海產品中4種副溶血性弧菌檢驗方法的研究

楊平　黃靜敏　陳晶　劉小青　蘭全學

摘要 分別采用國家標準MPN法、紙片法改良MPN法（R-MPN）和疏水網格濾膜法（HGMF）對50個海水及牡蠣樣品進行檢測。結果表明，R-MPN法和HGMF法的檢出量比另外2種方法高，差異顯著（P<0.05）。紙片法的特異性最高，其次是HGMF法，R-MPN法和MPN法的特異性相對較低：本文通過比較4種副溶血性弧菌檢驗方法的檢出量和特異性，以期為今后的檢測方法改進提供參考。

關鍵詞 副溶血性弧菌;MPN法;紙片法;改良MPN法;疏水網格濾膜法（HGMF）

中圖分類號 TS201.3

文獻標識碼 A

文章編號 1007-5739（2019）08-0238-02

副溶血性弧菌是一種革蘭氏陰性嗜鹽菌，常見的食源性致病菌"。尤其在沿海地區，自1998年來副溶血性弧菌引起細菌性食物中毒危害已取代沙門氏菌12。由于副溶血性弧菌廣泛存在于海水以及魚、蝦、蟹、貝類和海藻等海產品中，近年來隨著保鮮和物流業的迅速發展，海產品得以運輸到內陸銷售，而副溶血性弧菌污染地區范圍正隨著海產品消費范圍的擴大而擴大B。副溶血性弧菌對環境條件很敏感，海產品從沿海運輸到內陸一般都是采取冷凍保鮮等方式，在此過程中副溶血性弧菌易發生亞致死損傷4。但只要環境適宜，損傷的副溶血性弧菌會發生復蘇，這對水產品的食品安全造成了潛在的危害。人們在食用被副溶血性弧菌污染的水產品后，極易引起急性腸胃炎。少數嚴重病人會產生休克、昏迷而死亡。污染范圍及保藏運輸條件等變化無疑對海產品的質量安全監控形成新的挑戰。檢測手段也應對新變化做出適當調整，結合檢驗方法的特點綜合運用。

目前，我國建立的副溶血性弧菌國家標準定量檢測方法為GB4789.7-2013。MPN法是最常用的細菌定量檢測方法，但其得出的結果是樣本中活菌數量的最大或然數，屬于間接的半定量分析方法，而且操作過程繁瑣。美國FDA采用的是HGMF法，通過疏水網格濾膜過濾截留樣品中的細菌，再進行選擇性培養，得到的結果以CFU/g（mL）為單位，是一種直接定量法。自20世紀70年代發展至今，HGMF已成功應用于各種食源性致病菌的檢測中15-7。此外，本實驗室已建立了疏水濾膜快速定量方法8以及Ray等建立的改進MPN法（R-MPN），但不同檢測方法利用菌的某個特性對細菌進行檢測，都有其優缺點，沒有一種方法能確保100%準確，只能綜合考慮樣品性質等情況，選擇某種方法或聯合使用。因此，本文通過對4種副溶血性弧菌定量方法進行探討研究，綜合考慮方法的優缺點，以期為更好地控制副溶血性弧菌引發的食源性疾病提供參考依據。

1試驗材料

1.1樣品采集

50個海水以及新鮮或冰凍的牡蠣采集于深圳市的海鮮市場、農批市場、超市等。采集300mL海水樣品置于500mL無菌廣口瓶中，牡蠣樣品采集后立即置于4C冰箱保存，24～48h內完成測試（通常24h內）;冷凍樣品置于-18C冰箱保存。

1.2培養基和試劑

培養基和試劑包括蛋白胨/吐溫80（PT）、蛋白胨/吐溫80/3%NaCl（PTS）、副溶血性弧菌顯色培養基（VPCM，法國科瑪嘉）、大豆酪蛋白瓊脂（TSA）、3%NaCl大豆酪蛋白瓊脂、胰化大豆硫酸鎂瓊脂（TSAM）、3%NaCl胰化大豆硫酸鎂瓊脂（TSAMS）、ISO-GRID疏水網格濾膜（NEOGEN）、副溶血性弧菌鑒定紙片。

2試驗方法

2.14種檢驗方法

2.1.1國家標準MPN法。根據《食品微生物學檢驗副溶血性弧菌檢驗》（GB4789.7-2013）要求進行。

2.1.2改良MPN法（R-MPN法）。R-MPN法是Ray等在原有MPN法的基礎上增加一步預富集過程，即先經過胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）預富集2h后，接著在3%NaClTSB培養過夜，有利于副容血性弧菌受損細胞的修復，再通過陰離子葡萄糖鹽肉湯（GST）36C培養過夜，鑒定。

2.1.3紙片法。把樣品稀釋液接種副溶血性弧菌鑒定紙片，于42C條件下培養24h，按照產品說明書計算陽性菌落數。

2.1.4疏水網格濾膜法（HGMF法）。通過疏水網格濾膜過濾截留樣品中的細菌，然后把濾膜放置在TSAMS培養基上36C修復4～5h后，轉到副溶血性弧菌顯色培養基上36C選擇性培養過夜，計數。

2.2副溶血性弧菌檢測

海水樣品：海水樣品采用上述4種方法來進行檢測，MPN法和R-MPN法選擇10.0、1.00.1mL3個稀釋度;紙片法均吸取1mL樣品;HGMF法選擇100.0、10.0、1.0mL3個稀釋度。

