紫藍(lán)素大鼠經(jīng)口給藥長(zhǎng)期毒性*

郟自明，謝運(yùn)昌，樊柏林

(1.湖北省疾病預(yù)防控制中心、應(yīng)用毒理湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430075；2.廣西壯族自治區(qū)中國(guó)科學(xué)院廣西植物研究所植物功能物質(zhì)研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，桂林 541006)

紫藍(lán)素是從植物紅絲線中提取的單體化合物，是一種新型雜環(huán)化合物，2005年獲得國(guó)家專利[1]，具有較強(qiáng)的抗乙型肝炎病毒作用和抗氧化作用[2]，能抑制蛋白酪氨酸酯酶，增加胰島素敏感性[3]。紫藍(lán)素臨床擬采用口服給藥，以最大的給藥量對(duì)大鼠24 h內(nèi)經(jīng)口給予紫藍(lán)素8 g·kg-1，未發(fā)現(xiàn)動(dòng)物死亡和明顯的毒性反應(yīng)，為充分暴露藥物的毒性反應(yīng)還設(shè)計(jì)了紫藍(lán)素大鼠單次靜脈注射給藥的最大耐受量大于700 mg·kg-1[4]。按照藥品注冊(cè)管理辦法的《中藥、天然藥物注冊(cè)分類及申報(bào)資料要求》[5]，還需進(jìn)一步研究該藥物的慢性毒副作用，筆者按照藥物長(zhǎng)期毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則[6]對(duì)紫藍(lán)素進(jìn)行了大鼠經(jīng)口給藥6個(gè)月長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)，觀察大鼠長(zhǎng)期反復(fù)經(jīng)口給予紫藍(lán)素后所產(chǎn)生不良反應(yīng)的性質(zhì)和程度，尋找毒性靶器官和長(zhǎng)期用藥后可能出現(xiàn)的延遲性毒副反應(yīng)，以期確定無(wú)毒性反應(yīng)劑量，為擬定人用安全劑量提供參考。

1 材料與方法

1.1藥物、溶媒與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 紫藍(lán)素為黑褐色無(wú)定形固體粉末，單體化合物，由中國(guó)科學(xué)院廣西植物研究所提供(批號(hào)：20080301)。溶媒為羧甲基纖維素鈉(carboxymethylcellulose sodium，CMC)，購(gòu)于安徽山河藥用輔料有限公司(批號(hào)：061103)。

選取5～6周齡Wistar大鼠(SPF級(jí))，雌雄各80只，給藥開始時(shí)雌性大鼠平均體質(zhì)量131.1 g、雄性大鼠平均體質(zhì)量147.9 g，購(gòu)于湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(鄂)2008-0005，實(shí)驗(yàn)大鼠飼養(yǎng)于屏障系統(tǒng)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(鄂)2009-0023。

1.2主要儀器 雅培3700全自動(dòng)血液分析儀，希森美康CA-1500全自動(dòng)血凝分析儀，日立-7060全自動(dòng)生化分析儀，奧豪斯AV2101動(dòng)物天平(感量：0.1 g)和AR3130組織天平(感量：0.001 g)，LEICA TP 1020全自動(dòng)脫水儀，LEICA EG 1140全自動(dòng)包埋儀、MICROM HM360輪轉(zhuǎn)切片機(jī)，Nikon E400光學(xué)顯微鏡和Nikon E600光學(xué)顯微鏡。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 大鼠隨機(jī)分為4組[7]，每組40只，雌雄各20只。即紫藍(lán)素大劑量組(2000 mg·kg-1·d-1，相當(dāng)于大鼠藥效學(xué)劑量的200倍)，中劑量組(200 mg ·kg-1·d-1，相當(dāng)于大鼠藥效學(xué)劑量的20倍)，小劑量組(20 mg ·kg-1·d-1，相當(dāng)于大鼠藥效學(xué)劑量的2倍)，對(duì)照組給予等體積5%CMC。每天按10 mL·kg-1灌胃給藥1次，連續(xù)給藥6個(gè)月，每周按動(dòng)物體質(zhì)量調(diào)整一次給藥量。給藥3個(gè)月后各組取10只大鼠(雌雄各半)進(jìn)行中期檢查，末次給藥后24 h，各組取20只大鼠(雌雄各半)進(jìn)行末期檢查，停藥后各組余10只大鼠(雌雄各半)進(jìn)行4周的恢復(fù)期觀察。

