UPLC-MS測定杜仲的3種成分及其藥代動力學研究

賁晶晶 葛建彬 秦清清

摘要?目的：通過超高效液相色譜聯合質譜法測定杜仲的3種成分及其藥代動力學研究。方法：本研究的質譜采用電噴霧電離源（ESI），通過多反應離子監測這一掃描方式對京尼平苷酸、綠原酸和松脂醇二葡萄糖苷等3種成分及內標用于定量分析的監測離子。結果：1）杜仲中京尼平苷酸、綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷等3個指標性成分的分離良好，無內源性物質干擾，具有較好的專屬性。2）UPLC方法嚴謹性，其精密度、穩定性試驗、重復性試驗、加樣回收率等均良好。3）京尼平苷酸和松脂醇二葡萄糖苷在大鼠體內的藥代動力學具有非線性特征，僅綠原酸存在線性特征;而CLz、Vz參數指標的差異比較大，顯示大鼠血漿中杜仲提取物中的3種成分在大鼠體內的藥代動力學代謝過程不一致。結論：UPLC-MS/MS的操作簡單，結果具有較好的精密度、穩定性和重復性，可作為杜仲有效成分及藥代動力學研究的可靠方法。

關鍵詞?超高效液相色譜法;質譜;杜仲;京尼平苷酸;綠原酸;松脂醇二葡萄糖苷;藥代動力學;研究

Determination of 3 Components and Pharmacokinetics of Cortex Eucommiae by UPLC-MS

Ben Jingjing，Ge Jianbin，Qin Qingqing

（Pharmaceutical Department，Nantong Second People′s Hospital，Nantong 226002，China）

Abstract?Objective：To determine the 3 components of Cortex Eucommiae by ultra-high performance liquid chromatography combined with mass spectrometry and their pharmacokinetics.Methods：Electrospray ionization source（ESI）was used to monitor the monitoring ions of geniposide chlorogenic acid and terpineol diglucoside，and internal standards for quantitative analysis of geniposide chlorogenic acid and terpineol diglucoside.Results：1）The 3 index components of Cortex Eucommiae such as geniposide，chlorogenic acid and terpineol diglucoside，were well separated and had no interference of endogenous substances，with good specificity.2）The UPLC method was rigorous，and its precision，stability test，repeatability test and sample recovery rate were all good.3）The pharmacokinetics of geniposide and turpentine diglucoside in rats was nonlinear，but only chlorogenic acid was linear.However，there were significant differences in the 2 parameters of CLz and Vz，indicating that the pharmacokinetic metabolism of the 3 components of Cortex Eucommiae extract in rat plasma was inconsistent.Conclusion：The operation of UPLC-MS/MS is simple，and the results have good precision，stability and reproducibility.It can be used as a reliable method for the study of effective components and pharmacokinetics of Cortex Eucommiae.

Key Words?Ultra high performance liquid chromatography; Mass spectrometry; Cortex Eucommiae; Geniposide; Chlorogenic acid; Turpentine diglucoside; Pharmacokinetics; Study

中圖分類號：R284.1文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.12.011

杜仲（Eucommia ulmoides Oliver）為我國名貴滋補藥材，其取藥部位是樹皮，為杜仲科植物的干燥樹皮，別名木棉，從《神農本草經》上可見杜仲被列為上品，其味甘，性溫，主要治療功能有補益肝腎、強筋壯骨、調理沖任、固經安胎等[1-3]。縱觀杜仲2 000多年的藥用歷史，可知杜仲能夠治療腎陽虛引起的腰腿痛和（或）腰膝酸軟無力[4]，男性之陰囊濕癢[5]，女性之肝氣虛引起的胞胎不固[6-7]等癥。由現代藥理學研究可知[8]，杜仲中具有的降血壓[9-10]、抗腫瘤[11]、降血脂[12-13]、抗血栓[14]、抗氧化[15]等藥理作用是由哪些具體的成分發揮的功效，同時這些藥理成分的藥代動力學是如何變化的，因此課題組將杜仲提取物注射入大鼠尾靜脈后，研究杜仲的3個指標性成分（分別是京尼平苷酸、綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷）在大鼠體內的具體經時過程和藥代動力學參數特征，為臨床上使用杜仲這味藥物的前藥動學研究提供實驗依據。本課題研究主要采用UPLC-MS的技術手段，超高效液相色譜（Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC）是分離科學中的一個全新類別，UPLC是在高效液相色法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）的理論及原理的基礎上發展而來的，這一技術方法不僅秉承了HPLC的快速檢測手段，而且涵蓋了小顆粒填料進一步提高也HPLC的精密度和靈敏度，同時以非常低系統體積增加分析通量和色譜峰容量[16]。通過以物質離子化為基礎建立質譜分析系統，測量并分析離子譜峰的強度來聯合分析杜仲3種成分，進一步闡釋藥代動力學的經時過程，首先杜仲提取物樣品經過液相色譜純化后的樣品，再通過電場和磁場的綜合作用將樣品氣化離子化，形成的離子按照質量數和電荷數的記錄并分析，在液相色譜質譜中通常所用的離子源有電噴霧電離源（Electrospray Ionization，ESI）和大氣壓化學電離源（Atmospheric-Pressure Chemical Ionization，APCI），其中最常用的是ESI，根本原因是ESI比APCI軟電離程度較小的電離方式，因此在實際檢測應用中適用范圍較APCI的大[17-18]。現將結果報道如下。

