廣西右江流域野生羅非魚種群及其雜合性研究

鄭雄　趙立朝　吳志強　張潔　黃亮亮　汪開成　張曼

摘要：【目的】明確廣西右江流域野生羅非魚的種群類別及其雜合情況，為廣西右江流域羅非魚的入侵防控及本土珍稀物種保護提供科學依據。【方法】從廣西右江流域隆安、平果、田東、田陽和百色5個采樣點采集野生羅非魚樣本共136尾，提取各采樣點羅非魚樣本DNA，設計特異性引物對線粒體COⅠ基因及核基因（enc1、ptr和sh3px3）進行群體擴增，通過DNASTAR 7.1的Megalign程序對所有樣本的COⅠ基因序列進行同源性比對分析，以確定羅非魚樣本的母本;采用MEGA 6.0對enc1、ptr和sh3px3基因進行序列比對和校正，并構建各采樣點羅非魚樣本的系統發育進化樹。【結果】廣西右江流域5個采樣點的羅非魚母本種類共有4種，分別為尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）、齊氏羅非魚（Coptodon zillii）、莫桑比克羅非魚（O. mossambicus）和奧利亞羅非魚（O. aureus）。在26尾隆安羅非魚樣本中無雜合個體;在36尾平果羅非魚樣本中有3個雜合個體，雜合率為8.3%;在20尾田東羅非魚樣本中有2個雜合個體，雜合率為10.0%;在30尾田陽羅非魚樣本中有2個雜合個體，雜合率為6.7%;在24尾百色羅非魚樣本中有4個雜合個體，雜合率為16.7%。【結論】廣西右江流域野生羅非魚的種間雜交率并不高，但其雜交優勢更有利于羅非魚種群的擴散，進一步侵占土著魚種的生存空間，嚴重威脅廣西右江流域魚類資源的多樣性，有關部門應加強監管力度以防止野生羅非魚種群迅速擴散。

關鍵詞： 羅非魚;DNA條形碼;雜合性;廣西右江流域

中圖分類號： S965.125? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）12-2797-09

Wild tilapia population and its hybridization in

Youjiang River， Guangxi

ZHENG Xiong1， ZHAO Li-chao2， WU Zhi-qiang1，3*， ZHANG Jie4，

HUANG Liang-liang1，5， WANG Kai-cheng2， ZHANG Man2

（1College of Environmental Science and Engineering， Guilin University of Technology， Guilin， Guangxi? 541006， China; 2College of Animal Science and Technology， Guangxi University，Nanning? 530004， China; 3Collaborative Innovation Center for Water Pollution Control and Water Safety in Karst Area， Guilin University of Technology， Guilin， Guangxi? 541004， China; 4Institute of Zoology， Chinese Academy of Sciences， Beijing? 100101， China; 5Guangxi Key Laboratory of Environmental Pollution Control Theory and Technology， Guilin， Guangxi? 541004， China）

Abstract：【Objective】Researching species and heterozygosity among the population of wild tilapias in Youjiang Ri-ver basin of Guangxi? to provide scientific base for prevention of tilapia invasion and conservation of indigenous species.【Method】A total of 136 tilapia individuals from Long’an， Pingguo， Tiandong， Tianyang and Baise in Youjiang River basin were studied. The DNA extraction， PCR amplification and gene sequencing based on COⅠ from mitochondria，and enc1，ptr， sh3px3 from ribosome with specific primers for each individual were performed. Through the megalign program of DNASTAR 7.1， the homologies of COⅠ gene sequences of all samples were compared and analyzed to determine the female parents of tilapia samples. The sequences of enc1，ptr，sh3px3 gene were compared and corrected by MEGA 6.0， and the phylogenetic trees of all samples were constructed. 【Result】The results showed that there were four female parents species in the five sampling sites， they were Oreochromis niloticus， Coptodon zillii， O. mossambicus and O. aureus. The hybrid rates of samples in Longan（26 individuals， 0 hybrid individual）， Pingguo（36 individuals， 3 hybrid individuals）， Tiandong（20 individuals， 2 hybrid individuals）， Tianyang（30 individuals， 2 hybrid individuals） and Baise（24 individuals， 4 hybrid individuals） were respectively 0， 8.3%， 10.0%， 6.7% and 16.7%. 【Conclusion】Although the interspecific hybridization rate is not too high， the situation will be more conducive to the spread of wild tilapia population and further encroachment on the living space of indigenous species，and severely threaten diversity of local fishery resources in Youjiang River basin due to heterosis. The government department concerned ought to enhance supervision，and prevent further proliferation of population of wild tilapia.

