煙草泛素激活酶E1蛋白序列的分析

楊繼祥 楊昭明 楊志孝

摘要 采用SMART、TargetP和MrBayes工具對煙草泛素激活酶E1成員的結構域、亞細胞定位和進化樹進行分析。結果顯示，NtUAE1、NtUAE2和NtUAE3均含有E1_FCCH、E1_4HB、UBA_e1_thiolCys、UBA_e1_C和ThiF結構域，且NtUAE2和NtUAE3含有信號肽；泛素激活酶E1各成員均定位于細胞質中發揮作用，其可靠性級別為1；煙草泛素激活酶E1的進化程度與葡萄、辣椒存在一定的差異。

關鍵詞 煙草；泛素激活酶E1；蛋白序列

中圖分類號 S188 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）09-0103-02

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.09.030

Abstract SMART，TargetP and MrBayes tools were used to analyze the domain，subcellular localization and phylogenetic tree of tobacco ubiquitinactivating enzyme E1 members.The results showed that NtUAE1，NtUAE2 and NtUAE3 all contained E1_FCCH，E1_4HB，UBA_e1_thiolCys，UBA_e1_C and ThiF domains，and NtUAE2 and NtUAE3 contained signal peptides；all members of ubiquitinactivating enzyme E1 were localized in the cytoplasm and their reliability level was 1；the evolution of tobacco ubiquitinactivating enzyme E1 was somewhat different from that of grapes and peppers.

Key words Tobacco；Ubiquitinactivating enzyme E1；Protein sequence

煙草屬于自花授粉植物，而泛素激活酶E1對于煙草自花授粉過程具有一定的影響[1-2]，因泛素激活酶E1被高能活化后，促使羧基末端Glyof泛素和Cys殘基形成硫酯鍵[3]，然后與相應的蛋白結合，被26S蛋白酶體讀取，并將其降解[4-6]，進而影響花粉的萌發、生長以及變形[7]，此外，泛素激活酶E1可以指導其自身的ATP依賴性而與遍在蛋白形成硫醇酯鍵[8]，進而發揮作用。關于泛素激活酶E1已在酵母和小麥中進行了研究[9-10]，為此，筆者對煙草泛素激活酶E1蛋白序列進行研究，以期對煙草泛素激活酶E1進行了解。

1 材料與方法

1.1 煙草泛素激活酶E1蛋白序列的獲取

利用NCBI[11-12]數據庫，提取草煙泛素激活酶E1的蛋白序列，登錄號依次為NP_001312347、NP_001312902和CAA71762，并分別對其進行命名NtUAE1、NtUAE2和NtUAE3[13]。

1.2 方法 運用SMART、TargetP和MrBayes分析工具[14-16]，對煙草泛素激活酶E1的蛋白序列進行結構域、亞細胞定位和進化樹分析。

2 結果與分析

2.1 煙草泛素激活酶E1蛋白序列的結構域

通過對煙草泛素激活酶E1蛋白序列進行結構分析，結果見表1。由表1可知，NtUAE1、NtUAE2和NtUAE3均被檢測到具有E1_FCCH、E1_4HB、UBA_e1_thiolCys、UBA_e1_C和ThiF，且NtUAE2和NtUAE3序列被檢測到一組信號肽，而NtUAE1未被檢測到。通過分析各成員的序列，NtUAE1的E1_FCCH（4.4e-32）位于序列的第252～323位氨基酸的位置，E1_4HB（2.3e-25）位于序列的第324～393位氨基酸的位置，UBA_e1_thiolCys（6.4e-85）位于序列的第662～915位氨基酸的位置，UBA_e1_C（6.77e-49）位于序列的第953～1075位氨基酸的位置，ThiF（4.1e-33）位于序列的第78～465位氨基酸的位置；NtUAE2和NtUAE3的結構所處的位置均與NtUAE1相同，但E期望值有所不同，分別為E1_FCCH（6.1e-32，1.5e-31）、E1_4HB（2.3e-25，4e-25）、UBA_e1_thiolCys（4.8e-85，1.3e-84）UBA_e1_C（6.77e-49，6.77e-49）、ThiF（6.8e-32，1.1e-18），此外，NtUAE2和NtUAE3信號肽所處的位置均為位于序列的第23～33位氨基酸。E1_FCCH為泛素激活酶E1的FCCH結構域（PF16190），E1_4HB為泛素激活酶E1的四螺旋束結構域（PF16191），UBA_e1_thiolCys為泛素激活酶的催化半胱氨酸結構域（PF10585），UBA_e1_C為遍在蛋白激活酶E1 C端結構域（PF09358），ThiF為THIF型/FAD結合折疊（PF00899）。

