水稻品種Lemont抗稻瘟病基因QTL的初步定位

薛文君　宋麗　萬四新　李民　李森

摘要：用四川稻瘟病高發區的優勢稻瘟病菌生理小種對引進的水稻品種Lemont進行抗譜測試，結果表明，水稻品種Lemont中含有數個控制稻瘟病病斑和病斑數量的抗性QTL基因；通過稻瘟病抗性品種Lemont和易感品種麗江新團黑谷為親本構建了F2作圖群體，利用SSR分子標記構建遺傳圖譜，Lemont中的兩個抗瘟性QTL基因位點定位在水稻第八、十一染色體上，可以利用這些標記快速檢測相關抗性基因，通過進一步研究開發出與這兩個抗性QTL位點緊密連鎖的分子標記，為育種工作更有效地利用抗瘟性基因資源提供便利。

關鍵詞：水稻；品種Lemont；稻瘟病菌；SSR標記；QTL

四川稻區稻瘟病菌生理小種種類多、毒性強、病害發作頻率高，發病時造成水稻產量的較大減產，因而抗稻瘟病的水稻品種受到廣泛的研究，取得的成果相當豐富，一些成果也在生產上得到了應用，效果明顯。四川省農業科學院育種專家連續對新育成的具有良好抗病性的五個水稻品種進行大田誘發稻瘟病實驗，表明Lemont和其他四個水稻品種都是持久的抗稻瘟病品種；利用稻瘟病表型鑒定和SSR分子標記多態性檢測相結合的方法，在第11和第8染色體上檢測到抗性QTL位點，為實驗室利用分子標記快速檢測水稻中的這些抗性基因和進一步開發出與該位點更近更緊密的連鎖分子標記打下基礎。

一、材料和方法

（一）實驗材料

1、水稻鑒定品種、供試水稻品種與菌株。水稻鑒定品種采用國內標準水稻品種特特普（tetep）、珍龍13、四豐13、東農363、關東51、合江18與麗江新團黑谷中國7個統一的鑒別品種（全國稻瘟病菌聯合調查組1979）；供試菌株選用（2015年夏）從四川幾個稻瘟病流行稻區分離的120個菌樣，供試水稻品種為五個稻瘟病抗性品種和稻瘟病易感品種麗江新團黑谷（LTH），均由四川省農業科學院提供。

2、實驗儀器與藥品。PCR儀由BIO—RAD公司提供，主要實驗儀器、藥品及溶液配方參考金冬雁《分子克隆》第二版。

（二）實驗方法

實驗方法按照四川省農業科學院植物保護研究所提供的方法進行；親本間的SSR多態性分析、F2單株葉片DNA提取、PCR反應體系參考金冬雁《分子克隆》第二版并做適當修改；SSR Marker信息來自http：∥www.gramene.org網站；遺傳分析與作圖采用MaDmaker/exp3.0版本和Wincart軟件，在水稻第4、6、8、11和12共五條染色體上，分別對控制病斑數目和病葉面積作圖，將顯示出與抗性帶型一致的個體的帶型記做A，與易感帶型一致的個體的帶型記做B，雜合帶型記做H，輸入到Mapmaker軟件中，進行計算與作圖分析。

二、結果與分析

（一）稻瘟病菌生理小種的鑒定

在采集的120個菌樣中，鑒定出了ZB、ZC、ZG、ZE4個大群，ZB13、ZB21、ZB31、ZB29、ZBl5、ZB32、ZCl5、ZGl、ZEl共9個生理小種。

2014年與2015年相比，ZB小種呈上升趨勢。未鑒定出ZA小種，但卻出現了ZC小種。在ZB種群中檢測出6個小種。強致病力的ZF小種沒有檢測到。

由此可知，四川水稻產區的優勢稻瘟病菌種群為ZB群，其連續出現的頻率保持相對穩定，研究人員要重點觀測ZC、ZB群小種的動態變化并及時做出預警，適時推廣種植對ZC、ZB群具有抗性的優質水稻品種。