1?儀器與試藥

1.1?儀器?ACQUITY UPLC超高效液相色譜-三重四級桿質譜聯用儀（美國Waters公司生產，產品型號：H-class-Xevo TQ MS）;冷凍高速離心機（美國Beckman Coulter公司生產，產品型號：Allegra64-R）;氮吹儀（北京眾信佳儀科技有限公司生產，產品型號：ZX-DC）;渦旋混合器[萊普特科學儀器（北京）有限公司生產，產品型號：Vortex dancer Ⅳ];電子分析天平（上海精密儀器儀表公司生產，產品型號：FA1004N型）;超聲波清洗器（上海精密儀器儀表公司生產，產品型號：KQ-100DE）;超純水系統（法國MILIPORE公司生產，產品型號：Mili-RO Plus型）。

1.2?試劑?京尼平苷酸對照品（上海純優生物科技有限公司生產，生產批號27741-01-1，藥品純度≥98%）;和綠原酸對照品（上海純優生物科技有限公司生產，生產批號327-97-9，藥品純度≥98%）;松脂醇二葡萄糖苷對照品（上海順勃生物工程有限公司生產，生產批號201206，藥品純度≥98%）;葛根素對照品（中國藥品生物制品鑒定所生產，生產批號111-090623，藥品純度≥98%）。色譜純乙腈（美國Fisher公司生產，生產批號102489）和甲酸（美國Fisher公司生產，生產批號101437），AR級磷酸分析純（上海拓國滬試實驗室器材股份有限公司生產，生產批號20170412）。

1.3?分析樣品?杜仲藥材來源于湖北，經過南通市第一人民醫院專業藥物研究人員鑒定為優質杜仲科植物杜仲的干燥樹皮，研究室以此為原材料自制杜仲提取物進行進一步研究。

1.4?實驗動物?動物清潔級SD大鼠，體質量（260±20）g，由廣東省醫學實驗動物中心提供（批號2006A010），實驗室常規環境飼養。

2?方法與結果

2.1?色譜條件?進樣體積為2 μL;色譜柱采用Waters-BEHC18（產品規格：采用窄徑柱2.1 mm，短柱100 mm，填料粒徑1.7 μm），色譜柱的溫度控制在45 ℃左右，進樣器的溫度設置控制在15 ℃，流動相則以流動相A的主要試劑配置由0.1%甲酸和乙腈組成，流動相B的主要試劑配置由0.1%甲酸和水組成，以進行梯度洗脫。具體的梯度洗脫程序見表1。

2.2?質譜條件?本研究的質譜采用ESI，首先設置毛細管電離電壓，經過多個預實驗最終確定該電壓設置為3 kV，離子源溫度設置為120 ℃，并將氮氣作為本研究過程中涉及到的噴霧氣與反吹氣，并將反吹氣流速設置為50 L/h，而將氬氣作為本研究過程中涉及的碰撞氣，并將其流速設置為0.16 mL/min;去溶劑氣流速經過多個預實驗最終確定該電壓設置為650 L/h，去溶劑氣溫度最終確定為350 ℃左右;通過多反應離子監測（Multiple Reaction Monitoring，MRM）這一掃描方式對京尼平苷酸、綠原酸和松脂醇二葡萄糖苷等3種成分及內標用于定量分析的監測離子。見表2。

2.3?對照品溶的配制?取4個裝有適量甲醇的廣口瓶用以配制濃度為1.35 mg/mL的京尼平苷酸、濃度為1.00 mg/mL的綠原酸、濃度為1.00 mg/mL的松脂醇二葡萄糖苷、濃度為1.00 mg/mL的葛根素的儲備液。其中葛根素是作為本研究的內標液，用甲醇按梯度稀釋成所需濃度，配制5 μg/mL的葛根素內標溶;同時分別精密量取京尼平苷酸、綠原酸和松脂醇二葡萄糖苷等3種對照品儲備液適量，用甲醇按梯度稀釋成所需濃度，得混合對照品溶液。

