全基因組測序在食品安全預防中的利劍作用

推薦單位：國家食品安全風險評估中心

成果來源：國家食品安全風險評估中心

科研代表：王偉? ? 轉化作者：倪影

談談全基因組測序，認識它和我們健康息息相關的疾病預防、食品安全方面的關系。

2016年世界衛生組織發布的一份報告將威脅人類健康和生命的矛頭直指受到污染的食品。報告稱，全球范圍內每年有多達6億人因食用受到污染的食品而生病，全球每年有42萬人因食源性疾病死亡。

沙門氏菌是引發全球性的食源性疾病的主要致病菌之一，世界衛生組織（WHO）已經將其列為具有中等危害和嚴重危害的食物傳播性病原。蛋、家禽和肉類產品是沙門氏菌病的主要傳播媒介，受威脅最大的是小孩、老年人及免疫缺陷個體。2006～2010年間我國報告的病因明確的細菌性食源性疾病暴發事件中，70%～80%是由沙門氏菌所致。同時，其所造成的疾病負擔，經濟損失、醫療負擔和社會負擔等都不容忽視。

因此，建立快速、有效的檢測方法對沙門氏菌進行檢測，將在食品安全保障、公共衛生監測以及禽病預防和控制中發揮巨大作用。另外，沙門氏菌耐藥性的不斷增強一直以來也是備受關注的全球性問題，通過對耐藥性的監測，可以為防控沙門氏菌疫情暴發、合理使用抗生素提供科學依據。近年來，發展迅速的全基因組測序（Whole Genome Sequencing，WGS）在這方面功不可沒，尤其是在對食源性疫情暴發的檢測和監控方面起著至關重要的作用，相信全基因組測序在不久的將來在食品安全方面將發揮非常重要的作用。

何為全基因組測序？基因組攜帶著生物個體的遺傳信息，基因組測序能夠加深對生物個體分子機制的理解。所謂全，指把物種細胞里面完整的基因組序列從第1個DNA開始一直到最后一個DNA，完完整整地檢測出來，并排列好，由此能夠鑒定出基因組上任何類型的突變，包含著所有基因和生命特征之間的內在關聯性。當然，全基因組測序的實現離不開更高的測序技術支撐。

測序技術，簡單說來是將DNA中的信息轉變為計算機可處理的數字信息。基因組測序技術作為人類探索生命奧秘的重要手段之一，對生命科學和生物醫學等領域的發展起到了巨大的推動作用。

目前為止，測序技術可以分為三個階段，或三代測序技術。

第一代測序技術以1977年出現的sanger測序技術為標志。一代技術的成本高，通量低，速度慢。

第二代測序技術以roche公司的454技術，illumina公司的solexa技術和ABI公司的solid技術的誕生為標志。與一代測序技術相比，二代測序技術不僅保持了高準確度，而且降低了測序成本，提高了測序速度。二代測序的出現，使得全基因組測序進入了新的紀元。

第三代測序技術緊隨第二代測序技術出現，helicos和pacific公司推出了新的測序儀，與前2代技術相比，最大的特點是實現了單分子測序。該技術實現了對每一條DNA分子的單獨測序，被認為是第三代測序技術的開啟。

歐盟曾對傳統細菌分離鑒定和全基因組測序分析進行過成本和時間的比較：使用傳統生化和分型方法，要完成對于樣本中細菌的分離鑒定、血清分型、耐藥檢測、分子分型等一系列檢測，可能需要幾天到幾周的時間，總花費在360甚至1360歐元。而借助全基因組測序技術，從拿到菌株到得到全部信息，只需要1～2天的時間，并且其成本僅為50～100歐元。

因為對于傳統生化和分型方法而言，不同的細菌需要有其特定的試劑、操作流程和方法;同時，準備工作繁瑣、操作復雜，且細菌之間的比較僅能通過個別指標或基因位點來分析。對于全基因組測序，可允許幾個病原體同時測序，從而使實驗室操作更簡單、更快、更便宜;同時，可利用細菌全基因組的特異性基因位點進行細菌間比對分析，極大提高特異性、靈敏度和分辨率，達到株水平的鑒定。

