發光細菌法在農藥污染毒性檢測中的應用研究進展

韋淑穩　董莉莎　張巖　裴義山　徐升

摘要發光細菌法具有反應快速靈敏、低價高效、對環境友好等特點，常用于環境污染監測。本文綜述了發光細菌法在農藥污染毒性檢測領域的應用研究進展，重點介紹了費氏弧菌、青海弧菌、明亮發光桿菌在人工合成化學農藥、生物農藥單一毒性檢測以及在重金屬一農藥聯合污染毒性檢測中的應用，并提出了發光細菌法在農藥與其他多重污染物毒性檢測中的應用前景。

關鍵詞 發光細菌法;農藥污染;毒性檢測

中圖分類號 TQ450.9

文獻標識碼 A

文章編號 1007-5739（2019）05-0121-04

1國內外農藥污染現狀

目前，世界上生產和使用的農藥有幾千種，生產上每年要使用約350萬t的農藥，并以10%左右的速度遞增。其中，中國、美國、阿根廷占到了70%;僅中國就約占總量的50%，成為世界第一生產和出口大國。我國農藥生產主要集中在江蘇浙江、天津、山東等省（市），其中江蘇、浙江的農藥產量占全國總產量的1/3以上，農藥使用量較大的是山東、江蘇、廣東、浙江等省。農藥施用后，僅有30%左右附著于植物體上，或滲入植株體內殘留下來，使糧、菜、水果等受到污染;其余70%左右散落在土壤上，或蒸發、散逸到空氣中，或隨雨水及農田排水流入河湖，污染水體和水生生物，經食物鏈最終進入人體，引起各種慢性或急性病害，嚴重危害人體健康。2015年以來，農業部開展化肥、農藥使用量零增長行動，每年安排逾40億元專項資金，堅持“產出來”“管出來"兩手抓、兩手硬，切實提高農產品質量安全水平，強化投人品管理，提升綠色生產水平。在加強農藥、獸藥等投入品生產銷售管理的同時，進一步強化安全用藥指導服務，有效控制殘留超標，消除風險隱患。

2發光細菌的分類及其毒性檢測原理

2.1發光細菌的分類

發光細菌是一種非致病性、能進行生物發光的細菌，多數為海生，與發光浮游生物相同，能引起海面發光。發光細菌有傳統分類、系統分類、數值分類等幾種不同的分類方法。目前，多以美國學者P.Baumann的分類方法進行劃分，分為弧菌屬、發光桿菌屬和發光異短桿菌屬"。

2.2發光細菌法毒性檢測原理

正常條件下，發光細菌能發出肉眼可見熒光，響應波長為450-490nm。發光菌形態多種多樣，但生理特性卻非常相似，發光機理基本相同。發光細菌含有熒光素熒光酶ATP等發光要素，在有氧條件下由分子氧作用，胞內熒光酶催化，將還原態的黃素單核苷酸（FMNH2）、長鏈脂肪醛氧化為FMN、長鏈脂肪酸，同時釋放出最大發光強度在波長為450～490nm處的可見藍綠光。

當細胞活性升高、處于積極分裂狀態時，其ATP含量高，發光強度增強;而毒性物質的存在會直接抑制參與發光反應的酶類活性，并抑制細胞內與發光反應有關的代謝過程，抑制發光，且毒性越強抑制效果越明顯。在一定的試驗條件下，發光細菌發光強度恒定，發光變化的程度與受試物的濃度在一定范圍內呈相關關系，同時與該物質的毒性大小有關。大量的研究表明，用發光細菌檢測毒性的結果與魚類或小鼠毒性檢測的結果相比，其一致性較好，對污染物或毒性物質的檢測試驗僅需15～60min，具有快速靈敏、低價高效、對環境友好等特點。對于能夠干擾或破壞發光細菌呼吸、生長、新陳代謝等生理過程的任何有毒物質都可以根據發光強度的變化來測定，如重金屬、CN-、農藥、酚類化合物、抗生素等。目前，國內常用的3種發光細菌為明亮發光桿菌費氏弧菌、青海弧菌。其中，應用于農藥污染毒性檢測中的主要發光細菌種類見表1。

