高效表達淀粉酶Bacillus koreensis的培養(yǎng)基響應面優(yōu)化

何 偉，李菁菁，包可翔，顏奕華，姜振錕，林 儉，陳善義，李易非

福建中煙工業(yè)有限責任公司技術中心，廈門 361021

淀粉是煙草中一類重要的碳水化合物，新鮮煙葉通過調(diào)制，大部分淀粉經(jīng)酶解反應降解為還原糖。但調(diào)制后的煙葉仍殘留少量淀粉，這對煙葉內(nèi)在質(zhì)量有不利的影響[1]。以淀粉形式存在的糖類在卷煙燃吸時會影響燃燒速率和完全性，并產(chǎn)生糊焦氣味，影響煙葉的香味和內(nèi)在品質(zhì)，因此淀粉含量的高低對烤煙煙葉的品質(zhì)有重要影響[2,3]?，F(xiàn)有調(diào)制方法中淀粉降解轉(zhuǎn)化不夠充分，導致中國成品煙葉的淀粉含量普遍偏高，約為4%～6%，遠高于國外優(yōu)質(zhì)成品煙中的淀粉含量(約為 1%～2%)[4,5]。烤后煙葉淀粉殘留量過高已成為制約中國煙葉質(zhì)量提高的重要因素之一。

近年來，利用外加微生物或酶制劑降低煙葉中的淀粉含量、提高煙葉的可用性己成為煙葉原料研究的熱點之一。馮穎杰等[6]研究發(fā)現(xiàn)，向煙葉中施加高效產(chǎn)淀粉酶的蘇云金芽孢桿菌，煙葉中淀粉大幅度降低，煙葉的總糖、還原糖含量上升，有效提升了煙葉的整體質(zhì)量。沙云菲等[7]研究了淀粉酶復合酶制劑對上部煙葉的降解效果，處理后效果顯著。李曉等[8]采用α-淀粉酶、糖化酶分別處理烤煙和白肋煙，處理后煙葉品質(zhì)明顯改善。此外，這些生物技術在煙草中的應用還必須考慮到微生物和酶制劑自身所帶來的污染、安全性和失活不穩(wěn)定等多種因素。

本實驗室前期從云南馬龍C3F-2014煙葉表面篩選出一株能夠高效表達淀粉酶的Bacilluskoreensis。本研究以該菌株為研究對象，利用響應面法優(yōu)化了其發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源、氮源和金屬離子，提高了Bacilluskoreensis表達淀粉酶的產(chǎn)量，為煙草天然源淀粉酶處理煙葉，提高煙葉品質(zhì)的工業(yè)化應用提供了基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)基

1.1.1Bacilluskoreensis，由云南馬龍C3F-2014片煙分離純化得到。

1.1.2 種子培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基)：10 g/L胰蛋白胨、5 g/L 酵母提取物、10 g/L 氯化鈉，pH=7.0。

1.1.3 初始發(fā)酵培養(yǎng)基(牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基)：3 g/L牛肉膏，10 g/L蛋白胨，5 g/L氯化鈉，pH=7.0。

1.2 試劑與儀器

試劑：胰蛋白胨等生物試劑，葡萄糖、淀粉、氯化鈉等分析純試劑，DNS等化學純試劑均購自于國藥集團化學試劑有限公司；牛肉浸膏購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；酵母粉購自英國Oxoid公司。

主要儀器設備：SW-CJ-2FD型超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；CLC-B2V-M/CLC 222-TV型恒溫培養(yǎng)箱，MMM Group(德國)；1-14型離心機，SIGMA(德國)；DMG-9423A型烘箱，上海精宏；QS-2A型切絲機，鄭州嘉徳機電科技有限公司；Lambda 35型分光光度計，PerkinElmer(美國)；VX-95型滅菌鍋，Systec(德國)；Milli-Q Integral 5型純水機，Millipore(美國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種培養(yǎng)

1.3.1.1 平板活化

從甘油管中將菌種接種到牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h。

1.3.1.2 種子培養(yǎng)基培養(yǎng)

從平板上挑取單菌落接種種子培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)6 h至培養(yǎng)基渾濁，溫度為37 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為180 rpm。

