超聲對亞麻籽蛋白穩定的水包油乳液理化性質的影響

徐珍霞 鄧乾春 董緒燕 楊陳 魏芳 陳洪 黃鳳洪 呂昕

摘?要：亞麻籽蛋白（flaxseed protein isolate，FPI）作為植物來源的優質蛋白，具有良好的乳化能力。本研究采用堿溶酸沉法提取得到蛋白質含量為90.8%的亞麻籽蛋白，分析不同超聲乳化條件（40%功率，超聲有效時間2、6、12、18、24、30 min）對含有大豆油的兩種不同濃度（0.5%、1.0%，w/w）的亞麻籽蛋白穩定乳液的理化性質及流變性能的影響，發現在超聲乳化30 min后乳液具有較小液滴尺寸，乳液的絕對Zeta（ζ）-電位值最高，顯示出最佳的粘彈性。同時，相比低濃度蛋白乳液，高濃度蛋白穩定乳液顯示出良好的液滴尺寸分布特征和更好的穩定性。結果表明，超聲乳化處理30 min可明顯提高乳液的穩定性及凝膠性。

關鍵詞：超聲;亞麻籽蛋白;乳液;理化性質

乳液是兩種不相混溶的液相的非均相混合物，包括水包油（O / W）、油包水（W / O）或多重乳液（O / W / O或W / O / W）三種類型[1]，廣泛應用于制藥[2]、化妝品工業[3]、農業[4]和食品行業[5]中。作為一種熱力學穩定體系，O / W乳液可以改善油溶性物質的水溶性，促進油脂的消化吸收，保護功能性物質的生物活性，并保證物質的儲藏穩定性等[6]。目前，制備O / W乳液的研究方法之一是超聲乳化技術，其主要是通過聲空化現象，增強生物聚合物的功能特性，產生穩定的乳液[7-8]。Taha等[9]通過高強度超聲處理制備出大豆分離蛋白穩定的乳液，證實超聲是一種有用的乳化技術。同樣，Yao等[10]發現，超聲處理可有效提高肌原纖維蛋白-黃原膠乳液的穩定性，但未改變該復合物的官能團。蛋白質因其兩親性而適用作乳化劑，有利于乳液的形成[11]。其中，FPI不僅具有與大豆蛋白相當的氨基酸譜和營養價值，而且具有良好的乳化活性、熱穩定性及高持油性等功能特性，其濃縮物具有高表面電荷，更利于形成穩定乳液體系[12-13]。Pham等[14]發現，與亞麻籽蛋白-酚類絡合物穩定的乳液相比，具有高表面電荷密度的FPI穩定的乳液顯示出更高的物理穩定性，說明FPI具有作為天然乳化劑的潛力。本研究以大豆油作為油相，通過超聲乳化技術制備FPI穩定的O / W乳液，研究不同超聲處理時間及兩種FPI濃度對乳液理化性質的影響，并對乳液流變性能進行分析，為亞麻籽蛋白穩定乳液應用于食品及其他工業提供技術支持。

1?材料與方法

1.1?材料與儀器

1.1.1?材料?亞麻仁，大同市福瑞康鑫科技有限責任公司;大豆油，購自當地超市;尼羅紅染料，上海源葉生物科技有限公司;正己烷、乙醇、鹽酸、氫氧化鈉等均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2?儀器?GAMMA 1-16 LSC冷凍干燥機，德國Martin Christ公司;Kjeltec TM 2300全自動凱氏定氮儀，德國福斯公司;T25高速剪切機，德國IKA公司;Nano DeBEE實驗型超高壓均質機，美國DeBEE國際有限公司;JY92-ⅡDN超聲波細胞粉碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司;Mastersizer 2000粒度分析儀，英國馬爾文儀器有限公司;Zetasizer Nano ZS納米粒度及Zeta電位分析儀，英國馬爾文儀器有限公司;Nikon A1共聚焦激光掃描顯微鏡，日本尼康公司;DHR-2流變儀;美國TA儀器有限公司。

1.2?方法

1.2.1?亞麻籽蛋白的提取與組分分析?以脫殼并經粉碎的亞麻籽仁為原料，將其與蒸餾水以1∶25的質量比混合溶解，用1mol/L NaOH調節pH為9.5，在60℃下水浴攪拌60 min后，以4 000 r/min離心30 min，得到的上清液用1mol/L HCl調節其pH為4.4，然后以4 500 r/min的轉速離心1 h，棄去上清液，對得到的沉淀進行冷凍干燥并經研磨粉碎，即可得到FPI，儲存于4℃備用。之后，采用凱氏定氮法測定所得FPI的蛋白含量（%N×6.25）。

