刺山柑體外抗腫瘤活性提取物的篩選研究

買地哪木·色迪克，周彥霞，周曉濤，王 梅（.新疆醫科大學藥學院，新疆 烏魯木齊 800；新疆醫科大學研究生院，新疆 烏魯木齊 800；新疆醫科大學基礎醫學院，新疆 烏魯木齊 800）

刺山柑（capparis spinosa L.）為山柑科山柑屬藤本植物，又名老鼠瓜、野西瓜，是一種中草藥[1]。主要分布于中東地區和地中海國家，在我國主要分布于新疆、甘肅、西藏等地區[2]。刺山柑是干旱區特有植物，抗旱、耐高溫、耐風蝕、耐貧瘠，是研究植物抗逆性不可多得的材料[3]。刺山柑含有揮發油、生物堿類、類黃酮類、萜類以及芥子油甙等化學成分[4]，其葉、果、根皮均可入藥，味辛苦，性溫，具有祛風、除濕、通鼻竅、祛瘀止痛活血之功效，在新疆作為一種民族醫藥而被廣泛應用[5]。現代藥理研究表明刺山柑果實提取物在抗菌、抗炎、抗氧化、抗高血壓[6]、抗腫瘤、降血糖、調血酯、利尿、治療痛風和風濕[7-8]等方面均有一定的功效。有多名國外學者報道了刺山柑對肺癌、卵巢癌、腸癌、乳腺癌和鼻咽癌均有作用[9-12]。本研究以多種腫瘤細胞為細胞模型，探討刺山柑的抗腫瘤活性。

1 材料與方法

1.1 藥品

刺山柑果藥材（購自安徽省金芙蓉中藥飲片有限公司，批號：170401，經新疆醫科大學藥學院天藥/生藥教研室鑒定）；甲醇、乙醇、鹽酸等試劑均為分析純；水為重蒸水；人非小細胞肺癌細胞A549、人乳腺癌細胞MCF-7、人卵巢癌細胞SK-OV-3、人前列腺癌細胞PC-3、人肝癌細胞Hep-G2、人結腸癌細胞HT-29，均購自于中國科學院細胞庫；高糖DMEM培養基（規格：500 mL，批號：AD19446264，HyClone公司）；FBS（規格：100 mL，批號：M048-6，美國Sciencell公司）；CCK-8（規格：1 g，批號：M2128，美國Sigma公司）；順鉑（cisplatin，DDP，規格：25 mg，批號：SJJMI-IE，東京化成工業株式會社）。

1.2 儀器與設備

DC-NSG型實驗型提取濃縮機組（上海達成實驗設備有限公司）；R-2003型旋轉蒸發儀（鞏義市予華儀器有限責任公司）；HWS24型電子恒溫水浴鍋（上海-恒科學儀器有限公司）；SHZ-95B 型循環水式多用真空泵（鞏義市予華儀器有限責任公司）；DZF-6051 型真空干燥箱（上海齊欣科學儀器有限公司）；BSA124S型電子天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]；3111 型CO2培養箱（美國Thermo 公司）；DMIL 型倒置顯微鏡（德國Leica公司）；CJ-1F型醫用凈化工作臺（蘇州馮氏實驗動物設備有限公司）；MR-96A型酶標儀（深圳邁瑞公司）。

1.3 方法

1.3.1 提取 取刺山柑干燥果實5 kg，粉碎成粗粉，裝袋，加入8 倍量85%乙醇回流提取2 次，每次2 h，合并提取液，減壓濃縮（50 ℃），減壓干燥（50 ℃）成乙醇總提取物。取乙醇總提取物800 g，用1 L水溶解后，分別用等體積的石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取3次，所得萃取液合并后，減壓濃縮并干燥，得石油醚提取物、氯仿提取物和乙酸乙酯提取物。剩余的水溶液部分減壓濃縮后干燥得水溶性提取物。

1.3.2 細胞株及培養條件 人非小細胞肺癌細胞A549、人乳腺癌細胞MCF-7、人卵巢癌細胞SKOV-3、人前列腺癌細胞PC-3、人肝癌細胞Hep-G2、人結腸癌細胞HT-29，均購自于中國科學院細胞庫，把DMEM通用培養液配制成含有10%胎牛血清，1%抗生素（100 U·mL-1青霉素和100 μg·mL-1鏈霉素）的完全培養液，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養上述六種細胞，根據細胞生長情況，平均每隔1 ～ 2天更換1次細胞培養液，當細胞密度達到90%時，用含有0.25%的胰蛋白酶消化細胞進行傳代，至對數生長期備用。