牡蠣樣品：稱取25g樣品加入225mL3%氯化鈉堿性蛋白胨水內，均質器拍打混勻制成1：10均質液，采取，上述4種方法對均質液進行定量檢測。MPN法R-MPN法選擇10.0、1.0、0.1mL3個稀釋度;HGMF法選擇1.000.10、0.01mL3個稀釋度;紙片法均吸取1mL樣品。

所有試驗樣品均做3個平行，檢測結果以幾何平均值表示。

2.3菌株鑒定

分別從4種方法的培養物中根據菌落形態挑取50個可疑菌落劃線純化，純培養的單菌落進行氧化酶試驗、3%NaCl三糖鐵瓊脂試驗和嗜鹽性試驗。采用VITEK2Compact全自動細菌鑒定系統對菌株進行確證鑒定。

2.4統計分析

采用SPSS19.0對數據進行統計分析。

3結果與分析

海水樣品和牡蠣樣品中副溶血性弧菌的定量檢測情況如表1所示。通過對比4種檢驗方法，可以看出，4種檢驗方法中，R-MPN法和HGMF法對于海水樣品和牡蠣樣品的檢出量較高，而且2種方法之間差異無統計學意義（P>0.05）。HGMF法對于海水樣品和牡蠣樣品的檢出量最高，其次是R-MPN法，MPN法和紙片法檢測量相對較低。從海水樣品的檢測結果來看，4種檢測方法的檢出量之間沒有統計學差異（P>0.05）。而對于牡蠣樣品，R-MPN法和HGMF法的檢出量之間沒有統計學差異，但這2種方法的檢出量都明顯高于紙片法和MPN法（P<0.05）。牡蠣樣品中副溶血性弧菌的檢出量基本比海水樣品的數量高出2個數量級。

分別從4種方法中隨機挑取50個副溶血性弧菌可疑菌落，采用VITEK2Compact全自動細菌鑒定系統對菌株進行鑒定來檢驗這幾種方法的特異性。可疑菌落的挑取主要根據菌落的形態特征，沒有采用其他生化手段作為輔助。紙片法的陽性率為98%，HGMF法的陽性率為85%，而采用R-MPN法和MPN法的陽性率分別為60%和66%，采用紙片法和HGMF法的特異性明顯高于R-MPN法和MPN法（P<0.05）。

4結論與討論

比較4種副溶血性弧菌檢驗方法的檢出量，R-MPN法和HGMF法中副溶血性弧菌的檢出量較另外2種方法高，可能因為這2種方法都對副溶血性弧菌受損細胞有一個修復的步驟，R-MPN法和HGMF法首先通過在沒有選擇性的培養基中培養一段時間再進行選擇性培養，能有效修復冷藏或冷凍過程中被損傷的副溶血性弧菌細胞。Ray等研究經過冷藏或冷凍處理的副溶血性弧菌受損細胞的修復，發現在TSB培養2h后，接著在3%NaClTSB培養過夜，是一個非常有效的MPN計數法前修復處理方法。通過前期試驗結果也發現在TSAMS上培養4～5h后，能有效修復副溶血性弧菌受損細胞。此外，不同取樣量也會影響結果的檢測量。如海水樣品，HGMF法1次共檢測11.0mL樣品，而MPN法1次只檢測33.33mL樣品量。對于牡蠣樣品，因為1：10均質液容易堵塞濾膜，所以HGMF法的樣品總分析量降為0.11g。此外，復雜的數學換算也會對檢出量有一定影響。R-MPN法和MPN法得出的結果是活菌數量，得到的值單位為MPN/g（mL），可通過公式換算成CFU/g，但跟實際菌含量有一定差別。

從4種副溶血性弧菌檢驗方法的特異性結果來看，紙片法和HGMF法檢測副溶血性弧菌的特異性比MPN法及R-MPN法好。紙片法是在42C條件下培養的，研究表明，提高檢測溫度能有效抑制其他微生物的生長。然而，紙片法的特異性雖然高，但是該方法的檢出量卻很低，容易出現漏檢的情況，尤其對于在運輸等過程中產生損傷或致死的細胞。HGMF法的特異性比紙片法稍低，但檢出量高，對損傷細胞也有很好的修復步驟，不容易出現漏檢的情況。R-MPN法和MPN法的方法特異性相當。

除了考慮方法的檢出量和特異性外，方法的效率性也非常重要。紙片法無需配制培養基，而且操作簡單，可減少生化鑒定步驟，快速簡便。HGMF法可以同時過濾多個樣品，同時可以縮短富集培養的時間。R-MPN法和MPN法用于微生物計數時包括富集、分離和鑒定等所有步驟，不論是用3管6管還是9管MPN法，每個稀釋管都要經過以上各個步驟，需要大量的培養基和培養步驟，操作過程略為繁瑣，其得出的試驗結果是樣本中目的菌活菌數量的統計學估計值。

綜合考慮4種方法的優缺點，應根據樣品和檢測要求等，結合方法的特點綜合運用。如在突發公共衛生事件中，紙片法快速簡便，更具優勢。MPN法雖然繁瑣，但該方法是目前國家標準檢定副溶血性弧菌的定量方法，檢測結果得到國家檢定結構和企業等的認可。相比于MPN法，HGMF法處理大量樣品，使受損細胞得以生長并被檢出，檢出量高，特異性好，可為今后改進國家標準法提高檢驗效率提供一定參考。

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