蜂蜜中α-淀粉酶活力測定方法改進

陳雪洋　田珂雪

摘要：用分光光度法測定蜂蜜可溶性淀粉溶液真空冷凍干燥后α-淀粉酶值的穩定性，并在掃描電鏡下觀察，與原可溶性淀粉顆粒進行形貌特征比較。用統計學方法對該測定方法驗證表明，真空冷凍干燥的淀粉可以對蜂蜜α-淀粉酶進行測定，結果穩定性好，為制作蜂蜜快速檢測試劑盒提供了理論基礎。

關鍵詞：蜂蜜;冷凍干燥;α-淀粉酶活力;測定方法改進

蜂蜜是我們生活中常見的天然營養佳品，含有與人體血清濃度相近的多種無機鹽、維生素及鐵、鈣、銅、錳等等多種有益人體健康的微量元素，具有滋養、潤燥、解毒、美白養顏、潤腸通便等功效，對少年兒童咳嗽有一定治療效果，還有抗菌、改善新陳代謝、增強體質、提高人體免疫力、抑制腫瘤等藥理作用。一些被利益驅使的商人通過在蜂蜜中加入葡萄糖、果糖、高果玉米糖漿等價格低廉的甜味物質來提高蜂蜜的產量。目前也有許多種鑒別蜂蜜的方法，但是都有一定缺陷。真蜂蜜具有花蜜和蜜蜂的某些特殊成分，摻假蜂蜜的這些特殊成分含量則降低。本文選擇其中的α-淀粉酶作為研究對象，測定蜂蜜中α-淀粉酶的活性，就能準確辨別蜂蜜的真假。

現有測定蜂蜜中淀粉酶活性方法的國家標準中用酶的底物是可溶性淀粉溶液，每次測定時所用的淀粉溶液都需當天配置，相對麻煩，且每次所用溶液的量不多，而配置的用不完的試劑經常倒掉造成了淀粉溶液的浪費，并污染環境。真空冷凍干燥后的物品一般情況下保存時間長，性質基本不變。鑒于此，本實驗把可溶性淀粉溶液進行冷凍干燥保存，每次使用時只需要稱取所需的量再加適量的蒸餾水溶解即可，不僅節約成本和時間，并可避免淀粉溶液的浪費。

天然蜂蜜中α-淀粉酶最適溫度40℃左右，隨溫度的上升酶活下降很快。摻假蜂蜜中添加的中溫α-淀粉酶耐高溫特性較強，最適溫度60℃。為此，本方法測定40℃及60℃的酶活性，如果60℃還有酶活性，說明蜂蜜樣品中加入了工業淀粉酶，應為摻假蜂蜜。

一、材料與方法

（一）材料

試驗原料有：槐花蜂蜜，山花蜂蜜，荊條蜂蜜。主要試劑（分析純）有：碘、碘化鉀、乙酸鈉、冰乙酸、氯化鈉、可溶性淀粉。

主要儀器有：unic7200可見分光光度計;電子萬用爐;HH-6恒溫水浴鍋;PL303電子天平;pHS-3C精密pH;Quanta 200掃描電子顯微鏡;真空冷凍干燥儀FD-1D-50。

（二）試驗方法

1、淀粉溶液的標定與配制。采用GB/T 18932.16-2003中淀粉溶液的標定方法;對蜂蜜樣品采用GB/T18932.16-2003蜂蜜中淀粉酶值的測定方法配制溶液，測定α-淀粉酶。

2、凍干淀粉的制備。將所制淀粉溶液30mL，置于-80℃的冰箱中預凍，凍好后在真空冷凍干燥機中干燥49h。干燥條件：樣品溫度20℃，冷阱溫度-60℃，真空度1Pa。測定其水分含量≤5%，符合試劑中的水分含量標準，所以對試驗結果影響不大。取出后存放在冰箱中備用。制備凍干淀粉溶液時，稱取冷凍干燥的淀粉0.1g于試管中，加入5mL蒸餾水，使其溶解完全。