每日觀察1次大鼠的一般癥狀，包括外觀體征、毛色、行為活動(dòng)、尿液、糞便性狀；每周檢測(cè)1次動(dòng)物體質(zhì)量、進(jìn)食量和飲水量；血液學(xué)、血液生化學(xué)、臟器系數(shù)和病理組織學(xué)檢查分別在給藥中期、給藥末期和恢復(fù)期觀察結(jié)束后進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1對(duì)大鼠一般狀況的影響 給藥當(dāng)天下午紫藍(lán)素小、中劑量組大鼠尿液呈橘黃色，大劑量組大鼠糞便呈紫黑色，尿液呈橘紅色。給藥第2天后小劑量組大鼠糞便呈藍(lán)色，尿液呈橘黃色，中劑量組大鼠糞便呈紫藍(lán)色，尿液呈橘黃色。恢復(fù)期停藥1 d后，小劑量組大鼠糞便、尿液顏色恢復(fù)正常，中劑量組大鼠糞便呈藍(lán)色，尿液呈淺黃色，大劑量組大鼠糞便呈紫黑色，尿液呈橘紅色；停藥2 d后，中劑量組大鼠糞便、尿液顏色恢復(fù)正常，大劑量組大鼠糞便呈紫藍(lán)色，尿液呈淺黃色；停藥3 d后，大劑量組大鼠糞便、尿液顏色恢復(fù)正常。給藥期和恢復(fù)期各組大鼠的外觀體征、行為活動(dòng)、毛色、呼吸及對(duì)外界反應(yīng)均未見明顯異常。

2.2對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響 雌鼠：紫藍(lán)素大劑量組大鼠第5～25周體質(zhì)量低于對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，第26周顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，恢復(fù)期紫藍(lán)素大劑量組體質(zhì)量與對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。紫藍(lán)素小、中劑量組雌性大鼠給藥期和恢復(fù)期體質(zhì)量與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

雄鼠：紫藍(lán)素大劑量組大鼠第3～13周體質(zhì)量低于對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，自第14周起紫藍(lán)素大劑量組大鼠體質(zhì)量顯著低于對(duì)照組，恢復(fù)期4周后體質(zhì)量仍顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。紫藍(lán)素小、中劑量組大鼠給藥期和恢復(fù)期體質(zhì)量與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

表1 雌性大鼠體質(zhì)量的變化Tab.1 Changes of body weight of female rats

0～13周n=20；14～26周n=15；恢復(fù)期n=5；與對(duì)照組比較,*1P<0.05。
0w-13w,n=20;14w-26w,n=15;recovery period,n=5;Compared with control group,*1P<0.05.

表2 雄性大鼠體質(zhì)量的變化 Tab.2 Changes of body weight of male rats

續(xù)表2 雄性大鼠體質(zhì)量的變化 Tab.2 Changes of body weight of male rats

0～13周n=20；14～26周n=15；恢復(fù)期n=5；與對(duì)照組比較，*1P<0.05。
0w-13w,n=20;14w-26w,n=15;recovery period,n=5;Compared with control group,*1P<0.05.