Key words： tilapia; DNA barcode; hybridization; Youjiang River of Guangxi

0 引言

【研究意義】羅非魚是我國主要淡水養殖水產品之一，也是廣西的主要養殖魚類（Bergstrom and Mensinger，2009;張紅燕等，2015）。羅非魚對環境的適應能力極強，具有發病少、耐低氧、食性雜、繁殖快及生長快的特性，其肉質鮮美、無骨間刺、富含營養，在促進漁民收入增長及漁業經濟發展方面發揮著重要作用（劉孝華，2007）。廣西屬于典型的熱帶季風和亞熱帶季風氣候區域，非常適宜羅非魚生長繁殖（Chen et al.，2012）;但羅非魚也是廣西江河流域的主要入侵魚類之一（汪開成等，2018）。羅非魚從養殖環境逃逸并成功入侵到自然水體后具有較強的表型適應性和種間競爭力（Arba?iauskas et al.，2013;管嘉俊等，2017），會對當地生物多樣性與生態環境造成嚴重威脅（趙立朝等，2019）。因此，明確廣西野生羅非魚的主要品種及入侵種群，研究其雜合情況，可為廣西內陸水域生態安全保護及羅非魚入侵預警和防治提供理論依據。【前人研究進展】DNA條形碼是利用基因組中通用短序列片段對物種進行鑒別的技術，具有自動化高、操作簡易及鑒定準確的優點（Hebert et al.，2003;Kress et al.，2005;Hollingsworth et al.，2011;Zhang and Hanner，2011）。其中，線粒體細胞色素C氧化酶Ⅰ基因（COⅠ）因具有應用廣泛、數據庫信息完整等優點，是目前魚類DNA條形碼研究中最常用的基因之一（武宇鵬等，2011;單云晶等，2013）。但由于線粒體DNA源自于母本，且羅非魚種間雜交頻繁（郭奕惠等，2009），若只鑒別線粒體DNA則無法確定其父本，而需對其細胞核基因進行二次鑒定，才能確認種群類別（高連明，2015）。李建林等（2011）篩選出7個微衛星位點（GM066、UNH995、UNH948、GM017、UNH162、GM440和GM166）作為羅非魚鑒定的分子標記，且每個位點均能將尼羅羅非魚、奧利亞羅非魚和雜交羅非魚區分開來。Falade等（2016）對尼日利亞西南部淡水鯰魚和兩種羅非魚的16S rRNA和COⅠ基因進行比較分析，結果發現基于COⅠ基因能精確地區分尖齒胡鯰、薩羅羅非魚和齊氏羅非魚。Ordo?ez等（2017）對菲律賓養殖場內Oreochromis屬10個品系羅非魚、3個不同地點的紅羅非魚和2種純系羅非魚進行COⅠ基因比對分析，結果發現養殖羅非魚母本可被明確區分為4種，但COⅠ基因無法區分同種不同品系的羅非魚。Zhu等（2017）利用14個微衛星標記對3個不同地區180份紅羅非魚樣本進行鑒定，發現臺灣紅羅非魚與以色列紅羅非魚和馬來西亞紅羅非魚均存在明顯遺傳差異。管嘉俊等（2018）對廣西6個不同地點的尼羅羅非魚D-loop序列進行比對分析，發現欽州尼羅羅非魚種群個體間的遺傳距離比玉林、南寧、貴港、防城港和北海群體的要遠，因而具有更明顯的遺傳分化現象。總體而言，目前國內外已有大量針對羅非魚種群遺傳多樣性的相關研究，但主要是對線粒體內1～2個基因位點進行研究，或利用微衛星標記對羅非魚進行種群鑒定，而鮮見基于DNA條形碼對羅非魚細胞核基因的探索，或結合線粒體基因與細胞核基因進行研究。【本研究切入點】至今，有關廣西羅非魚的相關研究已有較多報道（強竣等，2012;Giery et al.，2015;沈夏霜等，2018），但尚無基于分子生物學對廣西右江流域野生羅非魚入侵種群進行研究的報道。【擬解決的關鍵問題】基于DNA分子鑒定對廣西隆安、平果、田東、田陽及百色5個采樣點的野生羅非魚樣本進行比對分析，通過設計引物對群體線粒體COⅠ基因及細胞核enc1、ptr和sh3px3基因進行PCR擴增測序（Li et al.，2007），旨在明確廣西右江流域野生羅非魚的種群類別及其雜合情況，為廣西右江流域羅非魚的入侵防控及本土珍稀物種保護提供科學依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

