緩釋型茶樹精油-殼聚糖微膠囊的制備、表征及體外釋放規(guī)律

龍 門，馮 超，李永佳，汪旭海，蔡華珍，詹 歌*

（滁州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，滁州市食品加工研究院，安徽省熱敏性物料加工工程技術(shù)中心，安徽 滁州 239000）

茶樹精油（Melaleuca alternifolia）來源于白千層屬灌木的葉子，桃金娘科，主要含有由單萜、倍半萜烯及其含氧化合物組成的萜類化合物[1]，具有抗菌、抗炎、抗癌、驅(qū)蟲和殺蟲等功效[2-3]。由于茶樹精油具有廣譜抑菌性、抗氧化性及獨特的風(fēng)味，已經(jīng)作為天然保鮮劑廣泛應(yīng)用到食品保鮮技術(shù)領(lǐng)域[4-5]。研究表明，茶樹精油對提高采后果蔬的貯藏保鮮期有積極的作用，尤其是可以顯著提高草莓的保鮮期[6-7]；研究表明[8]，茶樹精油對金黃色葡萄球菌有明顯的殺滅作用。但與其他精油相似的是，茶樹精油易受氧氣、光、熱和濕氣的影響，在貯存及使用過程中要防止外界環(huán)境造成的品質(zhì)變化；另外，由于茶樹精油表面張力較小，水溶性極差，極大地限制了其應(yīng)用范圍[9-10]。因此，適當(dāng)?shù)奶幚硪蕴岣卟铇渚偷姆€(wěn)定性及水溶性，對茶樹精油的應(yīng)用有極大的推動作用。

微囊化技術(shù)不但可以通過包埋法固定活性物質(zhì)以提高其穩(wěn)定性，還可以通過包埋技術(shù)調(diào)控活性物質(zhì)的釋放速率，以增加活性物質(zhì)的應(yīng)用可能性[11-12]。目前常用的微膠囊制備方法主要有乳化交聯(lián)法、離子凝膠法、共價交聯(lián)法、沉淀析出法等。O’Brien等[13]通過功能性油脂微膠囊的加工，極大地促進(jìn)了其應(yīng)用可行性及穩(wěn)定性；Shrestha等[14]通過β-環(huán)糊精優(yōu)化了精油的包埋工藝，并通過X射線衍射及差示掃描量熱法表征了包埋物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和釋放速率。Burgain等[15]通過微膠囊包埋技術(shù)成功開發(fā)了益生菌的包埋技術(shù)，并且應(yīng)用至工業(yè)化生產(chǎn)當(dāng)中。盡管活性物質(zhì)微囊化技術(shù)因其諸多優(yōu)點已經(jīng)在醫(yī)藥、食品包裝、生物技術(shù)、環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，但是該技術(shù)并不能實現(xiàn)對活性物質(zhì)的全部包埋，即在微囊化過程中會導(dǎo)致部分活性物質(zhì)的損失[16-17]。因此，針對不同活性成分制定合適的微囊化工藝是該技術(shù)使用的前提。

目前，國內(nèi)外對于茶樹精油微囊化工藝的研究相對較少，并且針對殼聚糖（chitosan，CS）微囊化茶樹精油工藝及其結(jié)構(gòu)表征的研究也鮮見報道。因此，本研究以茶樹精油為功能性成分，通過采用離子凝膠法制備茶樹精油-CS微膠囊，研究茶樹精油微膠囊的結(jié)構(gòu)和功能特性，并通過構(gòu)建4 種不同的食品模擬體系，建立茶樹精油微膠囊在不同食品模擬體系中的釋放模型，以期為茶樹精油在食品非熱殺菌的應(yīng)用中提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶樹精油（純度99.99%；主要成分為孟乙烯、松油精、檸檬油精、桉油酚、香油腦、茴香素等） Sigma試劑中國有限公司；金黃色葡萄球菌CMCC（B）26003、大腸桿菌ATCC25922 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、結(jié)晶紫中心膽鹽培養(yǎng)基、甘露醇高鹽瓊脂 青島海博生物科技有限公司；CS、三聚磷酸鈉（sodium tripolyphosphate，TPP）、氫氧化鈉、吐溫-80、乙醇、丙三醇、正己烷、氯化鈉等生化試劑國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HJ-6型磁力攪拌器 常州申光儀器有限公司；HHS型電熱恒溫水浴鍋 上海博訊實業(yè)有限公司；C30型玻璃儀器氣流烘干器 上海凌科實業(yè)發(fā)展有限公司；JK-500DVE型雙頻數(shù)控超聲波清洗器 合肥金尼克機(jī)械制造有限公司；FA2204B電子天平 上海越平科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-1D單人單面垂直凈化工作臺 中國蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司；R-134A型恒溫振蕩搖床美國熱電公司；JL-1166型激光粒度分布測試儀 成都精新粉體測試設(shè)備有限公司；TXQ-LS-50G立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博訊實業(yè)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 茶樹精油微膠囊的制備[18-19]

