稀土尾礦庫滲漏水污染對花背蟾蜍胚后發育的毒性作用

黃濤 求瑞娟 等

摘要：【目的】明確稀土尾礦庫滲漏水污染對花背蟾蜍（Strauchbufo raddei）胚后發育的毒性作用，為稀土尾礦區兩棲類動物的保護提供科學依據。【方法】以內蒙古某尾礦庫南側由滲漏水形成的受污染水域濕地（簡稱尾礦庫濕地）為研究樣地、相對未受污染的黃河自然保護區小白河濕地（簡稱小白河濕地）為對照樣地，通過觀測分析花背蟾蜍的野外生態學指標、生理生化指標和遺傳毒性指標，探究稀土尾礦庫滲漏水對花背蟾蜍胚后發育的毒性效應。【結果】尾礦庫濕地花背蟾蜍的總數、種群密度、性別比例和抱對率均明顯少于小白河濕地花背蟾蜍，但產卵量極顯著高于小白河濕地（P<0.01，下同）;尾礦庫濕地的蝌蚪發育相對滯后于小白河濕地蝌蚪，但其體格整體上大于小白河濕地蝌蚪。尾礦庫濕地蝌蚪肝胰臟中的總抗氧化能力（T-AOC）呈先下降再上升的變化趨勢，于III期達最小值;而丙二醛（MDA）含量的變化趨勢恰好相反，于III期達最大值。尾礦庫濕地各發育期蝌蚪血細胞DNA損傷程度均極顯著高于小白河濕地蝌蚪，且血紅細胞核異常率明顯高于小白河濕地蝌蚪。【結論】尾礦庫滲漏水污染通過影響花背蟾蜍的抱對率來降低蝌蚪種群密度，而對其胚后發育的主要影響機理是導致蝌蚪的組織氧化損傷和血細胞DNA損傷。

關鍵詞： 花背蟾蜍;尾礦庫滲漏水污染;胚后發育;種群密度;DNA損傷;微核率

中圖分類號： S865.9? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）02-0412-06

Abstract：【Objective】The toxic effects of leakage water from rare earth tailings reservoir on the postembryonic development of Strauchbufo raddei were studied in order to provide scientific basis and data support for the amphibians protecting in the tailings wetland. 【Method】The polluted wetland formed by seepage water from the south of a tailings reservoir in Inner Mongolia was taken as the study site（tailings wetland for short）， the relatively non-polluted Xiaobaihe wetland in Yellow River natural reserve as the control site（Xiaobaihe wetland for short）， and? S. raddei as the experimental animal. By measuring the ecological index， physiological and biochemical index and genetic toxicity index of S. raddei， the toxic effects of rare earth tailings leakage water on the postembryonic development of S. raddei were comparatively ana-lyzed. 【Result】The total number， population density， sex ratio and mating rate of S. raddei in tailings? wetland were greatly lower than those in Xiaobaihe wetland， but the spawning amount was extremely higher than that in Xiaobaihe wetland（P<0.01， the same below）. The development of tadpoles in tailings wetland was relatively lagging behind compared with those in Xiaobaihe wetland， but their body sizes were larger than those in Xiaobaihe wetland. The total antioxidant capacity（T-AOC） in the liver and pancreas of tailings wetland tadpoles decreased first and then increased， reaching the minimum value in stage III. On the contrary， malondialdehyde（MDA） contents showed the opposite trend and reached the maximum value in stage III. The DNA damage of blood cells of tadpoles in each development stage of tailings wetland was extremely higher than those in Xiaobaihe wetland， and the rate of red blood cell nucleus abnormality was higher than those in Xiaobaihe wetland. 【Conclusion】Water leakage pollution from tailings pond can reduce the tadpole population density by affecting the mating rate， and the main influencing mechanism of pollution on the S. raddei postembryonic development is to cause oxidative damage of tissues and DNA damage of blood cells.

