CIK細胞在不同培養基下的生物學活性

蔡惠寧 李翠平 陳曉燕 鄭小芳 陳文捷

[摘要]目的：探討兩種不同培養基誘導CIK細胞的差異。方法：健康自愿者來源的外周血單個核細胞（PBMC）.分別加入CTS培養和H3培養基中進行誘導培養，在培養的第0、3、7、10、12、14天分別取細胞進行計數，每日電子顯微鏡下觀察細胞狀態，在培養的第10天以流式細胞術檢測兩組培養細胞表面CD3、CD56的表達情況。結果：CIK培養基和H3培養基均可使培養細胞在第7天時開始明顯擴增，第10天時可擴增至200倍。其中，CIK培養基獲得的細胞擴增倍數明顯高于H3培養基（P<0.05）;流式結果CD3/CD56顯示兩種培養基無明顯差異。結論：不同成分的CTS培養基和H3培養基均可促進CIK細胞的擴增和成熟，但呈現不同生物學特征。

[關鍵詞]CIK細胞;培養基;增殖率;表型

[中圖分類號]R329 [文獻標識碼]A [文章編號]2096-5249（2019）19-0032-02

腫瘤的生物免疫治療作為第四種治療手段日益受到重視。細胞因子誘導的殺傷細胞（cytokine-induced killercell，CIK）是腫瘤生物免疫治療的主力軍。國內的一些臨床研究機構也相繼開展了這方面的研究工作并取得了一定的成效。但是，目前CIK細胞的制備尚沒有統一的規范，各個研究中心報道的培養方法并不一致，所制備CIK細胞的擴增倍數、細胞表型、生物學活性等均存在一定的差異。本研究利用兩種不同培養基，使用標準的實驗室培養方法（SOP），將人外周血淋巴細胞誘導成CIK，分析不同培養基獲得的CIK細胞的擴增倍數，細胞表型等生物學特征，旨在為標準化使用CIK治療提供相應的參考。

1 材料與方法

1.1主要材料無血清AIM V MED CTS培養基（InvitrogenTrading，Gibco批號：1776632），無血清了akara H3培養基（寶日醫，Takara批號：WKl60315），流式細胞儀檢測用抗人CD3/CD56熒光抗體購自BD公司。

1.2CIK細胞培養取肝素抗凝的健康志愿者外周血30ml，用人淋巴細胞分離液密度梯度離心（800g，20min），吸取白膜層，置于15ml離心管中，用生理鹽水洗滌3次，分別用CTS培養基和H3培養基（含低濃度IL-2，IFN-r懸浮細胞，調整細胞密度為1X105/ml，加入75cm2培養瓶，37℃，5%CO2培養箱培養。根據細胞生長情況補加培養基并擴大培養。

1.3顯微鏡觀察CIK細胞的增殖細胞培養至第O、3、7、10、12、14天時，顯微鏡下觀察細胞生長情況;取樣進行細胞計數，用臺盼藍染色檢測細胞活力。

1.4流式細胞儀檢測ClK細胞表型細胞培養10d后，取一定數量細胞洗滌離心，用PBS調整細胞密度至1X106/ml，加入流式管中，200ul/管;分別加入抗人CD3/CD56抗體，置暗處4℃標記20min，PBS洗滌2次，用流式細胞儀進行檢測。

1.5統計學處理使用SPSSl8.0統計軟件進行處理，計量資料進行描述性統計，變量用（x±s）表示;治療前后結果比較，采用單因素重復測量方差分析，若P<0.05，則應用Bonferroni多重比較，進行治療前與治療后兩兩比較。

2 結果

2.1兩種培養基體外誘導ClK細胞的增殖水平

實驗結果（圖1）顯示

兩種培養基在第0、3、7天時增殖速度無明顯差異，在第10天后出現差異性，用CTS培養基獲得的CIK細胞擴增倍數明顯高于H3培養基（P<0.05）。培養期間，臺盼藍染色活力檢測顯示，以兩種培養基獲得的CIK細胞活力均大于98%。CTS培養基誘導10d的細胞呈明顯克隆生長，H3培養基則較少（圖2）。

2.2兩種培養基誘導的ClK細胞表型細胞培養至第10天時，流式細胞術進行檢測，結果（圖3，表1）顯示，CTS培養基和H3培養基誘導的CIK細胞中CD3CD56細胞百分比分別為（2.3±1.8）%和（1.8±0.5）%;CD3CD56細胞百分比分別為（1.5±0.8）%和（3.7±1.5）%;CD3細胞百分比分別為（92.3±5.8）%和（85.9±15.5）%。

3 討論

CIK細胞是在體外條件下通過加入不同的細胞因子（IFN-r、IL-1、IL-2、CD3McAb）刺激外周血單個核細胞培養誘導而成，同時表達CD3、CD56兩種膜蛋白分子。與既往臨床使用的過繼免疫療法相比，CIK細胞具有增殖速度快、殺瘤活性高、殺瘤譜廣、對多重耐藥腫瘤細胞同樣敏感、對正常骨髓造血前體細胞細胞毒性小等特點，是目前發現的殺傷腫瘤細胞活性強，適合臨床應用的一種理想的效應細胞，其療效主要體現在控制腫瘤復發及提高生活質量等方面。CIK細胞治療腫瘤的療效主要取決于輸注的有效細胞數量及其殺傷活性。

本研究比較了兩種不同的培養基誘導刺激對人外周血單個核細胞制備CIK的影響，結果發現，兩種培養基均使培養細胞在第7天時即開始明顯擴增，在培養10d時即可擴增至300倍左右，用CTS培養基獲得的CIK細胞擴增能力明顯高于H3培養基。CTS培養基所獲得的CIK細胞中，CD3細胞百分比明顯高于H3培養基;CD3CD56CD3CD56細胞百分比無明顯差異。說明CTS培養基可以在體外快速擴增CIK細胞，且T細胞純度較高，有利于為今后體外高效擴增培養CIK提供一定的參考。