1.3.1.3 發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)

按3%的接種量將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)36 h，測定淀粉酶活。

1.3.2 淀粉酶活的測定

1.3.2.1 葡萄糖標準曲線的繪制

按表1配制不同濃度的葡萄糖溶液反應體系，沸水浴反應5 min，冷卻后加蒸餾水定容到25 ml。0號為空白，作為調(diào)零管。用可見光分光光度計在540 nm波長處測定吸光光度值。

表1 葡萄糖標準曲線配置表

1.3.2.2 粗酶液淀粉酶活的測定

將1 mL發(fā)酵液和1 mL 1%淀粉溶液混合并在 37 ℃水浴條件下保溫5 min(混合之前各自在37 ℃預熱5 min)。加入1.5 mL DNS試劑后在沸水浴5 min使酶失活，冷卻后用蒸餾水定容到25 mL?？瞻诪榘l(fā)酵液和淀粉溶液混合直接沸水浴，再加1.5 mL DNS，沸水浴5 min，冷卻后用蒸餾水定容到25 mL。用可見光分光光度計在540 nm波長處測定樣品吸光光度值。

1.3.2.3 淀粉酶活性定義及計算方法

淀粉酶活力單位定義(U/mL)：在37 ℃條件下，1 mL酶液每分鐘水解淀粉產(chǎn)生1 μg葡萄糖所用的酶量為1個酶活力單位。

淀粉酶酶活力根據(jù)以下公式進行計算：

淀粉酶酶活力(U/mL)=生成的葡萄糖毫克數(shù)×N×1 000/5

式中：N-稀釋倍數(shù)；1 000-轉(zhuǎn)化成 μg；5-反應時間 5 min。

1.3.3 單因素試驗

分別對碳源、氮源、金屬離子、氯化鈉濃度、接種量、培養(yǎng)溫度、初始pH進行優(yōu)化，測定每種因素對淀粉酶活的影響，選擇最佳培養(yǎng)基成分。

1.3.4 PB設計

PB設計用于考察8個獨立變量對響應值也就是淀粉酶活的影響，從而挑選出影響顯著的因素。每個獨立變量有個兩個水平，分別表示為+1和-1，各因素的設計濃度見表2。

表2 PB設計培養(yǎng)基組分和水平

1.3.5 BBD響應面設計

Box-Behnken設計適用于2～5個因素的優(yōu)化試驗?；赑B試驗設計和最陡爬坡試驗的試驗結(jié)果，采用3因素的Box-Behnken design(BBD)設計來分析各因素之間的關系并得到最優(yōu)培養(yǎng)基配方。以PB設計篩選得到的對淀粉酶活影響顯著的因素作為設計因素，以最陡爬坡試驗得出的濃度作為中心點，每個因素設有-1.68、-1、0、+1、+1.68五個水平(見表3)。

表3 BBD設計的因素水平

2 結(jié)果與分析

以牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基作為初始發(fā)酵培養(yǎng)基對Bacilluskoreensis的發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，初始發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵所得到的淀粉酶活為565.13 U/mL。

2.1 單因素試驗

2.1.1 碳源對Bacilluskoreensis表達淀粉酶的影響

碳源是構(gòu)成菌體的基本骨架，是菌體生長的能量來源，通過影響菌體的呼吸、能量供給、生長及相關代謝最終影響抗生素等次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量[9]。選擇15 g/L的不同碳源進行碳源優(yōu)化試驗，結(jié)果如圖1所示，以淀粉作為碳源時酶活最高，其次是蔗糖和葡萄糖。因此，在下個階段的PB設計中，將淀粉作為考察因素。

2.1.2 氮源對Bacilluskoreensis表達淀粉酶的影響

氮源在合成菌體各種初級、次級代謝產(chǎn)物等含氮物質(zhì)的過程中發(fā)揮著重要作用，同時在發(fā)酵生產(chǎn)中氮源起著調(diào)節(jié)菌體的生長及生物量的作用[10]。選擇20 g/L的不同氮源進行氮源優(yōu)化試驗，結(jié)果如圖2所示，菌株以蛋白胨作為氮源時酶活較高，其次是酵母粉培養(yǎng)基。因此，在下個階段的PB設計中，將蛋白胨和酵母粉含量作為考察因素。

圖1 不同碳源對淀粉酶活的影響Fig.1 The effect of different carbon sources on amylase activity注：1.淀粉，2.葡萄糖，3.乳糖，4.蔗糖，5.麥芽糖，6.對照(CK)。Note：1.Starch,2.Glucose,3.Lactose,4.Sucrose,5.Maltose,6.Contrast(CK).

