實(shí)驗(yàn)大小鼠病原微生物檢測(cè)技術(shù)及檢測(cè)常見(jiàn)問(wèn)題

章蓉 舒加樂(lè)

摘要：該文通過(guò)概括實(shí)驗(yàn)大小鼠病原微生物的檢測(cè)技術(shù)及在檢測(cè)工作中遇到的常見(jiàn)問(wèn)題分析，對(duì)病原微生物質(zhì)量控制的必要性進(jìn)行闡明，為檢測(cè)實(shí)驗(yàn)方法的建立提供參考幫助。

關(guān)鍵詞：實(shí)驗(yàn)大小鼠;病原微生物;檢測(cè)

中圖分類號(hào)：R33 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B doi：10.3969/j.issn.2096-3637.2019.19.032

0 引言

隨著我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)的不斷發(fā)展，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量有了質(zhì)的提升，對(duì)使用的實(shí)驗(yàn)大小鼠的質(zhì)量也有更高的要求。實(shí)驗(yàn)大小鼠質(zhì)量污染可以分為2類：微生物污染、基因污染。微生物污染包括細(xì)菌病毒、寄生蟲(chóng)，基因污染包括基因漂移缺失。為保障動(dòng)物使用者的生物安全和實(shí)驗(yàn)大小鼠的動(dòng)物福利，對(duì)實(shí)驗(yàn)大小鼠病原微生物污染的檢測(cè)顯得更為重要

檢測(cè)實(shí)驗(yàn)大小鼠的病原微生物種類是質(zhì)量檢測(cè)的主要目的[1]，其中的病原微生物主要指國(guó)標(biāo)GB14922.2-2011中規(guī)定的細(xì)菌、病毒、寄生蟲(chóng)等等?？焖?、高效、準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病原微生物檢測(cè)方法可以提高試驗(yàn)結(jié)果的可信度。如果國(guó)標(biāo)中規(guī)定的不允許出現(xiàn)的微生物被檢出，輕的會(huì)引起實(shí)驗(yàn)大小鼠患病、影響試驗(yàn)的數(shù)據(jù)和結(jié)果拖延科研進(jìn)程，重的可能會(huì)引起人畜共患病的傳播流行，造成公共安全事故[2]。實(shí)驗(yàn)大小鼠微生物的檢測(cè)必須得到重視，它是科研服務(wù)、公共衛(wèi)生安全的基礎(chǔ)保障。

目前最常用的檢測(cè)方法有培養(yǎng)基檢測(cè)法及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法等。其中使用的設(shè)備均是常規(guī)科研設(shè)備[3]。實(shí)驗(yàn)大小鼠病原微生物檢測(cè)對(duì)專業(yè)水平要求很高，檢測(cè)人員必須熟練掌握微生物學(xué)相關(guān)知識(shí)和實(shí)驗(yàn)操作技能。同時(shí)，病原菌檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境必須受到嚴(yán)格控制，必須達(dá)到生物安全實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)大小鼠病原微生物的檢測(cè)工作較為復(fù)雜，樣品污染可能出現(xiàn)在取樣、運(yùn)輸、檢測(cè)等各個(gè)環(huán)節(jié)。保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確也是工作的重點(diǎn)。

1 檢測(cè)技術(shù)

1.1 培養(yǎng)鑒定技術(shù)

分離培養(yǎng)是實(shí)驗(yàn)大小鼠國(guó)標(biāo)中檢測(cè)細(xì)菌的標(biāo)準(zhǔn)方法，也是目前最常使用的一種細(xì)菌定性檢測(cè)技術(shù)。不同類型、不同種類的微生物對(duì)培養(yǎng)基的要求不一樣，因此在對(duì)樣本進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)中，需要嚴(yán)格區(qū)分培養(yǎng)基的種類與范圍。分離培養(yǎng)是利用在特定培養(yǎng)基中加入指示劑和反應(yīng)底物，使目標(biāo)病原菌產(chǎn)生特定的顏色形態(tài)或熒光等，將目標(biāo)病原菌與其他雜菌相區(qū)分。之后將目標(biāo)病原菌分離純化，再用生化原理，對(duì)病原菌生長(zhǎng)代謝中產(chǎn)生的特異性酶類進(jìn)行鑒定。該檢測(cè)方法具有直觀性，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求不高。但缺點(diǎn)是耗時(shí)長(zhǎng)、操作復(fù)雜、需要操作人員有豐富經(jīng)驗(yàn)。