2.4?供試品溶液的配制?將杜仲用藥材剪剪成碎片，反復揉成絮狀，精密稱定2 g，采用索氏提取器中提取杜仲提取物，加入氯仿適量，加熱回流6 h，待冷卻后棄去氯仿液，藥渣室溫揮發去氯仿，再將藥渣放置索氏提取器中進一步提取，加甲醇適量，加熱回流6 h，待冷卻后將提取液轉移至100 mL量瓶，加甲醇至刻度線，充分混合均勻搖勻即得杜仲供試品溶液。

2.5?血漿樣品處理方法?采用1.5 mL塑料離心管取大鼠血漿100 μL，加入已知濃度的葛根素內標溶液50 μL，再加入等量的1%甲酸溶液和300 μL甲醇，渦旋混合器上混合1 min，超聲5 min，4 ℃低溫離心機上15 000 r/min離心10 min，取上清液并在48 ℃下的氮氣吹干，殘留物加入300 μL甲醇充分溶解，4 ℃低溫離心機上轉速采用15 000 r/min，離心時間控制在10 min以內，最終只取上清液作為分析樣品進樣UPLC-MS/MS分析。

2.6?杜仲提取物的專屬性試驗?如圖1所示，根據A空白血漿，B空白血漿+混合對照品溶液+內標，C含杜仲提取物大鼠血漿等3種情況對杜仲的3種成分及內標液進行專屬性試驗，A、B、C 3種情況中的大鼠空白血漿、含杜仲提取物大鼠血漿均取100 μL，根據“2.5”依次操作得相應UPLC-MS/MS色譜圖A、B、C;本研究結果顯示，杜仲提取物中可見分離程度良好的3種不同成分，且各個成分間不存在內源性干擾物質，具有較好的專屬性。

2.7?線性關系考察?根據梯度稀釋濃度配制混合對照品溶液100 μL的大鼠空白血漿作為標準參照曲線，縱坐標Y是將含有大鼠杜仲提取物的待測血漿的峰面積除以葛根素內標峰面積得到的比值比值，橫坐標X是京尼平苷酸、綠原酸和松脂醇二葡萄糖苷等各成分物質濃度，將權重系數設置為1/X進行計算直線回歸方程，京尼平苷酸、綠原酸和松脂醇二葡萄糖苷等3種成分最低檢測限（LLOD）定義為S/N≥3，結果顯示京尼平苷酸、綠原酸和松脂醇二葡萄糖苷均具有良好的線性關系，詳見表3。

2.8?精密度試驗?取統一批次含有杜仲提取物的大鼠血漿，按“2.5”項下分別配制京尼平苷酸、綠原酸和松脂醇二葡萄糖苷等3種成分大鼠血漿低、中、高3個濃度的質量控制樣品（Quality Control，QC），通過3 d不間斷的連續測定，并根據每日測得的不同數據計算該日的標準曲線，計算求得3種成分當日的平均濃度值，京尼平苷酸、綠原酸和松脂醇二葡萄糖苷等3種成分日內和日間精密度RSD（%）均小于10%，準確度范圍為95.473%～112.086%。表明該UPLC-MS/MS方法準確度、日內和日間精密度良好，結果見表4。

2.9?穩定性試驗?按“2.7”項下分別配制京尼平苷酸、綠原酸和松脂醇二葡萄糖苷等3種成分，分別根據大鼠血漿低、中、高3個濃度的京尼平苷酸、綠原酸和松脂醇二葡萄糖苷等3種成分QC，對3種成分在室溫下放置6 h，4 ℃下冷藏8 h和凍融3次，通過在1 d內重復測量多次來考察樣品的穩定性。本研究結果表明含有杜仲提取物的大鼠血漿樣品中京尼平苷酸RSD=9.04%<15%、綠原酸RSD=10.12%<15%和松脂醇二葡萄糖苷RSD=8.83%<15%，提示本研究中含有杜仲提取物的大鼠血漿在UPLC的中具有較好的穩定性。

2.10?重復性試驗?根據同一批次同一廠家的杜仲藥材制備制備6份杜仲供試品溶液，處理后分別進樣測定，根據葛根素內標法計算得京尼平苷酸、綠原酸和松脂醇二葡萄糖苷的RSD分別為1.842%、2.018%、2.856%，表明本研究采用的UPLC方法重復性良好。