2.3對(duì)大鼠攝食量和飲水量的影響 給藥期和恢復(fù)期紫藍(lán)素小、中和大劑量組的攝食量及飲水量與對(duì)照組比較均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4對(duì)血液學(xué)指標(biāo)的影響 給藥中期：紫藍(lán)素大、中劑量組大鼠嗜中性粒細(xì)胞比例明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，淋巴細(xì)胞比例明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，中劑量組網(wǎng)織紅細(xì)胞比例明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，大劑量組血小板計(jì)數(shù)明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。其他各項(xiàng)血液學(xué)指標(biāo)紫藍(lán)素大、中、小劑量組與對(duì)照組之間均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。給藥末期：紫藍(lán)素大劑量組紅細(xì)胞、血紅蛋白、嗜酸性粒細(xì)胞比例、淋巴細(xì)胞比例均明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，中性粒細(xì)胞比例明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。其他各項(xiàng)血液學(xué)指標(biāo)紫藍(lán)素大、中、小劑量組與對(duì)照組之間均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。恢復(fù)期：紫藍(lán)素大、中、小劑量組各血液學(xué)指標(biāo)與對(duì)照組比較均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)。

表3 4組大鼠血液學(xué)指標(biāo)的變化Tab.3 Changes of hematology of four groups of rats

續(xù)表3 4組大鼠血液學(xué)指標(biāo)的變化Tab.3 Changes of hematology of four groups of rats

與對(duì)照組比較，*1P<0.05。
Compared with control group，*1P<0.05.

2.5對(duì)血液生化學(xué)指標(biāo)的影響 給藥中期：紫藍(lán)素中劑量組丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。大劑量組肌酐(Cr)明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，中劑量組氯離子(Cl-)含量明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。其他各項(xiàng)血液生化學(xué)指標(biāo)紫藍(lán)素大、中、小劑量組與對(duì)照組之間均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

給藥末期：紫藍(lán)素大劑量組總蛋白(TP)、Cr、肌酸磷酸激酶(CKP)明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，紫藍(lán)素中、小劑量組Cr、CKP低于對(duì)照組(P<0.05)。其他各項(xiàng)血液生化學(xué)指標(biāo)大、中、小劑量組與對(duì)照組之間均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。恢復(fù)期：紫藍(lán)素大、中劑量組總膽固醇(T-CHO)明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。其他各項(xiàng)血液生化學(xué)指標(biāo)紫藍(lán)素大、中、小劑量組與對(duì)照組之間均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表4)。

表4 大鼠血液生化指標(biāo)的變化Tab.4 Changes of blood biochemical indexes of rats

續(xù)表4 大鼠血液生化指標(biāo)的變化Tab.4 Changes of blood biochemical indexes of rats

與對(duì)照組比較，*1P<0.05。
Compared with control group,*1P<0.05.

2.6對(duì)臟器系數(shù)的影響 雌鼠：給藥中期紫藍(lán)素大劑量組腎臟、心臟系數(shù)明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，給藥末期脾臟、卵巢系數(shù)明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。恢復(fù)期紫藍(lán)素大、中、小劑量組各臟器系數(shù)與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表5)。

表5 雌性大鼠臟器系數(shù)的變化Tab.5 Changes of organ coefficient of female rats

續(xù)表5 雌性大鼠臟器系數(shù)的變化Tab.5 Changes of organ coefficient of female rats

與對(duì)照組比較，*1P<0.05。
Compared with control group,*1P<0.05.

雄鼠：給藥中期紫藍(lán)素大劑量組脾臟系數(shù)明顯高于對(duì)照組(P<0.05)；給藥末期大劑量組腎臟系數(shù)明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，小劑量組脾臟系數(shù)明顯低于對(duì)照組(P<0.05)；恢復(fù)期大劑量組腎臟系數(shù)明顯高于對(duì)照組(P<0.05)(表6)。

表6 雄性大鼠臟器系數(shù)的變化Tab.6 Changes of organ coefficient of male rats

續(xù)表6 雄性大鼠臟器系數(shù)的變化Tab.6 Changes of organ coefficient of male rats

與對(duì)照組比較，*1P<0.05。
Compared with control group,*1P<0.05.