1.2 免疫學(xué)技術(shù)

免疫學(xué)檢測(cè)方法是國(guó)標(biāo)中對(duì)培養(yǎng)條件苛刻的病原菌及病毒檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法，該方法是根據(jù)抗原抗體特異性反應(yīng)對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定。包括酶聯(lián)免疫吸附法、免疫磁珠分離法、雙功能抗體檢測(cè)技術(shù)、膠體金技術(shù)等。其中的酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法（ELISA）是目前發(fā)展較為成熟的免疫學(xué)檢測(cè)方法，是利用實(shí)驗(yàn)大小鼠血清中病原微生物產(chǎn)生的抗體與檢測(cè)板中預(yù)包被的特異性抗原的結(jié)合，再輔以顯色劑，使感染某種病原微生物并產(chǎn)生抗體的實(shí)驗(yàn)大小鼠血清可通過(guò)分光光度計(jì)的讀數(shù)，進(jìn)行判定的一種檢測(cè)方法。該方法可用于檢測(cè)國(guó)標(biāo)中清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)大小鼠必須排除的泰澤菌、支原體及病毒等。酶聯(lián)免疫吸附法的優(yōu)點(diǎn)是耗時(shí)短，操作簡(jiǎn)單，中間步驟少，避免了交叉污染等不確定因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。但其成本較高，且存在由于抗原特異性低而造成的假陽(yáng)性結(jié)果。

1.3 分子生物學(xué)技術(shù)

PCR技術(shù)是一種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，可使極其微量的某一特定序列的DNA片段在應(yīng)用特異性的引物擴(kuò)增到百萬(wàn)倍以上，能準(zhǔn)確地檢測(cè)一些人工無(wú)法培養(yǎng)或難以培養(yǎng)的微生物，提高對(duì)實(shí)驗(yàn)大小鼠微生物感染的診斷檢查內(nèi)容和診斷能力。隨著分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，PCR技術(shù)已在病原微生物的檢測(cè)中廣被泛應(yīng)用[4]。而以PCR為基礎(chǔ)的基因芯片技術(shù)也逐漸應(yīng)用在其中。另外，PCR技術(shù)還可以通過(guò)使用通用引物，對(duì)其產(chǎn)物的序列進(jìn)行分析，同數(shù)據(jù)庫(kù)中已有微生物序列進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)而準(zhǔn)確鑒定病原微生物的種類，極大節(jié)約人力物力財(cái)力。PCR技術(shù)具有程序快捷、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)靈敏及高特異性特點(diǎn)但其對(duì)引物特異性要求較高，需要特殊的實(shí)驗(yàn)儀器，對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境要求嚴(yán)格，一旦出現(xiàn)分子層面的體系污染，則很難徹底清除。

1.4 體內(nèi)外寄生蟲(chóng)檢測(cè)技術(shù)

體表寄生蟲(chóng)可以通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)大小鼠進(jìn)行輕度麻醉后，根據(jù)寄生蟲(chóng)生活習(xí)性及寄居部位，直接在顯微鏡下鏡檢。體內(nèi)寄生蟲(chóng)則需要將送檢動(dòng)物安樂(lè)死后，取盲腸內(nèi)容物進(jìn)行涂片和懸浮后，顯微鏡下進(jìn)行鏡檢。直觀快速的顯微鏡下直接鏡檢只針對(duì)成蟲(chóng)，而蟲(chóng)卵是實(shí)驗(yàn)大小鼠污染寄生蟲(chóng)的最大隱患，蟲(chóng)卵對(duì)惡劣環(huán)境及消毒劑的抵抗力也強(qiáng)于成蟲(chóng)，成蟲(chóng)一旦產(chǎn)卵，蟲(chóng)卵數(shù)量驚人，且很難徹底清除，因此，對(duì)寄生蟲(chóng)蟲(chóng)卵的檢測(cè)顯得更為重要，針對(duì)實(shí)驗(yàn)大小鼠體外寄生蟲(chóng)蟲(chóng)卵，可以麻醉后直接鏡檢，如螨蟲(chóng)蟲(chóng)卵通常會(huì)在實(shí)驗(yàn)大小鼠毛根處粘附的米白色、橢圓形蟲(chóng)卵，且很難從毛根處取下。實(shí)驗(yàn)大小鼠體內(nèi)寄生蟲(chóng)蟲(chóng)卵，需排出體外后才能進(jìn)行傳播，因此可根據(jù)成蟲(chóng)產(chǎn)卵習(xí)性，進(jìn)行檢測(cè)，如蠕蟲(chóng)成蟲(chóng)通常會(huì)在實(shí)驗(yàn)大小鼠肛周進(jìn)行產(chǎn)卵，使用透明膠帶粘取肛周皮膚，再將透明膠帶粘于載玻片上鏡檢，即可直接觀察到成紡錘狀蟲(chóng)卵。直接在實(shí)驗(yàn)大小鼠腸道內(nèi)產(chǎn)卵的寄生蟲(chóng)，則需要在動(dòng)物糞便中進(jìn)行蟲(chóng)卵的檢測(cè)，離心法、飽和鹽水漂浮法等是常用檢測(cè)寄生蟲(chóng)蟲(chóng)卵的方法。另外，PCR技術(shù)也可應(yīng)用于寄生蟲(chóng)蟲(chóng)卵的檢測(cè)。