圖2 不同氮源對淀粉酶活的影響Fig.2 The effect of different nitrogen sources on amylase activity注：1.蛋白胨，2.酵母粉，3.胰蛋白胨，4.牛肉膏，5.牛肉膏+蛋白胨，6.牛肉膏+胰蛋白胨。Note:1.Peptone,2.Yeast extract,3.Tryptone,4.Beef extract,5.Beef extract+Peptone,6.Beef extract+Tryptone.

2.1.3 金屬離子對Bacilluskoreensis表達淀粉酶的影響

金屬離子是微生物生命活動中必不可少的一類營養(yǎng)物質(zhì)，它們在機體中的生理功能主要是作為酶的活性中心的組成部分、維持細胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性等。不同金屬離子產(chǎn)酶發(fā)酵結(jié)果見圖3，培養(yǎng)基中添加Ca2+、Fe2+對菌株產(chǎn)酶有促進作用，而添加Mg2+和Zn2+對菌株產(chǎn)酶有一定的抑制作用，尤其是Zn2+對Bacilluskoreensis產(chǎn)酶有顯著的抑制作用。Ca2+和Fe2+的濃度試驗表明，添加濃度為0.5 g/L的Ca2+和Fe2+時，菌株酶活最高。因此，在下個階段的PB設計中，將CaCl2和 FeSO4·7H2O作為考察因素。

2.1.4 不同鹽濃度對Bacilluskoreensis表達淀粉酶的影響

不同鹽濃度產(chǎn)酶發(fā)酵結(jié)果見圖4，隨著培養(yǎng)基鹽濃度的增加，菌株產(chǎn)酶活力逐漸下降。當不添加鹽時，酶活最高，鹽濃度高于0.8%時，淀粉酶活顯著下降。因此，Bacilluskoreensis培養(yǎng)基選擇不添加 NaCl。

圖3 不同金屬離子對淀粉酶活的影響Fig.3 The effect of different metal ion on amylase activity

圖4 不同NaCl濃度對淀粉酶活的影響Fig.4 The effect of different concentrations of NaCl on amylase activity

2.1.5 不同接種量對Bacilluskoreensis表達淀粉酶的影響

由圖5可知，接種量對Bacilluskoreensis產(chǎn)酶影響較大。3%的接種量較之2%的接種量，酶活明顯提升，而5%和3%的接種量酶活基本持平，因此，選取3%的接種量為最佳接種量。

圖5 不同接種量對淀粉酶活的影響Fig.5 The effect of different inoculum size on amylase activity

2.1.6 不同初始pH對Bacilluskoreensis表達淀粉酶的影響

pH 值是衡量培養(yǎng)基酸堿度的一個重要指標，發(fā)酵過程中主要影響微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用以及代謝產(chǎn)物的分泌，從而影響酶活力，每一種微生物都有其生長發(fā)酵的適宜 pH 范圍。由圖6可知，pH 值從5.0到8.0酶活隨 pH 的增加而增加。pH 為 8.0 時，酶活達到最大值，繼續(xù)增加 pH 值，酶活迅速降低。從總的變化趨勢來看，中性偏堿性環(huán)境有利于菌株產(chǎn)酶。因此，確定8.0為菌株產(chǎn)酶最佳初始 pH 值。

圖6 不同初始pH對淀粉酶活的影響Fig.6 The effect of different initial pH on amylase activity

2.1.7 不同培養(yǎng)溫度對Bacilluskoreensis表達淀粉酶的影響

不同溫度產(chǎn)酶發(fā)酵結(jié)果表明，溫度對產(chǎn)酶影響很大，溫度過低，微生物代謝緩慢，隨著溫度升高，代謝加快，由圖7可以看出37 ℃時酶活最高，之后隨著溫度的升高，酶活反而降低。因此，確定 37 ℃為產(chǎn)酶最適培養(yǎng)溫度。