1）配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的乙酸溶液，放置備用。稱取0.1 g CS粉末，加入98 mL蒸餾水及質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的乙酸溶液2 mL，置于磁力攪拌器上攪拌6 h后得澄清溶液，用0.45 μm微孔濾膜過濾，即為1.0 mg/mL的CS-乙酸溶液。2）用1 mol/L NaOH溶液將CS溶液pH值調(diào)至4.5后，于25 ℃、100 W條件下超聲處理10 min，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的吐溫-80，60 ℃恒溫加熱攪拌30 min，得到均一穩(wěn)定的溶液。3）向上述溶液中逐滴加入所需的精油溶液，在磁力攪拌器上25 ℃攪拌10 min后，以2 滴/s的速率逐滴添加所需的1.5 mg/mLTPP溶液，攪拌20 min，得到白色乳狀液，即茶樹精油微膠囊懸液。4）所得茶樹精油微膠囊懸液低溫超速離心（4 ℃，15 000 r/min，30 min）后，下層沉淀用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9%的生理鹽水懸浮，以3%甘露醇為凍干保護(hù)劑于－20 ℃冷凍干燥后保存。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精確稱取茶樹精油0.01 g，用CH2Cl2定容至10 mL容量瓶中，配制成1 mg/mL的精油儲備液。分別稱取100、200、400、600、800、1 000 μL儲備液，用CH2Cl2定容至10 mL容量瓶中，得到標(biāo)準(zhǔn)溶液。用CH2Cl2作空白對照，將溶液在264 nm波長下測定溶液吸光度。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y＝3.008X＋0.019 2，R2＝0.990 7。其中Y為吸光度，X為精油質(zhì)量濃度。

1.3.3 茶樹精油微膠囊包埋率的測定[20]

取1 mg茶樹精油-CS微膠囊于10 mL離心管中，加入5 mL 2 mol/L HCl溶液，25 ℃浸泡30 min后，加入1 mL CH2Cl2混合均勻，用高速離心機(jī)25 ℃、9 000 r/min離心5 min。測定離心后的上清液在264 nm波長處的吸光度，并通過茶樹精油標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到茶樹精油的含量。用等體積空白納米粒懸液作為空白樣以同樣的方法測定。包埋率根據(jù)式（1）計算：

式中：M總為體系中茶樹精油的總質(zhì)量/mg；M游為體系中游離的茶樹精油的質(zhì)量/mg。

1.3.4 制備條件對茶樹精油微膠囊的影響

1.3.4.1 茶樹精油添加量

根據(jù)1.3.1節(jié)茶樹精油微膠囊的制備方法，取CS質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的溶液100 mL，分別添加茶樹精油3、6、9、12、15、18、21 mg/mL ，按照CS與TPP質(zhì)量比為5∶1，添加質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL的TPP溶液20 mL，制備茶樹精油微膠囊，研究茶樹精油添加量對茶樹精油微膠囊粒徑和包埋率的影響。

1.3.4.2 CS與TPP質(zhì)量比

根據(jù)1.3.1節(jié)茶樹精油微膠囊的制備方法，取CS質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的溶液100 mL，分別添加茶樹精油9 mg/mL，按照CS與TPP質(zhì)量比為3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1，添加質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL的TPP溶液，制備茶樹精油微膠囊，研究CS與TPP質(zhì)量比對茶樹精油微膠囊粒徑和包埋率的影響。

1.3.5 響應(yīng)面試驗

在上述試驗的研究基礎(chǔ)上，分別以CS與TPP質(zhì)量比、茶樹精油添加量為試驗因素，通過Design-Expert中心組合響應(yīng)面試驗設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素與水平Table 1 Code and level of independent variable used for central composite design

1.3.6 茶樹精油微膠囊結(jié)構(gòu)表征

1.3.6.1 形貌分析[21]