1.2.2?乳液的制備?將蛋白質含量為90.8%的FPI粉末分散在Tris緩沖液（0.1mol/L pH 8.4）中，在室溫下以500 r/min的轉速攪拌16 h，并在40℃攪拌1 h以溶解蛋白質，制得FPI儲備溶液（0.5%或1%，w/w）。將一定質量的大豆油加入到FPI溶液中（w/w=1∶10），乳液分兩步制備。首先，使用磁力攪拌器在環境溫度（25℃）下制備預粗乳液（2 500 r/min，30 min）。其次，將預粗乳液用高速剪切機在10 000 r/min下預均化2 min。再使用超聲細胞破碎儀制備乳液，將40 mL粗乳液于超聲幅度40%，脈沖持續時間為導通時間2 s和關斷時間2 s的條件下，將樣品超聲處理2、6、12、18、24、30 min（其為有效處理時間，省略脈沖時間）制備乳液。同時，通過高壓均質機將其在10 000 Psi的壓力水平下均質以制備對照樣品。

1.2.3?粒徑分析?在制備乳液后立即使用Mastersizer 2000納米粒度儀設備測定乳液的粒徑。泵速和遮蔽率分別設定為2 000 r/min和10%～15%。其中，分散介質的折射率為1.330，大豆油的折射率為1.472。乳液的粒度用粒度分布（PSD）、體積平均粒徑（d-4，3）和表面平均粒徑（d-3，2）表示。

1.2.4?Zeta（ζ）電位測量?使用Milli-Q水將乳液稀釋100倍，然后使用DTS-7010電位槽，在25℃通過Malvern Zetasizer Nano ZS（ZEN 3600）分析儀測量乳液的ζ-電位值。

1.2.5?乳液穩定性?將玻璃管中的新鮮乳液（20 mL）放置在室溫黑暗環境中，在1、7、14d后觀察乳液是否有分層或絮凝現象產生。

1.2.6?共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）?使用尼康A1激光共聚焦顯微鏡觀察新鮮乳液的形態以獲得CLSM圖像。使用尼羅紅（以0.1% w/v的濃度溶解于乙醇中）用于油相染色，將40 μL上述染料加入到2 mL乳液中混合均勻后進行微觀結構觀察。激發波長為 488～530 nm，發射波長在575～580 nm之間。

1.2.7?流變測量

（1）應力掃描：使用具有鋁平行板（直徑40 mm、間隙1 mm）的DHR-2流變儀進行流變學測量。通過在1 HZ下進行的應變掃描測試，確定每個樣品的線性粘彈性區域。在線性粘彈性區域內測量樣品的粘彈性（儲能模量G、損耗模量G″）。（2）頻率掃描：頻率掃描測試在25℃下，0.1～100 rad/s的角頻率范圍內進行。選擇頻率掃描測試的應變幅度為0.05%。（3）剪切速率掃描：穩定剪切試驗在25℃下，1～100/s的剪切速率范圍內進行，以測量乳液的表觀粘度。

1.3?數據處理

試驗處理重復3次，采用Excel 2007及OriginPro 8.0進行數據整理和圖表繪制。試驗結果以平均值±標準偏差表示。

2?結果與分析

2.1?乳液粒徑測量

圖1顯示，對于兩種濃度蛋白質（0.5%、1%，w/w）穩定的大豆油乳液，超聲處理能顯著降低液滴尺寸，隨超聲作用時間的延長，乳液的粒徑隨之減小。例如，從附表可以看出，對于蛋白質濃度為0.5%的乳液，相比均質處理，有效超聲破碎30 min后，大豆油乳液的粒徑從50.12±2.30 μm（H樣品）降低至4.66±0.02 μm（S30樣品），這些結果可能是由于聲空化氣泡的產生加劇了油滴的破壞過程[15]。另外，蛋白質濃度對乳液粒徑有很大影響，對比兩種蛋白濃度的乳液可發現，相比高濃度蛋白形成的乳液，低FPI濃度的乳液具有更大的液滴尺寸，原因可能是高濃度FPI作為乳化劑能更好地形成水包油乳液體系，該結果與Felix等[16]發現高濃度鷹嘴豆蛋白穩定的乳液具有較小液滴尺寸一致。

2.2?Zeta（ζ）電位分析

Zeta電位的絕對值越大說明分散體系越穩定，可根據它們的值來評估乳液的穩定性。如圖2所示，觀察到所有樣品都具有負ζ電位值，這可能是由于FPI分子在pH值高于其等電點時帶負電荷。對于蛋白質濃度為1%的乳液，超聲處理后ζ-電位的絕對值顯著增加，表明超聲處理可將更多的負氨基酸暴露于FPI分子表面，乳液表面攜帶更多的負電荷，液滴之間的排斥力增加，乳液液滴的粒徑相對更小，與粒徑分析結果一致。而對于FPI濃度為0.5%的乳液，超聲處理后乳液的ζ-電位絕值相差不大。而且，在同樣處理條件下，蛋白質濃度為1%的乳液的ζ-電位值高于FPI濃度為0.5%的乳液，說明高濃度蛋白制備的乳液穩定性更好。

