金訶含片抗PM 2.5作用研究

張義智 邵成雷 王振 姬濤 侯曉群

[摘要]斑馬魚注射給予納米活性炭，建立斑馬魚納米活性炭分泌進入腸道功能評價模型。結果顯示：金訶含片濃度為56、167和500ug/mL時，納米活性炭分泌發生率分別為10.0%、20.0%和23.3%，與模型對照組（10.0%）比較P均>0.05，提示金訶含片在56、167和500ug/mL濃度時對斑馬魚分泌納米活性炭進入腸道有促進趨勢，但在統計學上無顯著性差異。

[中圖分類號]R285.5[文獻標識碼]A [文章編號]2096-5249（2019）22-0007-02

1金訶含片和金嗓子喉片的最大耐受濃度（MTC）測定

觀察測定金訶含片和金嗓子喉片對斑馬魚的最大耐受濃度（MTC），以確定后續的功能性實驗評價采用給藥濃度。

1.1受試動物 黑色素等位基因突變型Albino品系斑馬魚，由杭州環特生物科技股份有限公司培育，共390尾。實驗動物使用許可證號為：SYXK（浙）2012-0171。

1.2受試藥物 金訶含片，棕色粉末，于2017年09月11日收樣，由金河藏藥（山東）健康產業有限公司提供，常溫陰涼避光保存。臨用前用超純水配制成濃度為50mg/mL的母液，-20℃保存。臨用時用養魚水按需稀釋。

1.3儀器與試劑 解剖顯微鏡（型號SZX7，OLYMPUS，日本）;精密電子天平（型號CP214，奧豪斯）;六孔板（型號Fisher Scientific，中國）。

1.4濃度組別 實驗1組正常對照組，實驗2組金訶含片125ug/mL，實驗3組金訶含片250ug/mL，實驗4組金訶含片500ug/mL，實驗5組金訶含片1000ug/mL，實驗6組金訶含片1500ug/mL，實驗7組金訶含片2000ug/mL。

1.5實驗方法 選取受精后2天黑色素等位基因突變型Albino品系斑馬魚390尾，分成正常對照組，藥物組（金訶含片組，金嗓子喉片組）。藥物組分別水溶給予金訶含片和金嗓子喉片125、250、500、1000、1500和2000ug/mL濃度，正常對照組采用養魚用水正常飼養斑馬魚，每孔斑馬魚30尾，每孔3mL，確保每天更換藥液，處理5天，處理結束后，觀察記錄斑馬魚的死亡情況，統計各組斑馬魚死亡數量以及毒性情況，確定藥物組最大耐受濃度。

1.6實驗結果金訶含片在125、250和500ug/mL濃度下，斑馬魚均未出現死亡，也未見任何異常表型;在1000、1500和2000ug/mL濃度下，斑馬魚均出現死亡，死亡率分別為6.7%、16.7%和66.7%。根據實驗結果，確定金訶含片對斑馬魚的最大耐受濃度（MTC）為500ug/mL。

金嗓子喉片在125至2000ug/mL濃度下，斑馬魚均未出現死亡，也未見任何異常表型。根據本實驗的SOP規定（供試品的檢測濃度范圍，上限為2000ug/mL或最大溶解度）和本實驗結果，確定金嗓子喉片對斑馬魚的最大耐受濃度（MTC）大于2000ug/mL。

1.7實驗結論在本實驗濃度條件下，山東金訶藥物研究開發有限公司于2017年09月11日提供的金訶含片對斑馬魚的最大耐受濃度為500ug/mL，金嗓子喉片對斑馬魚的最大耐受濃度大于2000ug/mL。

2 金訶含片對PM2.5分泌促進作用的評價

2.1實驗目的觀察評價金訶含片對斑馬魚體內PM2.5分泌的促進作用，為金訶含片在抗PM2.5領域開發提供參考。

2.2受試動物黑色素等位基因突變型Albino品系斑馬魚，由杭州環特生物科技股份有限公司培育，共240尾。實驗動物使用許可證號為：SYXK（浙）2012-0171。用于金訶含片對PM2.5分泌的促進作用實驗。