采用掃描電鏡分析，在樣品臺上貼一層導(dǎo)電膠，將茶樹精油微膠囊粉末粘在導(dǎo)電膠上，經(jīng)噴金處理后用掃描電子顯微鏡觀測其外部形貌，加速電壓5 kV，從得到的茶樹精油微膠囊的電鏡掃描圖片中找出較清晰的兩張用于實驗結(jié)果分析。

1.3.6.2 粒徑分布[22]

采用JL-1166型激光粒度儀分析制備的微膠囊懸浮液粒徑大小及粒徑分布。得到加入的微膠囊懸浮液體積累積分布、頻度分布和粒徑的正態(tài)分布曲線，直觀表達(dá)離子凝膠法制備的緩釋型精油微膠囊的粒徑的大小和分布區(qū)間。

1.3.7 茶樹精油微膠囊功能性分析

1.3.7.1 體外殺菌性能

制備質(zhì)量濃度為1 mg/mL的茶樹精油與含等量茶樹精油的CS微膠囊溶液儲備液，避光20 ℃保存。取冷凍保藏的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌分別接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，置于37 ℃的恒溫振蕩搖床中培養(yǎng)24 h，然后于7 000 r/min、4 ℃離心7 min，取沉淀用生理鹽水重懸并稀釋至菌液濃度為108CFU/mL左右，備用。取1 mL茶樹精油以及含等量茶樹精油的微膠囊與0.1 mL菌懸液一起加入到9 mL生理鹽水中，在殺菌10 h后，于37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取樣品勻液100 μL涂布于平板中，大腸桿菌涂布于結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂培養(yǎng)基瓊脂平板上，金黃色葡萄球菌涂布于甘露醇高鹽瓊脂平板上。每個稀釋度涂3 個平板。每隔3 d取儲備液按以上步驟再次測定茶樹精油和茶樹精油微膠囊對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的殺滅作用。

1.3.7.2 體外抗氧化性能

參照Esmaeili等[23]的方法，略改動。制備質(zhì)量濃度為1 mg/mL的茶樹精油與含等量茶樹精油的CS微膠囊溶液儲備液，避光20 ℃保存。取9 mL茶樹精油溶液與含等量茶樹精油的CS微膠囊溶液各自加入3 mL濃度為4 mol/L的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）-甲醇溶液得到混合液。將混合液放入暗室反應(yīng)10 min，用紫外-可見分光光度計分別測定517 nm波長處混合液的吸光度。記錄反應(yīng)10 min時的DPPH自由基清除率為0 d，每隔3 d取儲備液按以上步驟再次測定樣品反應(yīng)10 min的DPPH自由基清除率，根據(jù)公式（2）計算：

式中：A0為空白DPPH在517 nm波長處的吸光度；A517nm為樣品溶液在517 nm波長處的吸光度。

1.3.8 茶樹精油微膠囊體外釋放性能分析

稱取0.5 g新制的茶樹精油微膠囊粉末置于含有食品模擬液的錐形瓶中，分別分析在不同食品模擬體系中的釋放性能，具體食品模擬體系如下[24]：T1：高水分活度食品模擬體系，取105 mL 95%乙醇溶液加去離子水至1 000 mL配成10%乙醇溶液；T2：高醇溶液食品模擬體系，取526 mL 95%乙醇溶液，添加去離子水定容至1 000 mL；T3：水分活度為0.6～0.7的食品模擬體系，取600 mL甘油加去離子水至1 000 mL配成60%甘油溶液；T4：脂肪類食品模擬體系：取正己烷1 000 mL。

采用紫外分光光度計測定上清液中茶樹精油含量的吸光度，對照茶樹精油-CH2Cl2標(biāo)準(zhǔn)曲線，可得到微膠囊中茶樹精油的含量變化情況，計算得到茶樹精油微膠囊在不同食品模擬液中每隔6 min的相對累積釋放率。計算如式（3）所示：

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

所有數(shù)據(jù)利用Microsoft Excel 2010進(jìn)行統(tǒng)計處理，用SAS 9.2進(jìn)行ANOVA分析，不同平均值之間利用LSD（Least-Significant Difference）法進(jìn)行差異顯著性檢驗（n=3）。

2 結(jié)果與分析

2.1 制備條件對茶樹精油微膠囊粒徑和包埋率的影響

TPP作為交聯(lián)劑，可以與CS分子鏈上的氨基產(chǎn)生正負(fù)電荷吸附作用，形成分子間、分子內(nèi)的交聯(lián)，逐步誘導(dǎo)CS形成小分子顆粒[25-26]。從圖1可以看出，隨著CS與TPP質(zhì)量比的增加，即體系中TPP含量逐漸降低，茶樹精油的包埋率先緩慢增加，然后顯著降低（P＜0.05）；對應(yīng)的微膠囊粒徑呈先降低后增加的趨勢。