2 常見(jiàn)問(wèn)題

實(shí)驗(yàn)大小鼠病原微生物檢測(cè)是一項(xiàng)較為復(fù)雜的工作，涉及采樣程序、樣品處理和留存、特定微生物檢測(cè)程序和方法、人員操作和經(jīng)驗(yàn)等，其中任何一個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)問(wèn)題，都會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成很大影響。

2.1 樣品采集

采樣不及時(shí)，常見(jiàn)于動(dòng)物血液采集，在動(dòng)物處于麻醉狀態(tài)或剛剛死亡后需要及時(shí)采集新鮮血液樣本，如動(dòng)物死亡時(shí)間較長(zhǎng)，血液已凝固，則無(wú)法采集到合格的新鮮血液用于血清提取。樣本采集過(guò)程中，由于采樣器械或操作環(huán)境問(wèn)題，樣本污染或多個(gè)樣本之間交叉污染。樣本采集時(shí)，未預(yù)留樣本備份，在出現(xiàn)疑似陽(yáng)性的情況下用于復(fù)檢。很多工作者的檢測(cè)意識(shí)不規(guī)范，在檢測(cè)中忽略陽(yáng)性和陰性對(duì)照組的設(shè)置，在檢出陽(yáng)性結(jié)果的同時(shí)不能判定是動(dòng)物本身的衛(wèi)生物污染還是在操作中使用的污染耗材，這就影響了最終結(jié)果的判定。由于引起實(shí)驗(yàn)大小鼠污染的微生物種類越來(lái)越多，許多國(guó)外引入的實(shí)驗(yàn)大小鼠也會(huì)帶有致病性的微生物，這也需要檢測(cè)人員具有更新更全面的專業(yè)知識(shí)。

2.2 應(yīng)對(duì)方案

首先，檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的工作人員必須有嚴(yán)格的無(wú)菌觀念。這樣既可防止試驗(yàn)操作中樣品的人為污染，又可保障工作人員的生物安全。其次，檢測(cè)人員需要不定期接受專業(yè)技能培訓(xùn)，用SOP規(guī)范檢測(cè)人員的專業(yè)操作，提高責(zé)任意識(shí)。最后，做好完整的檢測(cè)記錄，及時(shí)整理歸檔，保證所有數(shù)據(jù)的可追溯性。這樣可以準(zhǔn)確跟蹤到陽(yáng)性污染大小鼠，及時(shí)處理，避免微生物污染的傳播和擴(kuò)大。

3 結(jié)束語(yǔ)

做好病原微生物的檢測(cè)工作是實(shí)驗(yàn)大小鼠質(zhì)量控制的重要手段，需要從不同的方向進(jìn)行改進(jìn)和努力，包括購(gòu)買(mǎi)先進(jìn)檢測(cè)設(shè)備、完善檢測(cè)規(guī)章制度、提高檢測(cè)技能水平等。為得到高質(zhì)量的檢測(cè)結(jié)果，需要對(duì)每一個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行嚴(yán)格把控，這樣才能更好為國(guó)家的科研事業(yè)保駕護(hù)航。

參考文獻(xiàn)

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作者簡(jiǎn)介：章蓉（1979-），女，湖北人，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，碩士。