3發光細菌法在農藥污染毒性檢測中的應用

3.1在人工合成化學農藥污染毒性檢測中的應用

3.1.1殺蟲劑。目前，中國殺蟲劑市場正面臨市場占比和使用量雙降的態勢，產品安全性環境友好性逐步提高，但殺蟲劑的用量及其對環境的影響依然是農藥中最大的種類。張歡等采用青海弧菌凍干粉對不同濃度農藥敵敵畏溶液的毒性進行快速測試，試驗結果表明，系統的穩定性、可重復性、準確性可達到甚至優于傳統方法。袁東星等4通過激活凍干發光細菌粉對空心菜中6種有機磷農藥乳劑（甲胺磷敵敵畏、辛硫磷、氧樂果、甲基異硫磷、水胺硫磷）進行檢測，響應結果表明，發光強度與6種農藥毒性均成負相關關系，檢出限約為1mg/L，測定下限為3mg/L，響應曲線滿足現場快速檢測的要求。吳淑杭等以明亮發光桿菌T3變種作為毒性測試物種，研究了樂果、殺蟲單等8種化學殺蟲劑急性毒性，結果表明，在一定濃度范圍內，不同殺蟲劑對明亮發光桿菌的急性毒性不同，發光菌的相對發光率與殺蟲劑濃度成極好的線性負相關;4種有機磷殺蟲劑乙酰甲胺磷、樂果敵敵畏與敵百蟲對明亮發光桿菌的ECo（15min）分別40.33、38.42、31.11、11.10mg/L，2種擬除蟲菊酯類殺蟲劑氰戊菊酯、高效氯氰菊酯ECso分別為23.56、14.63mg/L，噠螨靈和殺蟲單ECo分別為18.32、2.72mg/L，相較而言，有機磷殺蟲劑對發光菌的毒性更弱一些。修壘等6選取氯氰菊酯、敵敵畏2種農藥作為污染檢測物，利用青海弧菌Q67測定其對發光細菌的毒性影響，得出毒性大小為氯氰菊酯>敵敵畏，雖然測試菌種不同，但是2種農藥對發光細菌的毒性大小與吳淑杭等研究結果相似。

在測試條件的研究方面，唐雪惠等叫以敵敵畏和氧化樂果為研究對象，采用以發光菌綜合毒性檢測技術為基礎的在線毒性分析儀監測有機磷類農藥對水體的水質毒性效果，結果表明，氧化樂果和敵敵畏均能引起明顯的毒性反應，ECxo與ECso均為mg級，該在線毒性監測儀更適用于突發性高濃度特征污染物的水質預警。魏芳等8以明亮發光桿菌為菌種，以40%樂果乳劑為供試農藥，不僅初步研究了農藥毒性可檢測的濃度范圍及靈敏度，同時初步確定pH值為7條件下發光強度最強。

在土壤中農藥的檢測研究中，張建江等以明亮發光桿菌作為測試菌種，對土壤中敵百蟲進行毒性測試得出發光菌的相對發光率與敵百蟲的濃度成負相關。張勝田等1以典型有機氯農藥氯丹為研究對象，重點研究了氯丹在不同理化性質土壤顆粒中的吸附特性及其對發光菌急性毒性的影響，研究結果表明，不同粒徑的土壤顆粒對氯丹的吸附性能依次為黏粒（<2μm）≈粉粒（2～20μum）>粗砂（200～2000pum）>細砂（20～200μm），4種土壤顆粒浸出液對發光菌毒性與吸附能力成負相關，較大粒徑（20～2000μm）土壤顆粒吸附氯丹后易于解吸，對發光菌的急性毒性最大。Jose Antonio等叫研究了2種廢棄礦井土壤的農藥流動性和滲濾液毒性，發現農藥滲濾液對生物發光抑制的一般趨勢不像金屬濃度隨時間降低，而且污染土壤經改良能輕微減輕對費氏弧菌的毒性，結果與農藥淋出量減少趨勢一致。農藥污染土壞滲濾液的毒性評估可以為化學分析提供有價值的補充信息，但目前我國尚缺乏以發光細菌為試驗對象對土壤中的有毒污染物進行測試的標準試驗方法。