2.3受試藥物金訶含片，棕色粉末，于2017年09月11日收樣，由山東金訶藥物研究開發有限公司提供，常溫陰涼避光保存。臨用前用超純水配制成濃度為50mg/mL的母液，-20℃保存。臨用時用養魚水按需稀釋。

2.4儀器與試劑甲基纖維素（型號Sigma，中國）;解剖顯微鏡（型號SZX7，OLYMPUS，日本）;精密電子天平（型號CP214，奧豪斯）;六孔板（型號Fisher Scientific，中國）;顯微注射儀（型號IM-300，Narishige）;拉針儀（型號PC-10，Narishige，日本）。

2.5濃度組別實驗1組正常對照組，實驗2組模型對照組，實驗3組金訶含片56gg/mL，實驗4組金訶含片167ug/mL，實驗5組金訶含片500ug/mL，實驗6組金嗓子喉片222ug/mL，實驗7組金嗓子喉片667ug/mL，實驗8組金嗓子喉片2000ug/mL。

2.6濃度確定依據 根據金訶含片（對斑馬魚的最大耐受濃度（MTC）為500ug/mL）和金嗓子喉片（對斑馬魚的最大耐受濃度（MTC）大于2000ug/mu對斑馬魚的最大耐受濃度：金訶含片對PM2.5分泌的促進作用評價實驗濃度設計為56ug/mL（1/9MTC）、167ug/mL（1/3MTC）和500ug/mL（MTC）;金嗓子喉片對PM2.5分泌的促進作用評價實驗濃度設計為222ug/mL（1/9MTC）、667ug/mL（1/3MTC）和2000ug/mL（MTC）。

2.7模型制作以納米活性炭作為PM2.5來源，將納米活性炭（濃度2.3mg/mL）注射到斑馬魚卵黃囊中劑量：69ng/尾，造模。

2.8實驗方法選取斑馬魚240尾，分成正常對照組，藥物組（金訶含片組，金嗓子喉片組）。將納米活性炭注射到斑馬魚卵黃囊中建立斑馬魚納米活性炭分泌進入腸道功能評價模型。模型斑馬魚分別水溶給予金訶含片56、167、500ug/mL濃度和金嗓子喉片222、667、2000ug/mL濃度，每孔斑馬魚30尾，每孔3mL，確保每天更換藥液。金訶含片和金嗓子喉片處理5天結束后，分別統計斑馬魚發生體內納米活性炭分泌進入腸道的總數量（Z），通過與模型對照組比較（卡方檢驗），評價金訶含片對納米活性炭分泌進入腸道功能的影響。納米活性炭分泌發生率計算公式如下。

進行統計學分析，采用方差分析和Dunnett's±-檢驗的方法，以P<0.05作為具有顯著性差異評價指標。

2.9實驗結果金訶含片濃度為56、167和500ug/mL時，納米活性炭分泌發生率分別為10.0%、20.0%和23.3%，與模型對照組（10.0%）比較P均>0.05，提示金訶含片在56、167和500ug/mL濃度時對斑馬魚分泌納米活性炭進入腸道有促進趨勢，但在統計學上無顯著性差異。

2.10實驗結論在本實驗濃度條件下，金訶含片和金嗓子喉片有促進斑馬魚分泌納米活性炭進入腸道的趨勢。

4討論

斑馬魚（Danio rerio）是一種簡單的生物實驗動物，具有和哺乳動物相似的生物結構和生理功能。幾乎透明的胚胎、胚胎的體外發育以及與人類高達87%的基因相似性，使得斑馬魚被廣泛用于藥學領域的研究。模式動物斑馬魚在生態毒理學、發育遺傳學等研究領域已得到廣泛應用。近年來，斑馬魚模型已拓展延伸至人類疾病動物模型、藥物體內代謝及創新藥物篩選研發等諸多方面。國內最新外文獻表明，斑馬魚模型在推動疾病動物模型、藥物活性篩選及代謝研究方向的研究取得了很大進展。本實驗首次將斑馬魚模型用于評價抗霧霾作用，為其拓展應用提供參考。