圖1 CS與TPP質(zhì)量比對茶樹精油微膠囊粒徑和包埋率的影響Fig. 1 Effects of CS/TPP ratio on particle size and encapsulation efficiency of TTO microcapsules

從圖2可以看出，隨著茶樹精油添加量的增加，茶樹精油的包埋率呈顯著先增加后降低的趨勢（P＜0.05）；而對應(yīng)的微膠囊的粒徑則相反，呈先降低后增加的趨勢。因此可以看出，適量的茶樹精油對提高微膠囊包埋率以及降低微膠囊粒徑有明顯促進(jìn)作用。

圖2 茶樹精油添加量對茶樹精油微膠囊粒徑和包埋率的影響Fig. 2 Effects of TTO concentration on particle size and encapsulation efficiency of TTO microcapsules

2.2 茶樹精油微膠囊制備工藝優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果

由表2可以看出，不同處理組中茶樹精油添加量和CS與TPP質(zhì)量比對茶樹精油微膠囊的粒徑（Y1）和精油包埋率（Y2）均有明顯的影響。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Central composite design with experimental results for response surface analysis

2.2.2 回歸模型建立及交互作用結(jié)果

利用Design-Expert 8.0.6軟件對表2中響應(yīng)面試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項式回歸分析，建立茶樹精油微膠囊包埋率及粒徑對試驗中涉及的2 個因素變量的二次多項式的回歸方程：

對構(gòu)建的二次回歸模型系數(shù)顯著性進(jìn)行檢驗可以看出（表3），兩個模型均顯著（P＜0.05），失擬項不顯著（P＞0.05）。

上述二次回歸方程中的涉及的兩個因素變量對包埋率及粒徑的交互作用影響結(jié)果見圖3。從等高線的曲直可以發(fā)現(xiàn)，兩個因素對包埋率及粒徑均無明顯的交互作用。

表3 回歸模型系數(shù)顯著性檢驗Table 3 Regression coefficients and significance test

圖3 CS與TPP質(zhì)量比和精油添加量交互作用結(jié)果Fig. 3 Response surface plots showing the effect of interaction between TTO concentration and CS/TPP ratio on particle size and encapsulation efficiency

2.2.3 茶樹精油微膠囊制備工藝驗證

綜合上述試驗結(jié)果，以茶樹精油微膠囊的包埋率最大值及粒徑最小值為目標(biāo)值，對構(gòu)建的二次回歸方程進(jìn)行優(yōu)化后得到，當(dāng)CS與TPP質(zhì)量比5.27∶1、精油添加量11.28 mg/mL時，茶樹精油微膠囊存在最小的粒徑為0.77 μm，以及最大的包埋率為52.00%。調(diào)整CS與TPP質(zhì)量比5.30∶1、精油添加量11.30 mg/mL進(jìn)行驗證實驗，得到茶樹精油微膠囊的粒徑為（0.74±0.03）μm，包埋率為（53.15±0.32）%，與理論值相對誤差小于5%。說明該工藝準(zhǔn)確可靠，可以用于茶樹精油微膠囊的生產(chǎn)加工。

2.3 茶樹精油微膠囊結(jié)構(gòu)表征

通過測定試驗優(yōu)化得到的茶樹精油微膠囊粒徑分布可以看出（圖4），微膠囊的粒徑范圍在0.2～2.3 μm之間，且呈正態(tài)分布。與文獻(xiàn)報道的微膠囊粒徑大小形狀存在差異的原因主要是載體、活性成分及交聯(lián)劑的相互作用不同導(dǎo)致的[27]。其中，茶樹精油微膠囊的粒徑70%左右分布在0.3～0.6 μm區(qū)間。說明通過優(yōu)化試驗得到的茶樹精油微膠囊顆粒分布均勻，該工藝能有效均勻地完成對茶樹精油的包埋。

圖4 茶樹精油微膠囊粒徑分布Fig. 4 Particle size distribution of TTO microcapsules

為進(jìn)一步表征茶樹精油微膠囊的顆粒形態(tài)，通過掃描電鏡觀察該微膠囊顆粒（圖5），顆粒在體系中呈均勻的不規(guī)則顆粒分布，說明實驗方法能有效制備茶樹精油微膠囊，并且微囊顆粒分布均勻。