（二）抗譜測定

大區R9等六個抗性水稻品種與易感黑谷（LTH）大田測試結果表明：六個品種均表現高抗，黑谷表現為高感，這與農技人員多年的大田觀測結果一致（抗性檢測見表2、表3）。

（三）親本組合間SSR多態性分析

用合成的850對SSR標記，在五個組合間進行多態性篩選。它們與麗江新團黑谷的多態性比率分別為：R9為187/850=22%，R10為146/850=17%，3263為191/850=22.4%，448為206/850=24%，Lemont為83/850=9%。由此可知，在育種上選取差異較大的個體作為親本進行組合，取得的成效相對明顯。

1、F2定位群體的構建及表型鑒定結果。選取抗性水稻Lemont和易感黑谷（LTH）組合測試，構建作圖群體。

選取B31生理小種接種，共得到917株F2植株。Lemont及正反雜交F1鑒定為抗病，新團黑谷為感病，F2群體中抗病株數：感病株數=2.84：1；差異性檢測（p<0.05）表明，實際觀測結果與理論計算結果有較大偏差，表明來自抗性親本lemont中的抗性基因，其遺傳模式由數量性狀基因決定。

2、引物篩選。找到RM 5766、RM5985共2個共分離標記。用2個共分離標記附近新合成的41對標記在兩親本間尋找多態性，結果在11染色體上找到8個標記，在兩親本間有多態性，在8染色體上找到RM1341、RM27373。

（四）遺傳分析與抗稻瘟病QTL的定位

通過表型鑒定和分子數據分析，美國光身稻Lemont和麗江新團黑谷（LTH）組合中對B31生理小種的抗性屬于數量性狀遺傳。由于所篩選到的兩個共分離標記分別位于第11號和第8號染色體上，從F2群體中隨即挑取了180個單株，對4、6、8、11、12五條染色體作圖。部分多態性標記群體見圖1和圖2。

（五）對第11號染色體的QTL分析

用5條染色體上的多態性標記進行檢測180株F2水稻的DNA，分別以病斑數目和病葉面積百分數為表型性狀作圖，結果見表6和圖3。結果表明，在11號和第8號染色體檢測到抗性QTL，其LOD值均在10以上；以病斑數目為表型性狀檢測，發現11號染色體上有2個QTL（qtl1、qtl2），兩個峰分別位于RM27373與RM27384和RM27381與RM6904之間。以病葉面積百分數為表型性狀檢測，結果在8號染色體上檢測到兩個與病葉面積相關的qtl（qtl3、qtl4）；qtl3在標記RM5985和標記RM80之間，qtl4在標記RM5985和RM223之間，在11染色體上沒有檢測到。在8號和11號兩條染色體上添加標記后作圖，見表4-6。

以控制病葉面積大小為表型性狀，通過復合區間做圖，結果在8號染色體上SSR標記RM223附近檢測到二個控制病葉面積的qtl（qtl3、qtl4）及11染色體上的兩個qtl。

三、問題與討論

本研究以病斑數和病葉面積為表型性狀，將抗苗瘟的兩個與病斑數相關的QTL定位在11號染色體上RM27384和RM27373之間及RM6904與RM27381之間；將兩個與病葉面積相關的QTL定位在第8號染色體上RM80與RM5985及RM5985與RM223之間；但是這幾個QTL對抗病性的貢獻率都很低，最高的一個只有24%；最低的一個只有6.8%，因此，Lemont對稻瘟病的抗性可解釋為主效QTL加微效QTL共同作用的結果。初步定位的幾個QTL離最近的分子標記距離較大；在實際育種中尚有較大差距，可以通過進一步研究，開發出更近的緊密連鎖的分子標記用以抗性基因的檢測。

本研究表明五個四川水稻品種均具有多個抗稻瘟病基因，在今后的水稻育種中都是很好的抗性資源，這些水稻品種分別進行雜交就可以實現抗性基因的轉移和發揮其抗性育種的價值。然而田間觀察到的數據還受天氣等自然環境、時空條件的影響，還需進行連續的大田觀測和抗菌實驗的進一步驗證。