Key words： Strauchbufo raddei; water leakage pollution of tailings pond; postembryonic development; population density; DNA damage; micronucleus rate

0 引言

【研究意義】尾礦庫是選礦產生的礦渣等廢棄物存放地，含有大量的有毒有害物質，而這些物質通過沉降或滲漏等作用，嚴重破壞尾礦庫周邊的生態環境（程峰等，2017;司萬童等，2017）。兩棲類動物是聯系水體與陸地環境的重要生物類群，其高滲透性皮膚吸收化學物質的速度是哺乳類動物的100倍（Brühl et al.，2013），由于這種特定的生理特征和生活史，常作為環境污染尤其是水體和沉積物污染的敏感性指示生物（Si et al.，2014）。因此，開展稀土尾礦庫復合污染對兩棲類動物的毒性作用研究，可為稀土尾礦庫周邊區域的污染監測、防控和評價提供參考依據。【前人研究進展】尾礦庫滲漏水中含有大量的重金屬、鹽離子及釷等放射性元素（Huang et al.，2014），可對周邊地上及地下區域的土壤和水體造成污染，且這些污染對礦區周邊生態環境同樣存在潛在負面影響（Si et al.，2014）。司萬童等（2013）研究表明，尾礦庫滲漏水對植物、水生動物會產生一定的毒性效應，且這種毒性效應與滲漏水污染時間及其濃度存在一定的時間—濃度—效應關系。蝌蚪是蛙和蟾蜍的水生幼體，一般幾天內就能發育成一個完整的免疫系統和復雜循環系統，常用于環境監測、抗氧化反應和氧化應激，也可作為污染物暴露的生物指示器（Isnas et al.，2012）。已有研究表明，環境污染對兩棲類動物的跳躍能力、骨骼發育、生長發育、抗氧化能力等均會產生一定負面影響（馮磊等，2012;Proki? et al.，2016），生物群體下降、兩棲類動物畸形率、死亡率增加也與環境污染密切相關（黃德軍等，2004;Si et al.，2014），如重金屬污染能改變花背蟾蜍（Strauchbufo raddei）的繁殖對策（Guo et al.，2018;Zhang et al.，2018），影響蟾蜍性腺發育（司萬童等，2017），最終導致其種群結構發生改變及種群數量下降。重金屬污染還會引起蝌蚪肝臟、腎臟組織的病理變化，且伴有抗有絲分裂活性的作用（Monteiro et al.，2018）。因此，通過開展蝌蚪受污染環境的慢性毒性測試可對重要兩棲類動物的重金屬安全級別進行科學評估。【本研究切入點】花背蟾蜍在黃河流域內蒙古段的活動非常頻繁（司萬童等，2017），在水生生物食物鏈中處于非常重要的位置，但至今尚無有關稀土尾礦庫滲漏水污染對花背蟾蜍胚后發育毒性作用的研究報道。【擬解決的關鍵問題】以內蒙古某尾礦庫南側由滲漏水形成的受污染水域濕地為研究樣地，通過觀測分析花背蟾蜍的野外生態學指標、生理生化指標和遺傳毒性指標，明確稀土尾礦庫滲漏水污染對花背蟾蜍胚后發育的毒性作用，為稀土尾礦區兩棲類動物的保護提供科學依據。

1 材料與方法

1. 1 采樣點

研究樣地選擇內蒙古某尾礦庫南側由滲漏水形成的受污染水域濕地（下簡稱尾礦庫濕地）;對照樣地選擇相對未受污染的黃河自然保護區小白河濕地（下簡稱小白河濕地）。尾礦庫地勢北高南低，滲漏水在尾礦庫南側形成約10萬m2的水域濕地;黃河在流經包頭市小白河時形成了十幾個小型濕地。本研究分別在尾礦庫南側和小白河兩地選擇地形較規則、采樣較容易的樣地（約1萬m2）作為研究區域（圖1）。

1. 2 水體和底泥中重金屬含量分析

分別測定兩個樣地水體和底泥（0～10 cm）中的重金屬含量。利用強酸濕法消解對采集的樣品進行處理，再以電感耦合等離子體質譜（ICP-MS，德國捷達）測定重金屬含量;在重金屬元素測定過程中，使用標準品（北京鋼研納克檢測技術股份有限公司）繪制標曲和校準設備，保證回收率在（100±10）%。