2.7對(duì)臟器病理組織學(xué)的影響 經(jīng)對(duì)各期和各組大鼠的多種組織切片對(duì)比觀察，結(jié)果表明：對(duì)大鼠反復(fù)經(jīng)口6個(gè)月給予紫藍(lán)素，未見藥物所致毒性病理改變，停藥4周后，亦未見藥物引起的延遲性毒性反應(yīng)。

3 討論

紫藍(lán)素為黑褐色無(wú)定形固體粉末，大鼠各劑量組連續(xù)灌胃給予紫藍(lán)素后糞便、尿液顏色發(fā)生改變?cè)驗(yàn)闃悠繁旧眍伾拢瑹o(wú)毒理學(xué)意義，且小劑量組停藥1 d后大鼠糞便、尿液顏色恢復(fù)正常，中劑量組停藥2 d后大鼠糞便、尿液顏色恢復(fù)正常，大劑量組停藥3 d后大鼠糞便、尿液顏色恢復(fù)正常。

大鼠體質(zhì)量結(jié)果顯示，大鼠連續(xù)灌胃給予大劑量紫藍(lán)素后體質(zhì)量低于對(duì)照組，并且對(duì)大鼠攝食量和飲水量檢測(cè)結(jié)果顯示各劑量組的攝食量及飲水量與對(duì)照組比較均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，可見大劑量紫藍(lán)素對(duì)大鼠體質(zhì)量有一定的抑制作用。

給藥中期紫藍(lán)素大、中劑量組大鼠中性粒細(xì)胞比例顯著高于對(duì)照組，淋巴細(xì)胞比例顯著低于對(duì)照組；給藥末期大劑量組中性粒細(xì)胞比例顯著高于對(duì)照組，紅細(xì)胞、血紅蛋白、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞顯著低于對(duì)照組，表明大、中劑量紫藍(lán)素可引起大鼠中性粒細(xì)胞升高，淋巴細(xì)胞、紅細(xì)胞、血紅蛋白、嗜酸性粒細(xì)胞降低，4周后上述各項(xiàng)血液學(xué)指標(biāo)均可恢復(fù)正常；紫藍(lán)素大劑量組Cr顯著低于對(duì)照組，給藥末期紫藍(lán)素大劑量組TP、Cr、CKP顯著低于對(duì)照組，表明大劑量紫藍(lán)素可引起大鼠TP、Cr、CKP含量降低，4周后上述各項(xiàng)血液學(xué)指標(biāo)均可恢復(fù)正常。

給藥中期紫藍(lán)素中劑量組網(wǎng)織紅細(xì)胞、大劑量組血小板計(jì)數(shù)明顯高于對(duì)照組，給藥中期紫藍(lán)素中劑量組ALT明顯低于對(duì)照組、Cl-含量明顯高于對(duì)照組，恢復(fù)期紫藍(lán)素大、中劑量組T-CHO明顯低于對(duì)照組，上述數(shù)據(jù)值均在本中心正常背景數(shù)據(jù)值和文獻(xiàn)報(bào)道[8-9]正常值范圍內(nèi)，說明無(wú)毒理學(xué)意義。

雌鼠紫藍(lán)素大劑量組給藥中期腎臟、心臟系數(shù)升高，給藥末期脾臟、卵巢系數(shù)升高；雄鼠紫藍(lán)素大劑量組給藥中期脾臟系數(shù)升高，給藥末期腎臟系數(shù)升高，恢復(fù)期腎臟系數(shù)升高。但對(duì)腎臟、心臟、脾臟和卵巢的病理組織學(xué)檢查均又未見明顯異常，說明上述臟器系數(shù)的升高可能與動(dòng)物體質(zhì)量低于對(duì)照組有關(guān)，與樣品本身毒性無(wú)關(guān)。

綜上所述，紫藍(lán)素對(duì)大鼠反復(fù)經(jīng)口給藥6個(gè)月，20 mg·kg-1·d-1為安全劑量，根據(jù)體表面積等效劑量換算為臨床劑量的10倍；200 mg·kg-1·d-1可引起大鼠中性粒細(xì)胞升高、淋巴細(xì)胞降低；2000 mg·kg-1·d-1對(duì)大鼠體質(zhì)量有一定的抑制作用，可引起大鼠中性粒細(xì)胞升高，淋巴細(xì)胞、紅細(xì)胞、血紅蛋白、嗜酸性粒細(xì)胞降低，可引起大鼠TP、Cr、CKP含量降低，停藥4周后均可恢復(fù)正常。