2017年7月，在廣西隆安、平果、田東、田陽和百色5個采樣點進行羅非魚樣本采集，采集方式為垂釣和網撈，采集樣本數量分別為26、36、20、30和24尾。采集后現場解剖并剪取魚類肌肉組織，分別裝入2.0 mL的離心管中，按照采樣點粗略分類。羅非魚肌肉組織10000 r/min離心3 min，采用移液槍吸取水分后，以無水乙醇浸泡換洗2次，每次換洗后倒掉溶液并置于通風櫥風干（劉軍等，2016），最后將肌肉組織浸泡在無水乙醇中，對每份組織樣本進行無序隨機標號，號碼前面標記采樣點名字的兩個拼音首字母，如隆安寫作LA。

1. 2 DNA提取

取出浸泡在無水乙醇中的羅非魚肌肉組織，剪取小塊肌肉并以雙蒸水沖洗2次以上，將其剪碎后放入2.0 mL的離心管內，10000 r/min離心5 min，棄上清液（王娜泠等，2017）。使用DP324海洋動物基因組提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]進行DNA提取，以2.0%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，然后在凝膠成像系統上觀察拍照（Rognon and Guyomard，1997;Ward et al.，2008），保留條帶明亮或稍暗的樣本進行后續試驗，未擴增出條帶的樣本則進行DNA提取重復試驗。

1. 3 PCR擴增及產物檢測

以引物COⅠ-F和COⅠ-R對線粒體COⅠ基因進行PCR擴增（郭新紅等，2004），同時采用enc1_F85和enc1_R982、ptr_F458和ptr_R1248、sh3px3_F461和sh3px3_R1303分別對細胞核基因enc1、ptr和sh3px3進行PCR擴增（李晶等，2013）。所有引物均由北京擎科新業生物技術有限公司合成，引物信息及其反應體系分別見表1和表2。

1. 4 統計分析

對PCR擴增產物進行凝膠電泳檢測，在凝膠成像系統上觀察拍照，將擴增效果良好的條帶送至北京擎科新業生物技術有限公司測序。通過DNASTAR 7.1的Megalign程序，將所有樣本的COⅠ基因序列與GenBank中不同種羅非魚相應位置序列進行同源性比對分析，以確定羅非魚樣本的母本。enc1、ptr和sh3px3基因測序結果均采用MEGA 6.0進行序列比對和校正（Tamura et al.，2013），并通過鄰位相連法（Neighbor-joining，NJ）構建各采樣點樣本的系統發育進化樹（李晶等，2013;Tamura et al.，2013），Bootstrap重復次數設為1000。

2 結果與分析

2. 1 PCR擴增結果

PCR擴增效果良好。以百色羅非魚樣本的ptr和sh3px3基因為例，2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果（圖1）顯示，擴增獲得的條帶大小約700 bp，清晰明亮，且無特異性擴增條帶，也沒有引物二聚體產生，可用于后續研究。