2.2 煙草泛素激活酶E1蛋白序列的亞細胞定位

亞細胞定位分析，有利于了解煙草泛素激活酶E1在特定細胞器中發揮作用，為此對煙草泛素激活酶E1進行亞細胞定位，結果見表2。由表2可知，NtUAE1、NtUAE2和NtUAE3均含有信號肽的信號，分別為0.097、0.099和0.100，信號較弱，定位結果顯示NtUAE1于線粒體和葉綠體中發揮作用的可能性較小，其可靠性級別達最大值（1），為進一步分析NtUAE1亞細胞位置，運用PSORT分析，其中位于細胞質的值為7，葉綠體的值為3，細胞核的值為3，因此推斷NtUAE1于細胞質內執行功能；NtUAE2定位結果顯示位于線粒體和葉綠體的概率值均小于位于其他位置，進一步分析顯示，位于細胞質的值為9，葉綠體的值為2，細胞核的值為2，因此NtUAE2可能定位于細胞質中；NtUAE3的定位結果與NtUAE2相同。

2.3 煙草泛素激活酶E1的進化樹分析

將煙草泛素激活酶E1各成員分別與碭山梨成員（XP_009376402、XP_009337737和XP_009369576）、葡萄成員（XP_010653400、CBI18124和CBI15908）、辣椒成員（XP_016576007、PHT63563和PHT61464） 進行序列比對，并進行聚類分析，結果見圖1。

由圖1可知，泛素激活酶E1在不同物種中，經過一段時間的進化，各成員的功能性和相似性出現一定的分化，進化樹顯示全體成員被劃分為兩類，VvUAE1、VvUAE2、PbUAE1、PbUAE2、NtUAE1、NtUAE2和NtUAE3為一類，而VvUAE3、PbUAE3、CaUAE1、CaUAE2和CaUAE3為另一類，在其中VvUAE和PbUAE在兩類中均含有其成員，而煙草泛素激活酶E1與碭山梨泛素激活酶E1進化程度較為相似。盡管煙草和辣椒屬于同一個科，即茄科，但聚類結果不屬于同一類，辣椒與葡萄的進化程度較為相近，煙草泛素激活酶E1成員之間的聚類結果較為穩定，為100。

3 結論與討論

通過分析煙草泛素激活酶E1各成員的結構域，NtUAE1、NtUAE2和NtUAE3均含有5個結構域，分別為泛素激活酶E1的FCCH結構域，泛素激活酶E1的四螺旋束結構域，泛素激活酶的催化半胱氨酸結構域，遍在蛋白激活酶E1的C端結構域和THIF型/FAD結合折疊，表明煙草泛素激活酶E1的功能多樣性[17]，此外，NtUAE2和NtUAE3具有信號肽，表明煙草泛素激活酶E1成員之間存在一定差異[18]；經過對NtUAE1、NtUAE2和NtUAE3的初級亞細胞定位和再次定位，均定位于細胞質中，表明煙草泛素激活酶E1主要在細胞質中發揮作用[19]；碭山梨、葡萄、辣椒和煙草的泛素激活酶E1各成員被歸為兩類，且在每類中產生多個分支，表明泛素激活酶E1在進化過程中產生差異[20]，且煙草和葡萄的進化程度較為相似。

參考文獻

[1]MIAO H X，QIN Y H，YE Z X，et al.Molecular characterization and expression analysis of ubiquitinactivating enzyme E1 gene in Citrus reticulata[J].Gene，2013，513（2）：249-259.