圖5 掃描電鏡結(jié)果Fig. 5 Scanning electron micrograph of TTO microcapsules

2.4 茶樹精油微膠囊功能性分析

2.4.1 體外殺菌作用

從圖6a可以看出，隨著貯藏時間的延長，茶樹精油在貯藏0～9 d內(nèi)對大腸桿菌的殺滅作用逐漸降低，并在第9天時無殺滅作用；而對于茶樹精油微膠囊，在貯藏0～15 d內(nèi)，其殺菌作用從2.27（lg（CFU/g））降低至1.89（lg（CFU/g））。對于金黃色葡萄球菌，茶樹精油在貯藏第6天即喪失殺滅作用（圖6b），而茶樹精油微膠囊在貯藏0～15 d內(nèi)，對金黃色葡萄球菌的殺滅作用從1.89（lg（CFU/g））降低至1.32 （lg（CFU/g））。說明微囊化處理能有效維持茶樹精油的體外殺菌能力。

圖6 茶樹精油微膠囊殺菌作用Fig. 6 Antimicrobial potential of TTO microcapsules

2.4.2 體外抗氧化作用

圖7 茶樹精油微膠囊DPPH自由基清除率Fig. 7 DPPH free radical scavenging capacity of TTO microcapsules

從圖7可以看出，隨著貯藏時間的延長，茶樹精油對DPPH自由基的清除能力不斷降低，在貯藏至第15天時，該清除能力從初始的72.75%降低至21.5%；而茶樹精油微膠囊隨著貯藏時間的延長，對DPPH自由基的清除能力不斷增加，并且在貯藏至第6天時，茶樹精油微膠囊對DPPH自由基的清除率大于茶樹精油。說明微膠囊工藝在實現(xiàn)茶樹精油包埋同時，提高了茶樹精油的穩(wěn)定性。

2.5 茶樹精油微膠囊體外釋放規(guī)律

釋放性能是載藥微膠囊的重要性能指標(biāo)，既可以保持活性物質(zhì)在體系中不斷釋放，也可以提高活性物質(zhì)的穩(wěn)定性，從而達(dá)到長效作用[28-29]。從圖8可以看出，在不同種類的食品模擬體系中，微膠囊中的茶樹精油釋放率大致相同，均表現(xiàn)為在0～20 min均能夠快速釋放，在釋放20～30 min后變緩并逐漸穩(wěn)定。其中，茶樹精油微膠囊在高水分活度模擬體系（T1）中有最大的釋放速度及釋放率，在該體系中釋放20 min后，釋放率可超過50%，隨著時間繼續(xù)延長至30 min后，茶樹精油的釋放率達(dá)到55.7%。其次為高醇溶液食品模擬體系（T2）和水分活度為0.6～0.7的食品模擬體系（T3），在30 min后茶樹精油的釋放率分別為50.2%和43.2%。另外，在脂肪類食品模擬體系（T4）中釋放速率及釋放率最低，30 min中體系中茶樹精油的釋放率僅為37.3%。茶樹精油微膠囊在不同液態(tài)食品模擬液中的釋放速率存在差異，可能由于液態(tài)食品中的水分活度及黏度不同導(dǎo)致[30]。

圖8 茶樹精油微膠囊食品模擬體系釋放曲線Fig. 8 Release curves of TTO microcapsules in food model systems

3 結(jié) 論

以TPP為交聯(lián)劑，通過離子凝膠法可以有效制備茶樹精油-CS微膠囊。茶樹精油添加量和CS與TPP質(zhì)量比對微膠囊粒徑和茶樹精油的包埋率有顯著影響，但是二者對粒徑和包埋率無顯著交互作用。通過響應(yīng)面試驗優(yōu)化得到CS與TPP質(zhì)量比5.30∶1、茶樹精油添加量11.30 mg/mL時，茶樹精油微膠囊的粒徑最小為（0.74±0.03）μm，包埋率最大為（53.15±0.32）%。

制備的茶樹精油微膠囊有穩(wěn)定但不均一的結(jié)構(gòu)，微膠囊的粒徑范圍在0.2～2.3 μm之間，且呈正態(tài)分布。微囊化工藝可以明顯提高茶樹精油的穩(wěn)定性，表現(xiàn)為茶樹精油微膠囊在0～15 d時，有穩(wěn)定的體外殺菌性和抗氧化性。

茶樹精油微膠囊在不同的食品模擬體系中均能快速釋放，并在30 min后逐漸穩(wěn)定。說明該工藝可以用于對茶樹精油的微囊化包埋，從而提高茶樹精油的穩(wěn)定性。