六神丸治療大鼠放射性肺炎的機制研究

鄭琦 侯煒 王家偉 王雪凱 樊慧婷 林洪生

摘要?目的：觀察六神丸對放射性肺炎大鼠的治療作用，對其血清中IL-1β、IL-6、TNF-α和TGF-β1進行檢測，探究六神丸對放射性肺炎的治療作用及可能的分子機制。方法：將40只雄性SD大鼠隨機分為正常組、模型組、激素組、六神丸組，采用直線加速器對除正常組外的3組大鼠進行全胸單次照射，劑量為16 Gy。照射24 h后各組進行給藥。照射后第4周，處死動物。取全肺稱重計算肺系數;進行HE染色。采用Luminex法檢測大鼠血清中細胞因子的表達。結果：與正常組比較，照射后大鼠肺系數顯著升高（P<0.05），使用激素或六神丸干預后，大鼠肺系數較模型組低，差異有統計學意義（P<0.05，P<0.01）。HE結果顯示激素組、六神組大鼠肺組織出現充血、水腫、滲出等炎性病理學改變均較模型組有改善，炎細胞浸潤也不同程度減輕。六神丸可顯著下調大鼠血清中IL-1β、TNF-α炎性反應因子的表達（P<0.05，P<0.01）。結論：放射性肺炎大鼠血清中炎性因子明顯增加的增加，六神丸可有效減輕放射性肺炎大鼠局部肺損傷的程度，其機制可能與下調血清中TNF-α及IL-1β相關。

關鍵詞?六神丸;放射性肺炎;TNF-α;IL-1β

Mechanism of Liushen Pills in Treating Rats with Radiation Pneumonitis

Zheng Qi， Hou Wei， Wang Jiawei， Wang Xuekai， Fan Huiting， Lin Hongsheng

（1 Oncology Department， Guang′anmen Hospital of China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100053， China）

Abstract?Objective：To observe the effects of Liushen Pills on IL-1β， IL-6， TNF-α and TGF-β1 in the serum of rats with radiation pneumonitis（RP）， and explore the therapeutic effect of Liushen Pills（LS）on RP and the possible molecular mechanism.Methods：A total of 40 male SD rats were divided into a normal control（NC）group， a model group， a prednisone acetate（PA）group， a LS group， randomly.Linear accelerator irradiated in the 3 groups except the NC group for single chest with the dose of 16Gy in rats.The rats in each group were given the drug by perfusion 24 hours after irradiation.After 4 weeks， the rats were sacrificed.The lung coefficient was calculated by weighing the lungs.The pathological changes in the lungs were observed by hematoxylin-eosin staining.The expressions of cytokines in serum of rats were detected by Luminex.Results：Compared with the NC group rats， the lung coefficient of model rats were significantly increased（P<0.05）， while the lung coefficient of PA-treated and LS-treated rats were markedly decreased compared with the model rats， and the difference was statistically significant（P<0.05， P<0.01）.The HE results showed that the PA-treated， LS-treated rats inflammatory lesions such as congestion， edema， and exudation were lighten than model rats in lung tissues.Liushen Pills could significantly decreased the expressions of IL-1β， TNF-α in the serum of rats（P<0.05， P<0.01）.Conclusion：The proinflammatory cytokines in the serum of rats with RP were increased.Liushen Pills can effectively reduce lung injury in rats with RP， which may be related to the down-regulation of TNF-α and IL-1β in serum.

Key Words?Liushen Pills; Radiation pneumonitis; TNF-α; IL-1β

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.12.016

放射性肺損傷（Radiation-induced Pulmonary Injury，RPI）是胸部腫瘤（如肺癌、乳腺癌等）經放射治療后常見的并發癥，其不僅直接影響放射治療腫瘤的療效，還會增加放射后的各種遲發性損傷，嚴重的影響著患者的生命質量。RPI主要包括放射性肺炎（Radiation Pneumonitis，RP）及放射性肺纖維化（Radiation Pulmonary Fibrosis，RPF）[1-2]。近年來，中醫藥因其療效顯著、不良反應低等優勢，在防治RPI中的作用越來越受到關注[3-4]。有學者采用養陰清肺、清熱解毒、活血化瘀等治法治療RPI，在減輕放療的不良反應方面，顯示出了明顯的優勢，對治療RPI具有積極的意義[5]。六神丸出自《雷允上誦芬堂方》，現由常熟雷允上制藥有限公司生產。六神丸的應用至今已有100多年的應用歷史，其功效為清熱解毒、消腫止痛。近年來，其抗腫瘤作用在臨床和實驗研究中得到廣泛認可[6]。本研究觀察了中藥名方六神丸對RPI的影響，并對大鼠血清中IL-1β、TGF-β1、IL-6和TNF-α的含量進行檢測，目的在于探究六神丸是否能夠防治RPI并初步探討其可能的作用機制。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?動物?雄性SD大鼠，體質量180～200 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，飼養于中國中醫科學院廣安門醫院實驗動物中心，衛生許可證號：SYXK（京）2014-0041。清潔級，采用常規滅菌飼料，22～25 ℃，自動光控（12 h明/12 h暗）。