2. 2 COⅠ基因序列分析結果

以百色羅非魚樣本為例進行同源性比對分析，圖2最右側縱列KU565867.1、HM882909.1、EU751879.1和KJ553787.1分別對應NCBI中尼羅羅非魚、齊氏羅非魚、莫桑比克羅非魚和奧利亞羅非魚的COⅠ基因編號及其序列;從第5行起為百色羅非魚樣本的COⅠ序列編號，編號最前面的兩個字母為地名縮寫，數字為樣本序號，如BS-C1_CF即為百色羅非魚1號樣本。同源性比對分析結果顯示，尼羅羅非魚、齊氏羅非魚、莫桑比克羅非魚和奧利亞羅非魚的COⅠ基因序列分別與本研究中5個采樣點羅非魚樣本的相應序列匹配度很高，同源性均在98.0%以上;尼羅羅非魚、莫桑比克羅非魚和奧利亞羅非魚COⅠ基因的同源性也較高（92.0%～96.0%），與其同為Oreochromis屬的實際情況相符，說明同屬異種羅非魚具有極高的基因相似度;齊氏羅非魚與其他3種羅非魚的同源性相對較低（85.0%～89.0%），與齊氏羅非魚和其他3種羅非魚不同屬的情況也相符。

羅非魚樣本的母本種類可確定為4種：尼羅羅非魚、齊氏羅非魚、莫桑比克羅非魚和奧利亞羅非魚。基于羅非魚COⅠ基因序列鑒定結果（表3）可知，所有羅非魚樣本中母本為尼羅羅非魚的數量最多，齊氏羅非魚次之，莫桑比克羅非魚和奧利亞羅非魚數量相對較少;各采樣點的羅非魚樣本中，母本為尼羅羅非魚的比例最高;除田東之外，其他采樣點羅非魚樣本的母本均以齊氏羅非魚的比例次之，而莫桑比克和奧利亞羅非魚的比例相對較低，其中，百色和隆安兩個采樣點未檢出以奧利亞羅非魚作為母本的樣本，而在田東采樣點未檢出以齊氏羅非魚和莫桑比克羅非魚作為母本的樣本。

2. 3 核基因的系統發育進化分析結果

基于enc1、ptr和sh3px3基因分別構建獲得3種系統發育進化樹，每個分支后的字母為地點名縮寫，中間數字為羅非魚樣本序號，后面字母為其COⅠ基因對母本的鑒定結果。以N代替尼羅羅非魚、Z代替齊氏羅非魚、M代替莫桑比克羅非魚、A代替奧利亞羅非魚，特殊序號0 N和0 Z分別代表從NCBI中檢索到的純系尼羅羅非魚和齊氏羅非魚各核基因序列（表4）。

3種核基因的系統發育進化樹（圖3～圖5）顯示，每種系統發育進化樹中所有樣本均聚類成兩大分支，分別代表兩個不同的屬，即齊氏羅非魚的Coptodon屬和其他3種羅非魚的Oreochromis屬。齊氏羅非魚個體間的遺傳距離較小，系統發育進化樹分支整齊，且節點支持率高，大多都在60.0%以上;奧利亞羅非魚和尼羅羅非魚同屬不同種羅非魚分為兩支，其遺傳距離較大;而莫桑比克羅非魚幾乎完全和尼羅羅非魚聚為一支，其遺傳距離非常小，難以進行區分辨別。