圖7 不同溫度對淀粉酶活的影響Fig.7 The effect of different temperature on amylase activity

2.2 Plackett-Burman設計

通過單因素試驗表明，在Bacilluskoreensis產(chǎn)酶過程中，對其影響較大的8個變量為淀粉含量、蛋白胨含量、酵母粉含量、CaCl2含量、FeSO4·7H2O含量、NaCl含量、接種量和初始pH，再加上3個虛擬變量，每個變量有高(+)、低(-)2個水平[11]，采用Design-Expert軟件設計試驗，共12組試驗(表4)。使用Design-Expert軟件對表4進行分析，得到 PB設計方差分析結(jié)果。由表5可知，該模型的P值 =0.009 4，表明該模型顯著(P<0.05)。上述8個因素對淀粉酶活的影響排序為其中淀粉含量>蛋白胨含量>CaCl2含量>NaCl含量>接種量>初始pH>酵母粉含量>FeSO4·7H2O含量，且淀粉含量、蛋白胨含量和CaCl2含量為顯著因素。

表4 PB設計實驗結(jié)果

注：X1：淀粉含量；X2：蛋白胨含量；X3：虛擬因素1；X4：虛擬因素2；X5：酵母粉含量；X6：虛擬因素3；X7：CaCl2含量；X8：FeSO4·7H2O含量；X9：NaCl含量；X10：接種量；X11：初始pH。

Note:X1:starch;X2:peptone;X3:the virtual factors 1;X4:the virtual factors 2;X5:yeast extract;X6:the virtual factors 3;X7:CaCl2;X8:FeSO4·7H2O;X9:NaCl content;X10:inoculum size;X11:initial pH.

表5 PB設計各因數(shù)效應分析

注：*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)，下同。

Note:*means significant difference atP<0.05,**means extremely significant difference atP<0.01,the same as below.

由上述 Plackett-Burman 試驗得到的回歸方程為：

淀粉酶活=261.03+15.58A+12.41B-0.13E+128.74G+1.33H+1.81J+3.95K-3.59L

其中A為淀粉含量，B為蛋白胨含量，E為酵母粉含量，G為CaCl2含量，H為FeSO4·7H2O含量，J為NaCl含量，K為接種量，L為初始pH。方程擬合的相關性為R2=98.71%，表明此多項式方程很好地模擬和解釋了 Plackett-Burman 的試驗結(jié)果。

2.3 最陡爬坡試驗

最陡爬坡法可以確定主要影響因素的水平，以其試驗值變化的梯度方向為爬坡方向，根據(jù)各因素效應值的大小確定變化步長，能快速、經(jīng)濟地逼近最佳值區(qū)域[12]。最陡爬坡試驗結(jié)果見表6。由表6可知，淀粉含量為16 g/L，蛋白胨含量為22 g/L，CaCl2含量為0.6 g/L時，實驗組合4的響應值(淀粉酶活)達到最高，此后淀粉酶活開始降低，這說明適當增加培養(yǎng)基中碳源、氮源以及金屬離子的含量有助于菌體的產(chǎn)酶，但過多的添加反而造成不利影響，因此選擇適宜的添加量尤為重要。選取實驗號4試驗組合中各種因素水平作為后續(xù)Box-Behnken試驗設計的中間點。

表6 最陡爬坡試驗設計及結(jié)果

2.4 Box-Behnken中心組合設計

響應面法可通過較少的試驗，較短的周期在整個區(qū)域內(nèi)給出因素與響應值之間的明確函數(shù)關系，且精度更高，同時能夠研究幾種因素間的交互作用。根據(jù)最陡爬坡試驗篩選出的試驗中心點，采用Box-Behnken試驗設計，利用Design Expert 10軟件進行3因素3水平的響應面分析試驗，試驗設計及結(jié)果見表7。建立以淀粉酶活為目標函數(shù)的二次回歸方程，并對所得到的回歸方程進行方差分析與顯著性檢驗，結(jié)果見表6。使用Design-Expert軟件進行分析，得到一個3元2次方程：