1.1.2?藥物?六神丸由常熟雷允上制藥有限公司提供，生產批號：15111125。醋酸潑尼松龍注射液由華中藥業股份有限公司提供，國藥準字H42021216，生產批號：20151001。以注射用生理鹽水將注射液分別稀釋100倍和200倍，制成濃度為0.25 mg/mL和0.125 mg/mL的水溶液。

1.1.3?儀器與試劑?Precise型醫用直線加速器（瑞典醫科達公司，型號：Elekta Limited）;病理切片機（德國萊卡公司，型號：RM2235型）;NIKON顯微鏡及成像系統（日本尼康公司，型號：NIKON TE2000-U）;液體芯片儀（美國Luminex公司，型號：MAGPIX）水合氯醛（北京國藥集團化學試劑公司，批號：20160715）;ProcartaPlex Rat IL-1beta試劑盒（批號：EPX01A-36002-901）、ProcartaPlex Rat IL-6試劑盒（批號：EPX01A-36053-901）、ProcartaPlex Rat TNF-alpha試劑盒（批號：EPX01A-30622-901）、ProcartaPlex Rat TGF-beta1試劑盒（批號：EPX01A-30420-901）、ProcartaPlex Rat Basic Kit（批號：EPX010-30420-901）以上試劑均購于美國eBiosinece公司。

1.2?方法

1.2.1?分組與模型制備?建立大鼠RP模型SD雄性大鼠，40只，隨機分為正常組、模型組、激素組、六神組，共計4組，每組10只。所有動物在北京中醫藥大學第三附屬醫院進行造模，造模方法如下：大鼠腹腔注射10%的水合氯醛，3 mL/kg麻醉。將大鼠腹面朝上，四肢固定于自制固定器，充分暴露胸部，采用6MV-X線加速器單次全胸照射，劑量為16 Gy。照射面積約為3.5 cm×4.0 cm（上至兩腋窩、下至胸骨劍突，其余部分用10 cm厚鉛磚屏蔽），距源靶一米進行照射，劑量率為250 cGy/min，實驗組大鼠全胸照射劑量共計16 Gy，正常組大鼠在同等條件下肺部假照射0 Gy。

1.2.2?干預方法?所有動物于照射后第1天開始給藥，1次/d，連續至照射后第28天取材。按動物體質量變化，每周調整1次灌胃劑量，按1 mL/100 g/d給藥。六神組：灌胃給藥，給予0.057 g藥粉/（kg·d）生藥藥液，1次/d;激素組：腹腔注射給藥，給藥劑量按時間依次遞減，第1～2周予潑尼松水溶液劑量為1.25 mg/（kg·d），第3周予潑尼松水溶液劑量為0.625 mg/（kg·d），第4～8周予生理鹽水;模型組：灌胃給藥，生理鹽水，1次/d;正常組：灌胃給藥，生理鹽水，1次/d。

1.2.3?檢測指標與方法

1.2.3.1?動物取材?于照射后4周（第28天），取各組大鼠，每組10只，稱重后進行麻醉。麻醉時，腹腔注射10%水合氯醛，3 mL/kg，四肢固定于木板上，打開腹腔，分離腹主動脈，自腹主動脈取血，靜置2 h后離心，取上清存于-80 ℃冰箱。摘取大鼠全肺稱重，將肺葉存于福爾馬林液中浸泡待用。

1.2.3.2?計算肺系數?按照以下公式計算肺系數：肺系數（%）=肺濕重（mg）/末次體質量（g）×100%。

1.2.3.3?觀察肺組織病理學改變?取左下肺葉，浸泡于10%中性福爾馬林組織固定液中，固定時間大于48 h。進行脫水→浸蠟→包埋→切片→脫蠟等步驟，用蘇木素-伊紅進行染色（HE染色）。在光學顯微鏡下，觀察肺組織HE染色切片的病理改變。