1. 3 動物樣品采集和形態學指標測定

于2017年4月底當地蟾蜍冬眠結束開始活動后，在野外通過背部色斑、婚墊及是否鳴叫等雄性的第二性征辨別雌雄并記錄數量，通過實際觀察與鳴叫聲音相結合的方法對花背蟾蜍數量和種群密度進行統計。由于蟾蜍的兩棲特性，難以獲得準確的統計數據，因此蟾蜍數量準確度存在一定的局限性。5月初進入繁殖季節花背蟾蜍開始集中求偶、抱對和產卵，產卵時間一般集中在2～3 d內全部完成，之后成體潛回深水區，從此較少現身。卵帶一般產在水邊淺水區，卵帶總數量即代表成功抱對的蟾蜍數量。于花背蟾蜍產完卵的當天在野外觀察并統計其產卵量，包括卵帶總數和卵帶中的卵粒數。此后每天中午12：00定點進行觀察統計，直到完全孵化蝌蚪離去后，統計未孵化卵粒數量，計算孵化率。兩個樣地分別統計10條卵帶。產卵后一周左右進入胚后發育階段，期間共統計4次蝌蚪密度及各發育期蝌蚪比例，每次統計總數約1000只。參照趙振芳（1991）的方法將花背蟾蜍胚后發育分成5個發育期，包括I期（26～27期：胚后發育開始）、II期（30～32期：后肢5個腳趾長出）、III期（35～36期：肛管消失，前腳未出）、IV期（37～38期：前肢出現，尾巴變短）和V期（39期：變態完成，尾巴消失）。各發育期約挑取100只蝌蚪帶回實驗室，置于干凈的培養皿中，然后測量各階段蝌蚪形態學指標，包括體重、全長、體長、體寬和尾長。全長即自吻端至尾末端的長度;體長即自吻端至尾基部的長度;體寬即體兩側的最大寬度;尾長即自肛管基部至尾末端的長度。試驗結束后剩余蝌蚪放生。

1. 4 花背蟾蜍蝌蚪指標分析

蝌蚪血液樣品制備及其指標測定：取尾礦庫濕地和小白河濕地兩個樣地的蝌蚪（n>10），放入10 mL離心管中斷尾采集血樣，采用單細胞凝膠電泳技術（Single cell gel eletrophoresis，SCGE）檢測蝌蚪血細胞DNA損傷程度，并以血細胞微核率（Micronuc-leus，MN）方法測定蝌蚪血紅細胞核異常率。

蝌蚪組織樣品制備及其指標測定：采血后的蝌蚪迅速解剖，準確稱取肝胰臟組織，按照1∶99比例加入PBS，采用勻漿器迅速勻漿（冰浴），置于50 mL EP管中，4 ℃下3000 r/min離心10 min。吸取上清液，以南京建成生物工程研究所研發的試劑盒測定總抗氧化能力（T-AOC）和丙二醛（MDA）含量。

1. 5 統計分析

利用SPSS 17.0進行試驗數據統計和單因素方差分析（One-way ANOVA）。

2 結果與分析

2. 1 花背蟾蜍成體的形體特征及繁殖性能

尾礦庫濕地滲漏水常年聚集在南側，水中污染物不斷沉淀于底泥中，致使尾礦庫濕地水體和底泥中的各種重金屬污染物含量（表1）均顯著高于小白河濕地（P<0.05，下同）。在研究樣地范圍內，尾礦庫濕地的花背蟾蜍總數明顯少于小白河濕地，對應的花背蟾蜍種群密度也低于小白河濕地（表2）。小白河濕地花背蟾蜍的抱對率顯著高于尾礦庫濕地，與兩樣地花背蟾蜍的性別比例有密切關系，小白河濕地花背蟾蜍的雌雄比例為1∶0.94，而尾礦庫濕地僅為1∶0.68。在產卵量方面，尾礦庫濕地花背蟾蜍的產卵量極顯著高于小白河濕地（P<0.01，下同），小白河濕地花背蟾蜍的產卵量僅為尾礦庫濕地的83.45%;尾礦庫濕地花背蟾蜍孵化率略低于小白河濕地，但兩樣地差異不顯著（P<0.05），可能與花背蟾蜍卵帶膜對卵有極強的保護作用有關。