Y=-1 509.26+96.41A+83.43B+2 577.94C-0.38AB-28.58AC-3.68BC-1.96A2-1.73B2-1 885.86C2

方程中，A為淀粉含量，B為蛋白胨含量，C為CaCl2含量。方程中正號表示協(xié)同效應，而負號表示拮抗效應[13,14]。該方程的R2=0.916 3，表明模型能解釋91.63%淀粉酶產(chǎn)量的變化，回歸擬合程度較好。模型的ANOVA結(jié)果見表8。其中模型的P>F值=0.000 3，說明該模型是一個顯著并十分有效的模型。從ANOVA還可以看出淀粉和CaCl2在模型中是影響最為顯著的因素。

表7 BBD響應面設計及結(jié)果

表8 響應面二次方程模型的ANOVA值

圖8分別表示了淀粉含量和蛋白胨含量、淀粉含量和CaCl2含量、蛋白胨含量和CaCl2含量的等高線圖和3D圖，各培養(yǎng)基成分的含量對應的響應值都是隨著培養(yǎng)基成分的含量的提高先升高后降低。根據(jù)上述分析和軟件的預測，Bacilluskoreensis的最優(yōu)培養(yǎng)基組合為淀粉含量18.74 g/L，蛋白胨含量21.56 g/L，CaCl2含量0.52 g/L，預測的最高酶活為964.31 U/mL。為驗證模型預測的可靠性，用預測的最優(yōu)培養(yǎng)基條件下進行3次平行試驗，得出酶活的實際平均值為959.39±22.34，與響應面擬合所得的方程預測值符合良好，說明該模型可以很好的模擬Bacilluskoreensis的產(chǎn)酶效率。

3 結(jié)論

生物酶法降解淀粉因為條件溫和、易于操作、改善效果明顯，在實際應用中具有一定優(yōu)勢，可將淀粉分解成低聚糖、半乳糖醛酸、還原糖等，減少煙草原料的刺激性和雜氣，改善吸食品質(zhì)，提高其在煙草行業(yè)中的使用價值[15]。生物酶法所使用的酶主要有商品酶和菌株發(fā)酵提取的酶，產(chǎn)淀粉菌株主要有解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、米根霉等[16]，這些高效的菌株大多不是從煙葉表面分離得到。本研究從全國多個產(chǎn)地片煙篩選得到的Bacilluskoreensis來源于煙葉表面，與煙草的煙香能較好的契合，對可溶性淀粉、直鏈淀粉、支鏈淀粉都有較強的降解能力，能有效協(xié)調(diào)煙草的化學成分、減少刺激、增加煙香，有很廣泛的應用前景。

本研究通過單因素試驗、PB設計、最陡爬坡試驗和BBD響應面設計對Bacilluskoreensis的培養(yǎng)基進行了系統(tǒng)的優(yōu)化。BBD響應面設計較之傳統(tǒng)的線性回歸和正交試驗有周期短、試驗次數(shù)少、精度高等優(yōu)勢，因此在微生物發(fā)酵中得到廣泛的應用[17]。該方法先通過PB設計選出影響酶活的最顯著因素為淀粉、蛋白胨和CaCl2，再通過最陡爬坡設計試驗逼近響應面的中心點，最后通過BBD響應面設計得出最優(yōu)的培養(yǎng)基配方。驗證試驗得出酶活的實際平均值為959.39±22.34 U/mL，較之初始酶活提高了69.67%，大幅度提高了淀粉酶活和片煙處理效率，為進一步微生物酶制劑的工業(yè)化應用提供了材料基礎。故下一步研究將在本研究的基礎上，研究Bacilluskoreensis的發(fā)酵罐條件(溶氧、轉(zhuǎn)速、pH調(diào)節(jié)等)和該淀粉酶的酶學性質(zhì)、分子量等，并通過硅藻土過濾、膜過濾等方法進一步精制酶液。本研究開發(fā)的酶制劑天然高效、感官評吸配伍性強，為卷煙生產(chǎn)企業(yè)提高上部葉的可用性和提高煙草品質(zhì)提供一條新的方向并奠定了良好的基礎。