[2] LEYSER H M O，LINCOLN C A，TIMPTE C，et al.Arabidopsis auxinresistance gene AXR1 encodes a protein related to ubiquitinactivating enzyme E1[J].Nature （London），1993，364（6433）：161-164.

[3] VIERSTRA R D.The ubiquitin26S proteasome system at the nexus of plant biology[J].Nat Rev Mol Cell Biol，2009，10（6）：385-397.

[4] PARK H J，PARK H C，LEE S Y，et al.Ubiquitin and ubiquitinlike modifiers in plants[J].Journal of plant biology，2011，54（5）：275.

[5] SMALLE J，VIERSTRA R D.The ubiquitin 26S proteasome proteolytic pathway[J].Annual review of plant biology，2004，55（1）：555-590.

[6] HELLMANN H，ESTELLE M.Plant development： Regulation by protein degradation[J].Science，2002，297（5582）：793-797.

[7] SHANG F，NOWELL T R，J R，TAYLOR A.Removal of oxidatively damaged proteins from lens cells by the ubiquitinproteasome pathway[J].Experimental eye research，2001，73（2）：229-238.

[8] HATFIELD P M，VIERSTRA R D.Multiple forms of ubiquitinactivating enzyme E1 from wheat.Identification of an essential cysteine by in vitro mutagenesis[J].Journal of biological chemistry，1992，267（21）：14799-14803.

[9] JENTSCH S，MCGRATH J P，VARSHAVSKY A.The yeast DNA repair gene RAD6 encodes a ubiquitinconjugating enzyme[J].Nature，1987，329（6135）：131-134.

[10] HATFIELD P M，VIERSTRA R D.Ubiquitindependent proteolytic pathway in wheat germ： isolation of multiple forms of ubiquitinactivating enzyme，E1[J].Biochemistry，1989，28（2）：735-742.

[11] IRIE H，HONDA H，KUROIWA T，et al.Pitfalls in MR cholangiopancreatographic interpretation[J].Radiographics，2016，21（1）：23-37.

[12] INZUCCHI S E，BERGENSTAL R M，BUSE J B，et al.Management of hyperglycaemia in type 2 diabetes，2015：A patientcentred approach.Update to a position statement of the American Diabetes Association and the European Association for the Study of Diabetes[J].Diabetes Care，2012，58（3）：429-442.

[13] 陳二龍，范志勇，王松峰，等.煙草Hsp70基因家族的鑒定及NtHsp70Chl基因的表達分析[J].中國煙草科學，2018，39（2）：8-16.

[14] MCKEE S，PERROTT R，DONACHY P，et al.GeneGrid： From "virtual" bioinformatics laboratory to "Smart" bioinformatics laboratory[C]//19th IEEE International Symposium on Computerbased Medical Systems（CBMS'06）.Salt Lake City，UT，USA：IEEE，2006.

[15] BONNET E，HE Y，BILLIAU K，et al.TAPIR，a web server for the prediction of plant microRNA targets，including target mimics[J].Bioinformatics，2010，26（12）：1566-1568.

[16] MISHRA B，THINES M.siMBa—a simple graphical user interface for the Bayesian phylogenetic inference program MrBayes[J].Mycological progress，2014，13（4）：1255-1258.

[17] 張紹進.泛素激活酶Ubal對細胞自噬的調節機理研究[D].武漢：華中農業大學，2012.

[18] 李廣起.龍須菜泛素激活酶和泛素結合酶基因克隆及熱激下表達模式分析[D].青島：中國海洋大學，2012.

[19] STEPHEN A G，TRAUSCHAZAR J S，HANDLEYGEARHART P M，et al.Identification of a region within the ubiquitinactivating enzyme required for nuclear targeting and phosphorylation[J].Journal of biological chemistry，1997，272（16）：10895-10903.

[20] 徐珍珍，倪萬潮，張香桂，等.棉花YABBY基因家族的全基因組分析[J].生物技術通報，2015，31（11）：146-152.