基于enc1基因的系統發育進化樹（圖3）顯示，田陽45號（TY45A）、平果2號（PG2A）和15號（PG15A）、田東3號（TD3A）和19號（TD19A）樣本的母本為奧利亞羅非魚，但未與奧利亞羅非魚聚成一支，反而處于尼羅羅非魚分支內，可認定其為雜合個體;百色7號（BS7Z）和19號（BS19Z）樣本的母本為齊氏羅非魚，但處于不同屬的尼羅羅非魚分支內，也認定其為雜合個體。基于ptr基因的系統發育進化樹（圖4）顯示，田陽40號（TY40Z）樣本的母本為齊氏羅非魚，卻分類在不同屬的奧利亞羅非魚分支內，可認定其為雜合個體。基于sh3px3基因的系統發育進化樹（圖5）顯示，平果1號（PG1Z）、百色20號（BS20Z）和21號（BS21Z）樣本的母本為齊氏羅非魚，雖然其在齊氏羅非魚屬分支內，但與其他大多數齊氏羅非魚并不在同種的分支內，且距離稍遠，節點支持低，故認為其與純合齊氏羅非魚具有一定的遺傳距離，即為雜合個體。

綜上所述，在26尾隆安羅非魚樣本中無雜合個體;在36尾平果羅非魚樣本中有3個雜合個體，雜合個體數占該采樣點羅非魚樣本總數的8.3%;在20尾田東羅非魚樣本中有2個雜合個體，雜合個體數占該采樣點羅非魚樣本總數的10.0%;在30尾田陽羅非魚樣本中有2個雜合個體，雜合個體數占該采樣點羅非魚樣本總數的6.7%;在24尾百色羅非魚樣本中有4個雜合個體，雜合個體數占該采樣點羅非魚樣本總數的16.7%。

3 討論

本研究的COⅠ基因同源性比對及系統發育進化分析結果顯示，26尾隆安羅非魚樣本的母本種類有尼羅羅非魚、齊氏羅非魚和莫桑比克羅非魚，雜合率為0;36尾平果羅非魚樣本的母本種類有尼羅羅非魚、齊氏羅非魚、莫桑比克羅非魚和奧利亞羅非魚，雜合率為8.3%;20尾田東羅非魚樣本的母本種類有尼羅羅非魚和奧利亞羅非魚，雜合率為10.0%;30尾田陽羅非魚樣本的母本種類有尼羅羅非魚、齊氏羅非魚、莫桑比克羅非魚和奧利亞羅非魚，雜合率為6.7%;24尾百色羅非魚樣本的母本種類有尼羅羅非魚、齊氏羅非魚和莫桑比克羅非魚，雜合率為16.7%。除了隆安羅非魚沒有種間雜交情況外，廣西右江其他河段羅非魚均存在種間雜交情況。說明在廣西右江流域，野生羅非魚的確存在著雜合情況，但雜合現象不明顯，且雜合率并不高。

本研究發現近乎一半的雜合個體，其母本是奧利亞羅非魚，另一半則為齊氏羅非魚。以奧利亞羅非魚和尼羅羅非魚可雜交出尼奧羅非魚（奧利亞♀+尼羅♂），且奧利亞羅非魚（♀）與尼羅羅非魚（♂）的雜交后代表現出高雄性率和雜交雙重優勢（萬松良等，2018）。由系統發育進化分析結果可知，所有母本為奧利亞羅非魚的雜合個體均處于尼羅羅非魚分支內，COⅠ基因在線粒體內繼承自母本，核基因則繼承自父本和母本，因此可確定是奧利亞羅非魚（♀）與尼羅羅非魚（♂）雜交。雜交產生的子代具有雜交優勢，盡管雜合情況并不嚴重，但仍會對當地生態環境和生物多樣性造成威脅。李莉好等（2008）研究表明，尼羅♀+奧利亞♂雜交產生的子代較奧利亞♀+尼羅♂雜交產生的子代具有更強的遺傳多樣性和多態性，因而擁有更強的雜交優勢。本研究中并未發現以尼羅羅非魚為母本的雜合個體，只出現奧利亞♀+尼羅♂的雜交方式，可能是不同羅非魚種群的性別比例不同所致。此外，系統發育進化分析結果顯示齊氏羅非魚與其他羅非魚雖不在同一屬內，但其雜交數仍占羅非魚樣本雜交總數的一半，說明羅非魚可進行屬間雜交，且較頻繁，也表明齊氏羅非魚具有很強的雜交能力。王金龍等（2007）也曾研究證實，奧利亞羅非魚同樣擁有強大的雜交能力，其作為母本可與作為父本的鱖（Siniperca chuatsi）進行科間雜交，并產生可育后代。

