胞惡性生物學行為的抑制作用及機制，為臨床治療結腸癌提供指導。現報道如下。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?細胞株?結腸癌HCT-116細胞，購自南京凱基生物公司。

1.1.2?藥物?Res（美國Sigma公司，批號：AM569872），規格：5 g，純度>99%;Oxa（長沙華美醫藥科技開發有限公司，批號：201845683），規格：50 mg。

1.1.3?試劑與儀器?主要試劑：胎牛血清、DMEM培養基（美國Gibco公司，型號：CQ-80L）;噻唑藍（MTT）（美國Sigma公司，型號：298-93-1）;Matrigel膠（美國BD公司，型號：40234A）;兔抗人Vimentin多克隆抗體（美國Santa Cruz公司，型號：AZ050）等。主要儀器：CO2培養箱（英國RS Biotech公司，型號：GALAXYS）;超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司，型號：SW-CJ-1FD）;小室（美國Corning公司，型號：Transwell）;光學倒置顯微鏡（日本OLympus公司，型號：CKX41）;蛋白垂直電泳儀（上海能科技有限公司，型號：VE-180）;全自動酶標儀（美國Bio-Rad公司，型號：606型）;Image Pro Plus軟件（美國Media Cybernetics公司，型號：Image Pro Plus）;圖像分析軟件（德國Leica公司，型號：Leica QWin）。

1.2?方法

1.2.1?分組與模型制備

將結腸癌HCT-116細胞分為Res組、Oxa組、聯合組及對照組。用含10%胎牛血清、100 U/mL青、鏈霉素的DMEM培養基在37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養結腸癌HCT-116細胞[4]，取對數期結腸癌HCT-116細胞，接種于96孔板中。

1.2.2?給藥方法

Res組、Oxa組、聯合組及對照組分別以100 μmoL/L Res、2 μmoL/LOxa、100 μmoL/L Res+2 μmoL/LOxa、等量生理鹽水處理，20 μL/孔，各組分別處理24、36、48 h。

1.2.3?檢測指標與方法

MTT法檢測結腸癌HCT-116細胞增殖抑制情況：細胞分組及處理同1.2.1，分別于干預24、36、48 h后，加MTT（5 mg/mL）溶液20 μL，孵育4 h，并設置8復孔，且各組均重復3次[5]。于570 nm波長處檢測各孔吸光度值OD570 nm。結腸癌HCT-116細胞增殖抑制率（%）=（1-實驗組OD570 nm/對照組OD570 nm）×100%。

Transwell小室實驗檢測結腸癌HCT-116細胞侵襲力：于Transwell小室上室鋪Matrigel基質膠50 μL，加無血清DMEM培養基，平衡12 h;胰酶消化，離心，1 500 r/min，5 min，收集對數期結腸癌HCT-116細胞，無血清培養基懸浮細胞，500 μL/室[6]。于下室置含10%胎牛血清的DMEM培養基，干預48 h時，棉簽去除上室上的細胞，0.5%結晶紫染色。于光學倒置顯微鏡下觀察并計數侵襲細胞數量。侵襲率（%）=下室細胞數量/細胞總數量×100%。

Wound Healing法檢測結腸癌HCT-116細胞遷移能力：將對數期細胞調整濃度為5×105個/mL，接種于6孔板中。以200 μL無菌移液器槍頭垂直于單層細胞劃痕，劃痕面積約10 mm×1 mm。各孔加含0.1%胎牛血清的培養基。由于結腸癌HCT-116細胞具有遷移能力，繼續培養劃痕會逐步融合，分別于干預0、24、36、48 h時在光學倒置顯微鏡下觀察[7]，以Image Pro Plus軟件計算劃痕愈合率（%）=（0 h時劃痕寬度-24/36/48 h時劃痕寬度）/0 h時劃痕寬度×100%。

蛋白免疫印跡法檢測結腸癌HCT-116細胞Vimentin蛋白表達情況：細胞分組及處理同2.1，收集各組干預48 h時的細胞，提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，取50 μg進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，以β-actin為內參，經Leica QWin圖像分析軟件進行分析結腸癌HCT-116細胞Vimentin蛋白相對表達情況[8]。

1.3?統計學方法

采用SPSS 21.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗;多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2?結果

2.1?各組不同時間點結腸癌HCT-116細胞增殖抑制情況

各組結腸癌HCT-116細胞增殖抑制率均隨時間延長而逐漸升高，且聯合組顯著高于Res組、Oxa組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