1.2.3.4?Luminex法檢測大鼠血清中的細胞因子?按照試劑盒說明書進行操作。準備標準品，繪制標準曲線。準備微球及樣品，并于96孔板上孵育2 h。洗板后分別加入檢測抗體IL-1β、TGF-β1、IL-6和TNF-α孵育30 min。洗板后加入SA-PE孵育30 min，上機檢測并進行數據分析統計。

1.3?統計學方法?采用SPSS 21.0統計軟件進行數據分析，實驗結果以均值±標準誤（±s）表示。所有數據均符合正態分布，多組間比較采用單因素ANOVA方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2?結果

2.1?各組大鼠體質量變化?正常組大鼠體質量呈上升趨勢，模型組大鼠體質量在造模后第14天，上升趨勢減緩，至放射后第28天，體質量較之前無明顯變化。激素組體質量呈上升趨勢，至第28天，體質量較模型組高。六神組大鼠體質量呈上升趨勢，在造模后第14～28天，體質量較模型組高。各組體質量變化見圖1。

2.2?受照射后大鼠的臨床表現?在照射后第1周，大鼠狀態較正常組動物無顯著性變化。照射后第2～4周，受照射大鼠照射部位毛質粗糙，整體皮毛逐漸開始不光澤，活動能力逐漸下降，體質量增長較正常動物緩慢;部分動物胸部出現脫毛甚至皮膚潰爛的情況。上述臨床表現程度，模型組最為嚴重，六神丸和激素可減輕大鼠受照射后的臨床癥狀。

2.3?各組大鼠肺組織標本變化?打開大鼠胸腔后，發現正常組大鼠肺組織形態完整，呈粉紅色，表面光滑，有彈性。模型組大鼠有大量胸腔積液，雙肺充血紅腫，呈暗紅色，肺部表面或整頁肺組織布滿點狀出血，部分可見肺組織與胸腔粘連。六神組和激素組均較模型組肺組織腫大出血情況有明顯改善，胸腔積液較少。

2.4?各組大鼠肺系數變化?于照射后第28天取各組大鼠，稱重后處死取材。摘取大鼠全肺稱重，肺濕重（mg）/末次體質量（g）×100%即為肺系數。正常組大鼠體質量增長明顯，肺濕重無明顯變化，其肺系數為：（3.45±0.06）%;中藥組體質量變化不明顯，肺濕重略有增加。計算其肺系數，結果顯示，模型組肺系數為：（6.34±0.30）%。與正常組比較，模型組大鼠肺系數與明顯增大，差異有統計學意義（P<0.001），激素組肺系數為（5.11±0.13），六神組肺系數為（5.68±0.18）%。與模型組比較，激素組和六神組的肺系數顯著降低，差異有統計學意義（P<0.01，P<0.05）。見圖2。

2.5?各組大鼠HE染色情況?染色后，正常大鼠肺組織結構正常，支氣管壁完整，氣管平滑肌未見增厚，黏膜上皮完整，肺泡形態較規則未見炎性細胞浸潤。照射后模型組大鼠表現出急性炎性反應的變化，支氣管管腔變狹窄，支氣管平滑肌肥大加重，肺泡排列不規則且肺泡壁增寬，炎性滲出、水腫明顯，肺泡結構紊亂，肺泡間隔增寬，肺間質及毛細血管壁充血，肺間質及肺泡腔內可見大量嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞等炎性細胞浸潤，黏膜上皮破損等。與模型組比較，激素、六神均可顯著改善肺組織中充血、水腫、滲出等炎性病變，支氣管平滑肌厚度不同程度降低，炎細胞浸潤情況出現減輕。見圖3。