2. 2 蝌蚪密度及各發育期比例

隨著蝌蚪的成長（2017年5月14日—6月17日），小白河濕地和尾礦庫濕地的蝌蚪總密度均急劇下降（表3），主要是被當地鳥類取食。兩樣地均有大量鳥類生活，小白河濕地有鳥類10余種，以燕鷗為主;而尾礦庫濕地有鳥類20余種，以鷸類和鴨類為主。各采樣時間點，尾礦庫濕地的蝌蚪密度均低于小白河濕地。說明鳥類捕食和尾礦庫滲漏水污染對蝌蚪種群密度均有一定影響。

由圖2可看出，尾礦庫濕地的蝌蚪發育相對滯后于小白河濕地。2017年5月14日，尾礦庫濕地的蝌蚪只有21～23期，而小白河濕地蝌蚪已達26～27期。隨著蝌蚪的發育和變態，至6月上旬時小白河濕地發育至38～39期的蝌蚪已超過65%，而尾礦庫濕地發育至38～39期的蝌蚪僅占10%左右。說明尾礦庫周邊濕地水體污染延長了蝌蚪的胚后發育時間，對其變態發育具有抑制作用。

2. 3 蝌蚪形態學指標分析結果

由表4可看出，同期相比，尾礦庫濕地蝌蚪體重在28～37期顯著高于小白河濕地蝌蚪，全長在32～33和36～39期顯著高于小白河濕地蝌蚪，尾長在34～35期顯著高于小白河濕地蝌蚪。整體上，尾礦庫濕地蝌蚪的體格大于小白河濕地蝌蚪，可能是尾礦庫濕地植被覆蓋率高、蚊蠅較多、營養豐富的原因所致。

2. 4 蝌蚪肝胰臟理化指標測定結果

從I期至IV期，尾礦庫濕地和小白河濕地蝌蚪肝胰臟中的T-AOC呈先下降再上升的變化趨勢，于III期達最小值;I、II和III期尾礦庫濕地蝌蚪肝胰臟中的T-AOC極顯著高于小白河濕地蝌蚪，但IV和V期極顯著低于小白河濕地蝌蚪（圖3-A）。蝌蚪肝胰臟中MDA含量的變化趨勢恰好相反，于III期達最大值，且II、III和V期尾礦庫濕地蝌蚪肝胰臟中的MDA含量極顯著高于小白河濕地蝌蚪（圖3-B）。

2. 5 蝌蚪血細胞DNA損傷程度及微核率測定結果

由圖4可看出，尾礦庫濕地各發育期蝌蚪血細胞DNA損傷程度均極顯著高于小白河濕地蝌蚪。從I期至V期，小白河濕地蝌蚪血細胞DNA損傷程度整體上呈下降趨勢，而尾礦庫濕地蝌蚪呈先下降后上升再下降的變化趨勢，于IV期達最大值。

蝌蚪血紅細胞微核率測定結果（表5）顯示，兩樣地各發育期蝌蚪血紅細胞核異常率均較低。但整體上，尾礦庫濕地蝌蚪的血紅細胞核異常率高于小白河濕地蝌蚪，且在IV期達最大值（4‰），與蝌蚪血細胞DNA損傷程度相吻合，進一步證實尾礦庫滲漏水污染對蝌蚪血細胞DNA的損傷作用較嚴重，導致染色體發生斷裂，斷裂染色體不能隨有絲分裂進入正常的子細胞而形成微核游離在主核周圍，進而影響子一代的正常繁殖。可見，尾礦庫滲漏水污染已對花背蟾蜍產生遺傳損傷作用。