2.11?回收率試驗?精密量取大鼠空白血漿100 μL，按“2.7”項下分別配制京尼平苷酸、綠原酸和松脂醇二葡萄糖苷等3種成分的大鼠血漿或葛根素內標液，且分別配置低、中、高3個濃度的3種京尼平苷酸、綠原酸和松脂醇二葡萄糖苷QC，經過反復測量5次，計算平均加樣回收率。京尼平苷酸、綠原酸和松脂醇二葡萄糖苷等3種成分回收率分別為：86.106%～96.461%，86.147%～99.828%，86.344%～96.679%，提示本研究中UPLC的加樣回收率良好。

2.12?樣品檢測結果?藥代動力學研究結果顯示：健康SD大鼠分為低、中、高3個劑量組，尾靜脈注射杜仲提取物溶液前所有大鼠均禁食12 h，期間可自由飲水，給藥劑量分別為0.17、0.34、0.68 g/kg。采用涂有肝素的塑料離心管于給藥前與給藥后2、5、10、15、20、30、45、60、80 min經尾靜脈取血約0.3 mL，于離心機上采用4 500 r/min的轉速，離心時間控制在10 min。本研究采用UPLC-MS分析杜仲提取物的藥代動力學，并以DAS 2.0數據處理軟件數據擬合，本研究選取血藥濃度（AUC0-80）、平均駐留時間（MRT0-80）、清除率（CLz）、分布容積（Vz）等參數選用統計矩方法計算。獲得京尼平苷酸、綠原酸和松脂醇二葡萄糖苷3個成分C-t曲線圖和相應的藥動學參數，具體詳細見圖2和表5。

3?討論

本次研究完成了京尼平苷酸、綠原酸和松脂醇二葡萄糖苷3種藥物成分的UPLC-MS/MS分析及其藥時曲線和藥代動力學的分析。研究前期主要從方法學的準確度、穩定性和可重復性進行考察，緊接著對京尼平苷酸、綠原酸和松脂醇二葡萄糖苷等3種成分的專屬性進行鑒定，并進一步對這3種成分進行線性方程回歸和回收率的計算。而在藥代動力學的研究中，主要從低、中、高3個不同劑量濃度的杜仲提取物入手，建立體內符合二室藥動學模型，進而計算出大鼠血漿中杜中提取物內3種成分的藥代動力學參數指標。AUC0-80、MRT0-80都隨著濃度計量的升高而升高，從結果可得大鼠血漿中杜仲提取物中的3種成分中的京尼平苷酸和松脂醇二葡萄糖苷在大鼠體內的藥代動力學具有非線性特征，僅綠原酸存在線性特征;而CLz、Vz參數指標的差異比較大，顯示大鼠血漿中杜仲提取物中的3種成分在大鼠體內的藥代動力學代謝過程不一致。本研究中前期在考察大鼠血漿樣品的處理優化方法過程中，首先從溶劑入手，對甲醇、乙腈、乙酸乙酯，乙醚4種不同的有機溶劑對大鼠血漿中的蛋白進行沉淀，結果顯示，對大鼠血漿中蛋白的沉淀效果最好的有機溶劑是甲醇，而在進一步的研究中更發現甲醇不僅無內源性物質干擾而且回收率最好，因此本研究最終選擇甲醇沉淀處理大鼠血漿樣品。在提取方法的選擇上，以京尼平苷酸、綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷3種成分作為考察指標，對提取溶劑進行考察：取樣品2 g 3份，分別精密加入甲醇，80%甲醇，50%甲醇25 mL，超聲6 h。結果表明：用80%甲醇提取的京尼平苷酸、綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷3種成分均得到較高的含量，所以本研究最終選用80%甲醇作為杜仲提取物成分的提取溶劑。對提取方式及時間進行考察：取樣品2 g 6份，精密加入80%甲醇25 mL，取其中3份回流，提取時間分別為2 h、4 h、6 h;取另外3份超聲，提取時間分別為2 h、4 h、6 h。結果表明，回流和超聲2種提取方式對含量結果影響不大，因超聲操作較為簡便，且6 h能將京尼平苷酸、綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷等3種成分提取完全，故選擇超聲處理。

綜上所述，采用超高效液相色譜法操作簡便，結果準確，重復性好，加樣回收率高，可用于研究杜仲的3個指標性成分在體內的藥代動力學特征，考察3個指標成份在大鼠體內的經時過程，并記錄3個指標成分的動力學參數，為研究杜仲臨床前藥動學研究提供實驗依據。

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（2018-12-11收稿?責任編輯：楊陽）