1.3.3 體外抗腫瘤活性測定 取對數期生長的A549、MCF-7、SK-OV-3、PC-3、Hep-G2、HT-29細胞以每孔5×103個細胞接種于96 孔細胞培養板中，待12 h 細胞貼壁后，設置正常對照組、陽性對照藥（DDP）組、樣品組（5000、1500、500、150、50、15 μg·mL-1），每組5個復孔。正常對照組以完全培養液孵育細胞，樣品組分別以含終濃度為5000、1500、500、150、50、15 μg·mL-1樣品的完全培養液孵育細胞，DDP 組分別以含終濃度為100、30、10、3、1、0.3 μmol·L-1樣品的完全培養液孵育細胞。按上述處理方式孵育細胞72 h 后在每孔中加入CCK-8 試劑20 μL，繼續培養4 h 后在490 nm 處測量各孔的吸光度（OD 值）。以正常對照組OD值為100%細胞活力，其余各組OD值與正常對照組OD值的比值為相對活力。以相對活力評價樣品對A549、MCF-7、SK-OV-3、PC-3、Hep-G2、HT-29細胞的毒性。按下列公式計算生長抑制率，采用SPSS 16.0 統計軟件對數據進行處理，采用Bliss 法計算IC50。生長抑制率=（1-用藥組OD值/對照組OD值）×100%。

2 結果與分析

刺山柑乙醇總提取物經石油醚、氯仿、乙酸乙酯等溶劑萃取，分別得到56.39 g石油醚提取物、141.58 g氯仿提取物和100.76 g乙酸乙酯提取物。細胞毒性檢測結果表明，刺山柑五個提取物對六種人腫瘤細胞具有不同程度的抑制作用，由表1 可知，不同濃度的刺山柑提取物對六種人腫瘤細胞的生長抑制率均隨含藥量的升高而升高，即呈現出明顯的劑量依賴性。由表2 可知，刺山柑各有效提取物對六種人腫瘤細胞的體外半數抑制濃度IC50值在350.503 ～ 1 470.614 μg·mL-1，其中石油醚提取物對人卵巢癌細胞SK-OV-3的IC50值最小，即為350.503 μg·mL-1，其對應的抑制率為95.801%。實驗結果表明，石油醚提取物對人卵巢癌細胞SK-OV-3的IC50值最小，即抑制效果最佳。

3 討論

刺山柑作為常見的藥用植物之一，具有抗炎鎮痛、抑菌、抗氧化、降血糖、抗肝毒、抗腫瘤等多種藥理作用[13]。研究表明，刺山柑果實中油酸的含量達到42.93%，油酸可降低血液總膽固醇和有害膽固醇，減少其在血管上的沉積，有預防動脈硬化等作用，卻不降低有益膽固醇，對心血管疾病和癌癥等都有預防作用[14]。

表1 刺山柑各有效提取物對六種人腫瘤細胞的生長抑制率的影響Tab 1 Growth inhibition rate of six human tumor cells by different effective parts of capparis spinosa L.

表2 刺山柑各有效提取物對六種人腫瘤細胞的IC50值. μg·mL-1Tab 2 IC50 values of various active parts of capparis spinosa L. on six human tumor cells. μg·mL-1

目前，對刺山柑抗腫瘤活性的研究較少，近幾年有關刺山柑的研究主要集中在藥理作用和化學成分的研究，關于刺山柑抗腫瘤活性的藥效學研究并不明確。在本研究中，采用抗腫瘤藥物篩選常用的CCK-8法，以DDP 為陽性對照，基于常見的人非小細胞肺癌細胞A549、人乳腺癌細胞MCF-7、人卵巢癌細胞SK-OV-3、人前列腺癌細胞PC-3、人肝癌細胞Hep-G2和人結腸癌細胞HT-29這六種人腫瘤細胞，考察刺山柑石油醚提取物、氯仿提取物、乙酸乙酯提取物、水提物和醇提物的抗腫瘤活性，結果發現刺山柑的五個有效提取物對六種人腫瘤細胞均有生長抑制作用。其中以石油醚提取物對人卵巢癌細胞SK-OV-3 抑制作用最強，其對應的IC50值和最大抑制率分別為350.503 μg·mL-1和95.801%。本研究評價了刺山柑不同提取物對不同腫瘤細胞的活性，成功篩選出了活性最強的提取物，為今后刺山柑抗腫瘤活性研究提供了理論參考。然而，有關刺山柑抗腫瘤的藥效成分物質基礎、抗癌機理等方面仍有待進一步的研究。