2.2?各組干預48 h后結腸癌HCT-116細胞侵襲能力比較

干預48 h，對照組、Res組、Oxa組及聯合組結腸癌HCT-116細胞侵襲率分別為（97.14±2.81）%、（81.23±4.52）%、（69.84±3.97）%、（37.11±3.58）%。與對照組比較，Res組、Oxa組及聯合組結腸癌HCT-116細胞侵襲率均顯著降低，且聯合組顯著低于Res組、Oxa組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖1。

2.3?各組干預后結腸癌HCT-116細胞遷移能力比較

干預24 h時，對照組、Res組、Oxa組及聯合組結腸癌HCT-116細胞遷移率分別為（18.41±2.16）%、（6.57±0.54）%、（3.12±0.29）%、（1.24±0.11）%;干預36 h時，各組遷移率分別為（37.39±3.22）%、（18.54±2.23）%、（14.11±1.78）%、（2.33±0.25）%;干預48 h時，各組遷移率分別為（68.57±4.02）%、（46.11±3.13）%、（31.25±2.86）%、（18.79±2.21）%。隨干預時間延長，各組結腸癌HCT-116細胞遷移率逐漸升高;與對照組比較，Res組、Oxa組及聯合組結腸癌HCT-116細胞遷移率均顯著降低，且聯合組顯著低于Res組與Oxa組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖2。

2.4?各組干預48 h后結腸癌HCT-116細胞Vimentin蛋白表達情況

干預48 h，對照組、Res組、Oxa組及聯合組結腸癌HCT-116細胞Vimentin蛋白相對表達量分別為（0.93±0.14），（0.52±0.08），（0.31±0.04），（0.13±0.02）。與對照組比較，Res組、Oxa組及聯合組Vimentin蛋白相對表達量顯著降低，且聯合組顯著低于Res組、Oxa組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖3。

3?討論

Oxa以DNA為作用靶點，通過形成鉑化DNA化合物而抑制DNA的合成，并抑制DNA的修復，從而激活信號傳導通路引起細胞死亡，發揮抗腫瘤的作用。Res又名茋三酚，是一種天然多酚類的植物抗毒素。研究顯示，Res除具有抗炎、抗氧化、保護神經系統、調節骨代謝及雌激素等多種藥理學作用外，還可通過抑制腫瘤細胞增殖，誘導其凋亡，抑制癌基因表達及干預信號轉錄等發揮抗腫瘤作用[9]。研究報道，Oxa可抑制人結腸癌SW620細胞增殖，其機制可能與抑制SW620細胞內源性核因子-κB、信號傳導與轉錄激活因子3（STAT3）表達有關[10]。高俊英等[11]研究發現，Res可通過影響上皮細胞-間充質轉化（EMT）過程、調控micro RNAs家族的表達來影響上皮腫瘤細胞的侵襲和遷移，提示Res可通過抑制腫瘤細胞的侵襲遷移控制腫瘤的發展。也有研究表明，Res可顯著抑制胰腺癌Miapaca-2細胞的侵襲轉移，且其抑制能力與藥物濃度正相關[12]。本研究結果顯示，聯合組結腸癌HCT-116細胞增殖抑制率顯著高于Res組、Oxa組，與對照組比較，Res組、Oxa組及聯合組結腸癌HCT-116細胞侵襲及遷移率均顯著降低，且聯合組顯著優于Res組與Oxa組，提示Res可抑制結腸癌HCT-116細胞增殖，降低其侵襲和遷移能力，且Res與Oxa聯用具有顯著的協同效應。EMT過程與腫瘤細胞侵襲、轉移等密切相關。研究發現，三氧化二砷和Res聯合使用可有效抑制肺癌細胞人侵襲、遷移，可能與下調Vimentin水平，抑制細胞基質的降解和EMT過程有關[13]。臧春寶等[14]研究發現，Res可調控EMT蛋白表達，下調Vimentin蛋白表達水平，抑制EMT，進而降低食管癌細胞的侵襲、遷移，提示Res可通過抑制EMT發生，控制腫瘤細胞的侵襲和遷移。本研究結果顯示，Res組、Oxa組及聯合組Vimentin蛋白相對表達量顯著低于對照組，且聯合組顯著低于Res組、Oxa組，提示Res可下調Vimentin蛋白的表達，進而發揮抗腫瘤的作用。

綜上所述，Res能明顯抑制結腸癌HCT-116細胞增殖，同時降低其侵襲、遷移和Vimentin蛋白表達，與Oxa聯用，可增強抗腫瘤作用，為臨床治療結腸癌提供了新思路。

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（2019-09-27收稿?責任編輯：楊覺雄）