2.6?各組大鼠血清中細胞因子的變化?采用Luminex法檢測大鼠血清中的細胞因子IL-1β、TGF-β1、IL-6和TNF-α。結果表明，正常組、模型組、激素組、六神組大鼠血清中的IL-6含量分別為：（1.88±0.04）pg/mL、（1.75±0.09）pg/mL、（1.87±0.06）pg/mL、（1.77±0.05）pg/mL，各組織間比較差異無統計學意義。正常組、模型組、激素組、六神組大鼠血清中的TGF-β1含量分別為：（1 674.50±54.26）pg/mL、（1 613.42±226.52）pg/mL、（1 531.67±146.96）pg/mL、（1 697.92±167.45）pg/mL，各組織間比較差異無統計學意義。研究結果顯示，正常組大鼠血清中的IL-1含量為（17.77±7.22）pg/mL，模型組大鼠血清中的IL-1含量為（75.36±13.96）pg/mL，與正常組比較，模型組大鼠血清中IL-1β的含量升高，差異有統計學意義（P<0.05）。激素組大鼠血清中IL-1β的含量為（63.15±14.05）pg/mL，較模型組低，但差異無統計學意義。六神組大鼠血清中IL-1β的含量為（15.09±5.46）pg/mL，與模型組比較，六神組大鼠血清中IL-1β的含量降低，差異有統計學意義（P<0.01）。研究結果顯示，正常組大鼠血清中的TNF-α含量為（17.98±7.91）pg/mL，模型組大鼠血清中的TNF-α含量為（91.92±16.80）pg/mL，與正常組比較，模型組大鼠血清中TNF-α的含量升高，差異有統計學意義（P<0.05）。激素組、六神組大鼠血清中TNF-α的含量分別為（54.69±16.94）pg/mL、（42.21±22.01）pg/mL，與模型組比較，六神組大鼠血清中TNF-α的含量降低，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖4。

3?討論

RPI是胸部腫瘤放療后常見的并發癥，重癥患者表現為因廣泛的肺纖維化病變而致呼吸功能障礙甚至死亡，嚴重的影響了患者的生命質量及生存率[7]。目前，對于RPI的治療，西醫常采用大劑量激素加抗生素治療，或采用抗氧化劑等藥物，取得了一定的療效，但其不良反應大，且預后不佳、安全性低，故尋找一種安全有效的藥物，一直是科學研究中的重要課題。中醫學認為，肺為嬌臟，不耐攻伐。放射性損傷屬于熱毒，耗傷氣血陰津，導致肺失濡養，故采用養陰清肺，清熱解毒之方劑進行治療[8]。本研究采用六神丸治療RPI大鼠，六神丸具有清熱解毒、消腫止痛之功，由牛黃、珍珠、蟾酥、明雄黃、麝香、冰片6味藥配制而成[9]。研究顯示，六神丸可以減輕RPI大鼠的臨床表現，有效改善RP大鼠照射后的皮膚損傷，減少胸腔積液。與模型組比較，六神丸可以顯著下調大鼠肺系數。六神丸可顯著改善肺組織中充血、水腫、滲出等炎性病變，支氣管平滑肌增厚程度減輕，炎細胞浸潤情況出現減輕。

RPI的發生與多種因素相關，如自由基損傷學說[10]、肺泡Ⅱ型細胞損傷學說[11]、細胞因子學說[12]。現有學者研究發現，RP的發生機制與Th17/Treg細胞平衡、Notch信號通路相關[13-14]。IL-1β是一種炎性活細胞素，可以刺激各種免疫細胞和炎性細胞，促進炎性蛋白及遞質的釋放，當炎性反應發生時，其數量急劇增加，對巨噬細胞、淋巴細胞等具有趨化作用，可增強其炎性反應[15]。同樣，TNF-α亦是一種促炎性因子，由巨噬細胞、單核細胞等產生，其與IL-1互相影響，在IL-1和脂多糖的作用下，可以大量釋放TNF-α[16]。此外，TNF-α可以影響氧自由基（ROS）的產生和溶酶體破裂，造成細胞死亡或崩解和組織損傷。放射性的損傷引起了肺部水腫、滲出等炎性反應，并激活單核-巨噬細胞分泌IL-1β、TNF-α等炎性遞質，使炎性遞質水平增高[17]。本研究發現，六神丸可下調大鼠血清中IL-1β、TNF-α炎性反應因子。研究表明，六神丸可以抑制腫瘤細胞增殖，誘導腫瘤細胞凋亡，其作用機制可能與抗腫瘤炎性微環境相關。六神丸對于減輕放射性炎性反應損傷有一定的作用，但其作用強度不如激素作用更強，隨著實驗研究的不斷深入，六神丸抗RP炎性反應損傷作用的機制亦會更加明確。下一步可采用六神丸與激素聯合用藥，觀察六神丸輔助西醫治療RP的優勢。本研究為中醫傳統方劑，增加新的臨床應用、減輕其在RPI方向提供研究思路。

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（2018-09-27收稿?責任編輯：王明）