3、淀粉顆粒電鏡觀察。將凍干淀粉與原可溶性淀粉樣品置于掃描電子顯微鏡下觀察，拍攝具有代表性的淀粉顆粒的形貌特征。

二、結果與分析

（一）淀粉溶液的標定與冷凍干燥

按照淀粉溶液的標定方法，在配制的淀粉溶液中逐漸加入不同量的水，用分光光度計在660 m波長下測定吸光度，確定稀釋系數。結果見表1。

由表1可知，加水23mL時吸光度在0.760±0.02之間，所以在樣品測定時稀釋系數為23mL。

淀粉溶液冷凍干燥后肉眼觀察的形貌如圖1。由圖1可以看出，淀粉冷凍干燥后體積膨脹變大，相互連在一起，不再呈現松散的顆粒狀。

（二）淀粉冷凍干燥前后的電鏡觀察

由圖2（b）可以看出，原可溶性淀粉呈現多角或不規則橢圓形，是分散開的一個個淀粉顆粒，大小不一，表面光滑，結構比較緊密，直徑大約有50μm;圖2（a）可以看出，真空冷凍干燥的糊化淀粉具有疏松膨脹的網狀結構，有些呈片狀結構，片狀結構較薄，片形不規則，大小不一，互相疊在一起。這種疏松多孔的結構狀態容易與水充分接觸，可以加快淀粉的吸水速度，提高了溶解效率，且能更好被酶解，有利于試驗的進行。

（三）淀粉冷凍干燥前后蜂蜜樣品中淀粉酶值測定結果的比較

按照α-淀粉酶的測定方法，用凍干淀粉溶液與原淀粉溶液分別測定三種蜂蜜樣品中α-淀粉酶的活性，見表2。

由表2可以看出，淀粉冷凍干燥前后測定的蜂蜜樣品中α-淀粉酶的活性無顯著差異，表明冷凍干燥的淀粉可以用于蜂蜜中α-淀粉酶的測定。

（四）真空冷凍干燥淀粉隨溫度變化的穩定性試驗

把凍干淀粉分別置于0℃、10℃、20℃、30℃和40℃環境下保存一天，測定三種蜂蜜樣品的淀粉酶活性值，結果見表4。

由表4可知，冷凍干燥過的淀粉在0℃、10℃、20℃、30℃、40℃存放下三種蜂蜜中淀粉酶值的測定結果的相對標準偏差分別為1.9%、1.7%、3.7%。說明冷凍干燥過的淀粉在不同溫度下性質比較穩定，比較容易保存。

（五）真空冷凍干燥淀粉隨時間變化的穩定性試驗

冷凍干燥過的淀粉放在冰箱中保存，分別在一周、二周、三周、四周時取出測定三種蜂蜜樣品淀粉酶值，結果如表5。

由表5可知，淀粉經冷凍干燥之后穩定性較好，隨時間的變化，三種蜂蜜樣品淀粉酶值的測定結果的相對標準偏差分別為1.1%、2.0%、3.1%。基本上不影響蜂蜜α-淀粉酶的測定，可以長期保存、使用。

三、結論

把可溶性淀粉溶液用真空冷凍干燥法干燥后，性質穩定，隨溫度和時間的變化，對蜂蜜中α-淀粉酶值的測定結果無顯著影響。對凍干淀粉進行鏡檢，發現淀粉的形貌發生了很大變化，糊化的淀粉吸水溶脹而相互交聯成片狀結構，更容易溶于水，且能更好地被酶作用，提高反應效率。本試驗將淀粉冷凍干燥后，使用時直接定量稱取，試驗更加方便、快捷，簡化了國標測定蜂蜜中α-淀粉酶值的方法。同時，試驗結果的穩定性良好，可以滿足對樣品的檢測，為進一步制作蜂蜜快速檢測試劑盒提供依據。

（責任編輯 曹雯梅）