在羅非魚種群雜合率表現最低的隆安羅非魚樣本中，發現其母本僅有尼羅羅非魚、齊氏羅非魚和莫桑比克羅非魚，而未檢出奧利亞羅非魚，進一步說明奧利亞羅非魚雜交占據野生羅非魚雜交的比例很高。在羅非魚種群雜合率最高的百色羅非魚樣本中，同樣未檢出以奧利亞羅非魚作為母本的雜合個體，也說明齊氏羅非魚雜交占據野生羅非魚雜交的比例很高。在平果羅非魚樣本中同時發現有4種羅非魚作為母本，理論上應具有較高的雜合率，但其雜合率僅8.3%;在田陽羅非魚樣本中，其羅非魚種類構成與平果羅非魚樣本相似，雜合率同樣不高，僅6.7%。究其原因可能與各羅非魚種群的數量、種群性比構成及外部溫度等因素不同有關。田東羅非魚樣本的母本種類只有尼羅羅非魚和奧利亞羅非魚，其雜合率卻達10.0%，表明尼羅羅非魚與奧利亞羅非魚在自然條件下可發生雜交，且具有較高的雜合率。

在廣西右江流域完成入侵的羅非魚主要以尼羅羅非魚和齊氏羅非魚為主，同時存在一些其他種類的羅非魚，如莫桑比克羅非魚和奧利亞羅非魚等。豐富的入侵種類為羅非魚種間幾乎不存在的生殖隔離提供了良好雜交基礎，同時由于外界環境壓力的作用，致使廣西右江上游羅非魚雜合情況極其普遍。在本研究的5個采樣點中，羅非魚雜合率最高的百色采樣點處于廣西右江最上游，漁業資源豐富，水流較緩，有利于魚類繁殖;而沒有種間雜交的隆安采樣點處于廣西右江最下游，地勢低，水流較湍急，不利于魚類產卵繁殖，說明環境因素可能是影響羅非魚種間雜合的重要因素之一。這與高天揚等（2018）對北江魚類群落進行調查的結果相似，上游魚類多樣性多于下游，即上游魚類擁有更多的捕食與繁衍機會。

羅非魚具有適應性強、發病少、耐低氧、食性雜、繁殖快及生長快的特性，是聯合國糧食及農業組織（FAO）向全世界大力推廣的優良養殖品種（譚細暢等，2012），但這些特性也促使羅非魚成為世界性生物入侵魚類（Peterson et al.，2006）。羅非魚種間雜交表現出一定的雜交優勢，如奧利亞羅非魚（♀）與尼羅羅非魚（♂）的雜交后代表現出高雄性率和雜交雙重優勢（萬松良等，2018），莫桑比克羅非魚與紅羅非魚或尼羅羅非魚的雜交后代均具有更強的耐高鹽性（Urmaza and Aguilar，2005）。這種雜交優勢進一步提升了羅非魚對環境的適應能力，使其能更快地適應新的生境，提高存活率。雜合羅非魚對環境適應能力的增強加快了羅非魚對本土魚類生態位的侵占，而導致本土魚類資源多樣性受到嚴重威脅（周輝明等，2011）。廣西右江流域野生羅非魚的雜合率雖然不高，但仍然建議有關管理部門加強對野生羅非魚的監管力度，采取有針對性的措施降低羅非魚種群的分布和擴散，建立完善的本土魚類保護機制，以保護廣西右江流域魚類資源多樣性和生物完整性。

4 結論

廣西右江流域野生羅非魚的種間雜合率并不高，但其雜交優勢更有利于羅非魚種群的擴散，進一步侵占土著魚種的生存空間，嚴重威脅廣西右江流域魚類資源的多樣性，有關部門應加強監管力度以防止野生羅非魚種群迅速擴散。

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（責任編輯 蘭宗寶）