不難看出，全基因組測序能夠將多個實驗流程整合為一;是對傳統技術的更進，也是代替;能夠更精確地提供信息;且信息量更大，性價比更高。

鑒于全基因組測序的優點，全基因組測序數據的高度特異性能夠改進病例定義，實現快速診斷;借助監視雷達，全基因組測序數據的高靈敏度可以將看似零星的散發病例相關聯;通過遺傳進化關系分析，全基因組測序對致病菌造成的食品污染、疾病爆發進行溯源分析，從而有效加強對疫情的管理。

全基因組測序的應用，是食品安全疫情監測與研究領域的重要一步。全基因組測序能夠精確鑒定引起食源性疾病的菌株，將成為預防食源性疾病爆發的利器，在疾病暴發時可以更快地采取行動，鑒定致病微生物;同時，具備單核苷酸多態性分析，有助于理解目標生物體的進化史，提供細節供傳染病學家們清楚地了解疾病的傳播途徑，揭示細菌暴發過程中發生的一系列小規模的基因突變，追蹤暴發的源頭，開展毒性特點和耐藥性分析。

2014年4月-6月，英國借助全基因組測序實現沙門菌引起食源性疾病的原因食品溯源。當時，在歐盟各國暴發了350例沙門菌感染，通過流調發現，可能與使用生產商供應的雞蛋制作的食品有關，于是英國在英格蘭5家餐館采集雞蛋、環境樣品、以及病人樣品，同時與其他國家的沙門菌爆發菌株進行全基因組測序，發現這次暴發的菌株聚集成一簇，且菌株間突變很小，最后得出結論，歐盟各國350例沙門菌患者食用同一污染沙門菌雞蛋。

在我國，全基因組測序在食品安全應用方面也有新的突破，發現了食源性碳青霉烯耐藥沙門菌。國家食品安全風險評估中心作為國家食品安全風險監測、評估、預警和標準制定機構，從2002年開始就在全國范圍內開展污染物和致病菌的風險監測和評估工作。一直以來非常關注食源性致病菌的耐藥性問題，了解我國食源性沙門菌的NDM-1的流行情況。

2014年，國家食品安全風險評估中心微生物室在對山東某大型屠宰場采集屠宰后準備發貨的整雞樣品的風險監測過程中，對141份樣品進行沙門菌分離鑒定，后期抗生素藥敏實驗發現有1株印第安納血清型的沙門菌，對測試的11類抗生素的全部21種抗生素耐藥，僅對替加環素和多粘菌素敏感，可以說達到泛耐藥的水平。隨后用美羅培南Etest條進行確認，為碳青霉烯耐藥沙門菌，同時PCR擴增發現菌株攜帶NDM-1基因，質粒傳遞性檢測發現，其能夠將質粒轉移到大腸埃希氏菌中，轉移頻率在2.2× 10-4左右。

為了更深入地研究其耐藥機制和毒力等特性，提取菌株的基因組DNA后進行了pacbio平臺三代完成圖測序。最后，對blaNDM-1耐藥基因環境于NCBI中的菌株進行了比對，發現這株雞肉來源的沙門菌NDM-1基因同其他多種耐藥基因位于一個一類整合子上，兩側被IS26的插入元件包括，整合子、插入序列同質粒一樣，都屬于可移動元件，能都介導耐藥基因在菌株間傳遞和轉移。它同臨床來源的大腸、弗氏檸檬酸桿菌和肺克具有高度同源性，提示，該基因環境可能已經在臨床環境中發生傳播。

這是我國屠宰后整雞中blaNDM-1基因陽性印第安納沙門菌首次報道。在監測工作過程中成功運用全基因組測序對食源性碳青霉烯耐藥沙門菌的耐藥機制進行了分析，發現菌株含有一個攜帶blaNDM-1基因等多重耐藥基因的大質粒，鑒于該菌株表現為泛耐藥（XDR），同時攜帶多種耐藥基因、毒力因子和重金屬抗性基因，一旦在環境、動物和消費者中傳播，造成的潛在生態和健康危害將非常嚴重。同時，研究結果對加強肉雞養殖、屠宰、運輸、銷售、消費等全食物鏈中多重耐藥沙門菌的耐藥監測，研究其傳播機制，從而預防和控制多重耐藥沙門菌，指導肉雞養殖企業合理使用抗生素具有著重要意義。