2.3?乳液穩定性

放置不同時間后乳液的表觀圖像表明，乳液主要是發生了乳化作用從而產生分層現象，而乳化是由于重力分離。可以觀察到超聲處理的樣品較均質化樣品穩定性更好，表明超聲產生更穩定的乳液。隨著超聲時間的增加，FPI乳液的穩定性增加。原因可能有兩點：一是較長的超聲作用可以顯著降低油滴的大小，提高蛋白質的溶解度，從而促進FPI分子向油/水界面的運動;二是超聲可使蛋白質展開并將疏水基團暴露在表面，從而促進油膜上FPI水界面的形成，形成穩定的水包油體系[17]。

2.4?共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）

不同濃度蛋白質穩定的乳液經均質和有效超聲處理2、12、30 min后的共聚焦激光顯微照片表明，大豆油用尼羅紅染色后于激發/發射波長=488～530/575～580 nm處進行形態觀察。以蛋白質濃度為1%的乳液為例，與均質相比，超聲處理乳液顯示出更小的粒徑和更均勻的液滴，說明超聲處理能降低乳液粒徑并提高其分散性。在兩種蛋白質濃度下，低濃度蛋白質穩定乳液顯示出更大的液滴尺寸并顯示出小規模的絮凝，說明高濃度蛋白有利于單分散乳液的形成。

2.5?流變

2.5.1?應力掃描?以FPI濃度為1%的大豆油乳液為代表，進行流變測量。圖3顯示了經均質處理和超聲30 min處理乳液在固定頻率（1Hz）下的儲能模量（G）和損耗模量（G″）的應變依賴性。對于經均質處理的樣品，G在低應變率（0.01%～5%，稱為線性粘彈性區域）下大于G″，表明樣品的彈性（固體狀）行為。然而，當應變速率增加到足夠高的水平（> 5%）時，G″變得大于G，從而揭示其中的粘性（液體狀）行為[18]。而對于經超聲30 min的樣品，G和G″在低應變率下幾乎一致，當應變增加到足夠高（> 5%）時，G″變得大于G，表現流體特征，為粘彈性液體。

2.5.2?頻率掃描?頻率掃描測試在25℃下0.1～100 rad/s的角頻率范圍內進行，選擇頻率掃描測試的應變幅度為0.05%。圖4表明，對于經均質處理的樣品，隨著頻率的增加，模量呈現出增加的趨勢，G″在低頻率范圍內大于G，揭示其粘性行為;當頻率> 11 rad/s時，G變得大于G″，從而揭示其彈性行為。而對于經超聲處理的樣品，隨著頻率的增加，模量呈現出平緩增加的趨勢，而后當頻率達到5 rad/s時G=G″，之后G和G″均快速增加，且觀察到在掃描頻率范圍內G大于G″，

表明在該頻率范圍內彈性行為是顯著地，乳液體現出了典型的弱凝膠特性，顯示出了樣品的頻率依賴性，而乳液的粘彈性響應通常可與凝膠狀結構相關[19]，說明該乳液能夠形成相當強的小液滴彈性凝膠網絡。

2.5.3?剪切速率?剪切速率測試在1～100/s的剪切速率范圍內進行，以測量乳液的表觀粘度。從圖5可以看出，經均質處理的乳液樣品，在剪切速率1～10/s的范圍內，其粘度保持不變，隨后粘度呈現先增加后降低的趨勢;經超聲處理的所有樣品的表觀粘度值隨著剪切速率的增加而降低，表明這些乳液樣品本質上是剪切稀化的，為剪切變稀流體（假塑性流體）[20]。表觀粘度與剪切速率曲線表明，每種剪切速率下表觀粘度的大小隨著超聲時間的增加而增加，表明超聲時間越長乳液的凝膠性越強。但超聲處理30 min時乳液的整體粘度有所降低，原因可能是超聲強度太大破壞了乳液的結構。

3?結論

采用超聲乳化技術制備FPI穩定的O/W乳液，發現超聲30 min后，1%FPI穩定乳液液滴分散更均一，粒徑尺寸低至6.14 μm，乳液穩定性最好，顯示出最高的粘彈性和凝膠特性。通過比較蛋白濃度為0.5%和1.0%的乳液理化性質，發現高蛋白濃度有利于形成均一穩定的乳液體系。

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（責任編輯?唐建敏）