3 討論

尾礦庫污染物經過常年地表雨水沖刷、尾礦庫廢水滲漏和風力引起的揚塵等途徑，致使其周邊地區水體嚴重污染，底泥中重金屬元素不斷積累，進而對賴以生存的動植物產生毒性效應（鄧琴等，2017;司萬童等，2017）。本研究中，小白河濕地花背蟾蜍總數及其種群密度均高于尾礦庫濕地，其原因除了小白河濕地常年水位較穩定，周邊居民較少，人類活動對其干擾較小外，還由于小白河濕地的水環境未受污染，而尾礦庫周邊濕地的水環境污染較嚴重，對花背蟾蜍的正常生存產生持續負面影響。雖然小白河濕地花背蟾蜍的種群密度、性別比例和抱對率均高于尾礦庫濕地，但尾礦庫濕地花背蟾蜍的產卵量明顯高于小白河濕地，可能是尾礦庫濕地花背蟾蜍為減小污染對其種群的影響而增加繁殖投入，但具體原因有待進一步探究。另外，兩樣地的孵化率差異不顯著，可能與花背蟾蜍卵帶膜對卵有極強的保護作用有直接關系。整體而言，尾礦庫濕地花背蟾蜍的抱對率遠低于小白河濕地是其種群數量較少的主要原因。

與小白河濕地相比較，尾礦庫周邊濕地水體污染延長了蝌蚪的胚后發育時間，說明重金屬污染對蟾蜍蝌蚪的發育和變態具有明顯抑制作用（江彬強等，2008）。這種抑制作用與環境污染脅迫存在密切關系。本研究結果顯示，尾礦庫濕地蝌蚪肝胰臟中的T-AOC呈先下降再上升的變化趨勢，于III期達最小值;而MDA含量的變化趨勢恰好相反，于III期達最大值。隨著蝌蚪的發育和變態，尾礦庫滲漏水污染致使蝌蚪體內的氧化脅迫加重，最終導致其組織的脂質過氧化程度增加，抗氧化能力逐漸下降。蝌蚪在III期（接近變態臨界期）對環境脅迫最敏感（Si et al.，2014），III期以后蝌蚪逐漸離開水體，受其影響的時間逐漸縮短，蟾蜍幼體體內各種組織重整，免疫、呼吸、消化和神經系統也逐漸完善，對外界污染脅迫有一定適應性和免疫力，發生的脂質過氧化程度逐漸降低，總體抗氧化能力逐漸增強（李萬江，2015;司萬童等，2017）。

為進一步探究尾礦庫滲漏水污染對花背蟾蜍胚后發育影響的作用機理，本研究分析了蝌蚪血細胞DNA的損傷程度，結果發現尾礦庫濕地各發育期蝌蚪血細胞DNA損傷程度均顯著高于小白河濕地蝌蚪。由于剛孵化出蝌蚪離開了卵細胞的保護作用，暴露在污染水環境中而對其血細胞DNA造成損傷;隨著蝌蚪對污水環境的逐漸適應，其血細胞DNA損傷程度降低，但臨近變態期后蟾蜍幼體對污染水環境敏感，抵抗力降低，血細胞DNA損傷程度加重;至變態臨近完成時其各種系統逐漸完善，蟾蜍幼體上岸并逐漸脫離水污染，對環境污染的抵抗力日益增加，血細胞DNA損傷程度逐漸減輕。尾礦庫濕地蝌蚪IV期的血細胞DNA損傷程度達最大值，但肝胰臟抗氧化指標分析發現尾礦庫濕地蝌蚪在III期的影響最明顯，可能是DNA損傷具有延后性，不如生理生化指標反映迅速所致。

4 結論

尾礦庫滲漏水污染通過影響花背蟾蜍的抱對率來降低蝌蚪種群密度，而對其胚后發育的主要影響機理是導致蝌蚪的組織氧化損傷和血細胞DNA損傷。

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（責任編輯 羅 麗）